Method Article

Prozessbewertung und Kinetik der rekombinanten Chitin-Deacetylase-Expression in E. coli Rosetta pLysS-Zellen unter Verwendung einer statistischen Technik

DOI:

10.3791/64590

⸱

March 10th, 2023

 ,  , 
1Department of Biotechnology, Manipal Institute of Technology, Manipal Academy of Higher Education (MAHE)

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Im aktuellen Protokoll wurde eine statistische Technik, das Central Composite Design (CCD), angewendet, um die Prozessbedingungen für die Expression von rekombinanter bakterieller Chitin-Deacetylase (BaCDA) in E. coli Rosetta pLysS-Zellen zu optimieren. Der Einsatz von CCD führte zu einer ~2,39-fachen Steigerung der Expression und Aktivität von BaCDA.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In den letzten Jahren hat der umweltfreundlichere Weg der Deacetylierung von Chitin zu Chitosan mit Hilfe des Enzyms Chitin-Deacetylase an Bedeutung gewonnen. Enzymatisch umgesetztes Chitosan mit emulatorischen Eigenschaften hat ein breites Anwendungsspektrum, insbesondere im biomedizinischen Bereich. Es wurden mehrere rekombinante Chitin-Deacetylasen aus verschiedenen Umweltquellen berichtet, aber es gibt keine Studien zur Prozessoptimierung für die Herstellung dieser rekombinanten Chitin-Deacetylasen. In der vorliegenden Studie wurde das zentrale Kompositdesign der Response-Oberflächen-Methodik verwendet, um die Produktion der rekombinanten bakteriellen Chitin-Deacetylase (BaCDA) in E. coli Rosetta pLysS zu maximieren. Die optimierten Prozessbedingungen waren 0,061 % Glukosekonzentration, 1 % Laktosekonzentration, eine Inkubationstemperatur von 22 °C, eine Rührgeschwindigkeit bei 128 U/min und 30 Stunden Fermentation. Unter optimierten Bedingungen wurde die Expression aufgrund der Laktoseinduktion nach 16 h Fermentation eingeleitet. Die maximale Expression, Biomasse und Ba-CDA-Aktivitätwurden 14 h nach der Induktion aufgezeichnet. Unter der optimierten Bedingung war die Ba-CDA-Aktivität der exprimierten Ba-CDAum das ~2,39-fache erhöht. Durch die Prozessoptimierung wurde der gesamte Fermentationszyklus um 22 h und die Expressionszeit um 10 h nach der Induktion reduziert. Dies ist die erste Studie, die über die Prozessoptimierung der rekombinanten Chitin-Deacetylase-Expression unter Verwendung eines zentralen Kompositdesigns und seiner kinetischen Profilierung berichtet. Die Anpassung dieser optimalen Wachstumsbedingungen könnte zu einer kostengünstigen, großtechnischen Produktion der weniger erforschten Moneran-Deacetylase führen und damit einen umweltfreundlicheren Weg für die Produktion von biomedizinischem Chitosan einschlagen.

Introduction

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Chitin, ein strukturelles β, 1-4 glykosidisch gebundenes natürliches Polymer, ist nach Cellulose das zweithäufigste Polysaccharid in der Natur. Trotzdem hat Chitin aufgrund seiner Unlöslichkeit nur begrenzte industrielle Anwendungen1. Dieser Engpass wird behoben, indem Chitin einer N-Deacetylierung unterzogen wird, die eine positive Ladung verleiht und die Löslichkeit des resultierenden Polymers Chitosan1 erhöht. Chitin kann auf zwei verschiedenen Wegen zu Chitosan modifiziert werden: chemisch und enzymatisch. Die biomedizinische Anwendung von Chitosan erfordert eine kontrollierte und definierte Deacetylierung, die auf chemische Wege beschränkt ist 2,3. Diese Einschränkung kann mit Chitin-Deacetylasen (CDAs) behoben werden, einem grünen enzymatischen Ansatz für den Deacetylierungsprozess 4,5.

Chitin-Deacetylase gehört zur Familie der Kohlenhydratesterase 4 (CE-4), die in der Datenbank für kohlenhydrataktive Enzyme (CAZY) definiert ist. Die Enzyme der CE-4-Familie teilen sich die NodB-Homologie oder Polysaccharid-Deacetylase-Domäne als konservierte Region. Das Central Composite Design (CCD), ein statistisches Werkzeug, wird zur Optimierung mehrerer Wildtyp-Chitin-modifizierender Enzymeverwendet 6,7,8,9. Die nachgelagerten Schritte bei der Verwendung von Wildtyp-Organismen werden jedoch mühsam, daher die Verschiebung hin zu rekombinanten Enzymen 10,11,12,13,14,15,16,17. In den letzten Jahren haben halophile rekombinante CDA aus marinen Quellen aufgrund ihrer Leichtigkeit bei der industriellen Anwendung und Herstellung von biomedizinischem Chitosan an Bedeutung gewonnen18,19.

Die rekombinante Enzymproduktion in E. coli hat eine Einschränkung des Prozesses, und eine Medienoptimierung ist erforderlich, da ihre Expression in E. coli je nach verwendetem Gen und Plasmid variiert20. Daher wird das Screening eines geeigneten Prozesses und geeigneter Nährstoffparameter wichtig. One Factor at a Time (OFAT), die häufig verwendete Optimierungsmethode, erfordert enorme Ressourcen und Zeit, um Schritt-für-Schritt-Experimente durchzuführen. Diese Methode leidet unter einem Mangel an statistischen Informationen über die Wechselwirkung zwischen den Parametern 20,21,22,23. Daher wurde die CCD der Response-Surface-Methodik (RSM) verwendet, um die Expressionsausbeute der halophilen bakteriellen Chitindeacetylase (BaCDA) und die Ba-CDA-Aktivitätin E. coli Rosetta pLysS zu untersuchen. Die Parameter, die für die Expressionsoptimierung im E. coli-Wirt berücksichtigt wurden, waren die Laktosekonzentration, die Glukosekonzentration, die Inkubationstemperatur, die Agitationsrate und die Inkubationszeit. In den meisten E. coli-Expressionsstudien wurde Luria Bertani (LB) Medium mit Isopropyl β-d-1-thiogalactopyranosid (IPTG) als Induktor verwendet. Diese Zugabe von IPTG erforderte eine regelmäßige Wachstumsüberwachung24. Diese wiederkehrenden Mediationen während des Fermentationsprozesses eröffnen auch Wege für Kontaminationen. Daher sind die Forschungsgruppen zu hervorragender Brühe (TB) mit Laktose als Induktor übergegangen. Die Aufnahme von Laktose in die Medien anstelle von IPTG trägt diesem Problem Rechnung; E. coli verbraucht diese Laktose und produziert als Nebenprodukt Allo-Laktose, was zu einem Autoinduktionszustand führt. Zu diesem Autoinduktormedium gehört Glycerin, das eine verbesserte Ausbeute an rekombinantem Protein25 gezeigt hat.  Diese Überexpression rekombinanter Proteine in TB-Medien konnte durch die Optimierung der Prozessparameter weiter verbessert werden. In der vorliegenden Studie wurde ein zentrales Kompositdesign angewendet, um die heterologe Expression von halophilen BaCDA in E. coli Rosetta pLysS-Zellen zu optimieren. Die gewählten Prozessparameter waren Inkubationstemperatur, Rührgeschwindigkeit und Inkubationszeit, und die bewerteten Nährstoffparameter waren Glukose- und Laktosekonzentration. Die halophile Ba-CDA-Expression wurde mit der vorhergesagten optimierten Bedingung evaluiert und mittels SDS-PAGE kreuzvalidiert.

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Protocol

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1. Ausdrucksmedien und Kulturbedingungen

  1. Transformieren Sie den pET-22b-Vektor, der das Ba-CDA-Gen enthält, in E. coli Rosetta pLysS-kompetente Zellen unter Verwendung der Hitzeschockmethode, wie in15 beschrieben.
    HINWEIS: Bei der Arbeit mit Mikroorganismen ist Vorsicht geboten. Alle mikrobiologischen Arbeiten müssen in einer Haube einer Biosicherheitswerkbank durchgeführt werden, um eine Kontamination zu vermeiden.
  2. Die vorläufige Expressionsstudie in TB-Medien mit 0,05 % (w/v) Glucose und 0,2 % (w/v) Lactose bei 16 °C und 180 U/min durchführen. Züchten Sie 6.792 x 107E. coli Rosetta pLysS-Zellen in 100 ml Medien, die Ba-CDA-kloniertes Plasmid enthalten, bis es die stationäre Phase erreicht. Unter den genannten Wachstumsbedingungen erreichen die E. coli Rosetta pLysS-Zellen eine optische Dichte 600 (OD600) von 10,85 ± 0,21. 
    HINWEIS: Zusammensetzung des TB-Mediums (% w/v): Trypton, 1,2; Hefe-Extrakt, 2.4; Glycerin, 0,6; und 1x TB Salz (17 mM KH2PO4 und 74 mM K2HPO4)17.

2. Optimierung und Versuchsplanung

  1. Entwerfen Sie die Experimente und passen Sie das Polynommodell zweiter Ordnung im zentralen Kompositdesign mit der Software für statistische Tools an. Bei der in der vorliegenden Studie verwendeten Statistiksoftware handelte es sich um MINITAB 17.0 (Testversion).
    1. Öffnen Sie dazu die Software und klicken Sie auf die folgenden Schaltflächen: Stat > DoE > Response surface > Create response surface > Response design > Central composite. Die Ausgabe wird als Dialogfeld angezeigt.
  2. Geben Sie die fünf Parameter Inkubationstemperatur, Rührgeschwindigkeit, Inkubationszeit, Glukosekonzentration und Laktosekonzentration in fünf Stufen (-2, -1, 0, +1, +2) in das Dialogfeld ein.
    1. Geben Sie dazu die Parameter mit den Pegeln in das Dialogfeld ein, geben Sie die Details aller Parameter ein und drücken Sie OK. Dadurch wird die experimentelle Designmatrix mit sechs Replikaten am Mittelpunkt generiert, was 32 experimentelle Durchläufe erfordert. Die Software generiert eine Tabelle mit den Parametern und deren Pegeln in codierten und uncodierten Begriffen, die bei der Prozessoptimierung mit CCD verwendet werden (Tabelle 1).
  3. Führen Sie die 32 Experimente mit den softwaregenerierten Bedingungen durch. Geben Sie die experimentellen Ergebnisse in die (von der Software generierte) Versuchsplanungsmatrix ein, die Pegel und Parameter in codierten und uncodierten Einheiten enthält (Tabelle 2).
  4. Analysieren Sie die experimentelle Designmatrix (Tabelle 2) mit der Software. Öffnen Sie dazu die Software und speisen Sie die Antwort in das Datenblatt ein. Wählen Sie die Spalte Antwortvariablen > Statistik > DoE > Antwortfläche aus, > Analyse des Versuchs der Antwortflächenkonstruktion > OK. Die Ausgabe wird auf statistische Signifikanz analysiert, und ein Modell wird von der Software vorhergesagt.

Tabelle 1: Die Parameter und ihre Konzentrationen in kodierten und unkodierten Begriffen, die im Versuchsdesign verwendet wurden, um die Expression von rekombinanter Chitin-Deacetylase in E. coli Rosetta pLysS-Zellen abzuschätzen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Tabelle 2: Experimentelle Designmatrix mit experimenteller und vorhergesagter Ba-CDA-Aktivität(Expression) der rekombinanten Chitin-Deacetylase in E. coli Rosetta pLysS-Zellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

3. Validierung des Modells

  1. Validieren Sie das entworfene Modell mit dem in der Software verfügbaren Antwortoptimierungstool.
  2. Wiederholen Sie die Fermentation unter softwarevorhergesagten optimalen Bedingungen und vergleichen Sie den Versuchswert mit dem von der Software vorhergesagten Wert.
    1. Öffnen Sie dazu die Software und wählen Sie die Spalte Antwort > Stat > DoE > Response-Oberfläche > Response-Optimierer > Maximize > OK aus. Das Ergebnis sind optimale Prozessbedingungen und Werte, die von der Software vorhergesagt werden. Wiederholen Sie die Gärung unter den vorhergesagten optimalen Bedingungen und vergleichen Sie die Werte.

4. Analytische Methoden

  1. Expression, Biomasse und Proteinquantifizierung
    1. Führen Sie die Fermentation unter 32 Bedingungen durch, die von der Software in der experimentellen Designmatrix angegeben sind (Tabelle 2). Das Pellet erhalten Sie nach jedem Durchlauf, indem Sie die Kultur bei 5.405 x g für 10 Minuten bei 4 °C zentrifugieren. Wiegen Sie das Zellpellet, um die Biomasseausbeute zu bestimmen.
      HINWEIS: Die gesamte mikrobielle Handhabung sollte unter aseptischen Bedingungen (d. h. in Biosicherheitswerkbänken) erfolgen.
    2. Lysieren Sie das Zellpellet, um periplasmatisches Protein durch Ultraschall zu erhalten. Geben Sie 5 ml Lysepuffer (50 mM Tris-HCl, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol) zu jedem Gramm Zellpellet und zerstören Sie durch Beschallung für 10 Zyklen mit einem Impuls von 10 s an und 10 s aus bei 60 % Amplitude. Das Lysat wird durch Zentrifugieren bei 5.405 x g für 10 min bei 4 °C aufgefangen. Quantifizieren Sie die Proteinkonzentration mit dem Bradford-Assay26.
      HINWEIS: Um eine Denaturierung des Proteins zu vermeiden, muss die Beschallung unter kalten Bedingungen erfolgen. Legen Sie die Proben auf Eis, während Sie die Beschallung durchführen.
    3. Analysieren Sie den BaCDA-Ausdruck mit SDS-PAGE, gefolgt von der ImageJ-Software. Laden Sie 10 μl lösliches Zelllysat (periplasmatisches Protein) auf 12 % Bis-Acrylamid-Gel und lassen Sie es unter 1x Tris-Glycin-SDS (TGS)-Puffer bei einem Strom von 100 V für 2 h laufen. Nachdem der Lauf abgeschlossen ist, färben Sie das Gel mit Coomassie-Blau und entfernen Sie den Fleck, um den Hintergrund27 zu entfernen.
    4. Erfassen Sie ein Bild mit einer Gel-Dokumentationseinheit. Bestimmen Sie den Ba-CDA-Ausdruck, indem Sie die Bandenintensität in Form der Pixelwerte mit der ImageJ-Software vergleichen. Betrachten Sie den Versuchslauf mit der geringsten Ba-CDA-Aktivitätund Biomasse als Referenzpixel 28.
      1. Öffnen Sie dazu die Software und öffnen Sie die Bilddatei, dann wählen Sie jede Bahn mit dem rechteckigen Feld aus. Gehen Sie zu Analysieren und stellen Sie jede Lane auf 100 % ein, und wählen Sie dann das überexprimierte Band in jeder Lane mit dem rechteckigen Feld aus. Wechseln Sie zu Analysieren und bestimmen Sie die Intensität des Bandes, wiederholen Sie den Vorgang in jeder Spur, und exportieren Sie das Ergebnis als .xls Datei. Betrachten Sie die Bandenintensität des experimentellen Laufs mit der niedrigsten Ba-CDA-Aktivität als Referenzintensität und analysieren Sie die Ausprägung jeder Spur.
  2. Enzymaktivitäts-Assay
    1. Bestimmung der Ba-CDA-Aktivitätmit einem Acetat-Assay-Kit15 unter Verwendung von Ethylenglykol-Chitin (1 mg/ml; EGC) als Substrat29.
    2. Lassen Sie 20 μl BaCDA mit 40 μl des Substrats in Gegenwart von 40 μl 50 mM Tris-HCl (pH 7)-Puffer 1 h bei 30 °C reagieren, indem Sie bei 800 U/min rühren.
    3. Nach 1 h zentrifugieren Sie den 100 μL Reaktanten 15 min lang bei 4 °C durch eine 3 kDa-Säule bei 2.111 x g . Das Retentat aus BaCDA wird verworfen und das acetathaltige Filtrat, das während der Reaktion freigesetzt wird, aufgefangen. Verwenden Sie das Filtrat für den Acetat-Assay, um die Ba-CDA-Aktivitätzu bestimmen.
      HINWEIS: Eine Einheit des Enzyms ist definiert als die Aktivität, die 1 μM Acetat pro Mikroliter Enzym pro Minute aus dem Substrat freisetzt. Der Enzymaktivitätsassay wurde in dreifacher Ausführung durchgeführt und die jeweilige Enzymaktivität entsprechend berechnet.
  3. Fermentationskinetik der Laktoseinduktion
    1. Untersuchen Sie das Aktivitätsprofil, um den Punkt der Laktoseinduktion und den Startpunkt der Expression zu bestimmen. Die Erstellung des Aktivitätsprofils erfolgt durch Abschätzung der Biomasse- und Ba-CDA-Aktivität unter den optimierten Fermentationsbedingungen.
    2. Bestimmen Sie die Glukosekonzentration in den Medien mit einem Glukoseschätzungskit. Plotten Sie das Aktivitätsprofil anhand von Biomasse, Glukosekonzentration und Ba-CDA-Aktivität im Vergleich zur Fermentationszeit.

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Results

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Prozessoptimierung der Expression des periplasmatischen rekombinanten Enzyms Chitin-Deacetylase in E. coli mittels Central Composite Design (CCD)
Das pET22b-Ba CDA-Konstrukt ergab, wenn es unter nicht optimierten Bedingungen angebaut wurde, einen maximalen Biomasseertrag und eine Ba-CDA-Aktivitätvon 22,26 ± 0,98 g/L bzw. 84,67 ± 0,56 U/L 15. In der aktuellen Studie wurde ein statistischer Ansatz CCD verwendet, um die optimalen Prozessbedingungen für d...

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Discussion

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Deacetyliertes Chitin, Chitosan, hat viele Anwendungen, insbesondere im biomedizinischen Bereich30. Die Reproduzierbarkeit von Chitosan in Bezug auf seinen Acetylierungsgrad (DA) und sein Acetylierungsmuster (PA) ist jedoch neben anderen Umweltbedenken ein großes Problem. Der umweltfreundlichere Weg mit Hilfe von Enzymen wurde also genutzt. Das Array der CDAs kann verwendet werden, um Chitosan mit einem einzigartigen Deacetylierungsmuster herzustellen, was ihre biomedizinischen Anwendungen erweite...

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Disclosures

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Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken der Manipal Academy for Higher Education (MAHE) für den MAHE UNSW-Fonds, und die Autoren danken dem Council of Scientific & Industrial Research - Human Resource Development Group (CSIR-MHRD), Regierung von Indien, für ein Senior Research Fellowship, Verleihungsschreiben Nummer 09/1165(0007)2K19 EMR-I vom 31.3.2019.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
KitsAcetat-Assay-Kit
Megazyme, IrlandK-ACETAKDas Protokoll wurde leicht modifiziert und optimiert, um den Assay in einem 96-Well-Platten-Glukose-Schätzungskit
Agappe Diagnosis Ltd., Indien12018013Das Protokoll wurde leicht modifiziert und optimiert, um den Assay auf einer 96-Well-Platte durchzuführen
Chemicals
EssigsäureHi-media, IndienAS001Zur Herstellung von SDS-PAGE-Färbe- und Destaierungslösungen
AcrylamidHi-media, IndienMB068Wird zur Herstellung von SDS-PAGE-Gel
AmmoniumpursulfatHi-media, IndienMB003Wird zur Herstellung von SDS-PAGE-Gel
Bis-acrylamidHi-media verwendet, IndienMB005Zur Herstellung von SDS-PAGE-Gel
Coomassie briliiant blue G-250Hi-media, IndienMB092Zur Herstellung von SDS-PAGE-Färbe- und Destaierungslösung
Coomassie briliiant blue R-250Hi-media, IndienMB153Zur Herstellung des Bardford-Assays
Ethylenglykol-ChitosanSigma-aldrich, USAE1502Wird zur Herstellung von Ethylenglykol-Chitin und Ethylenglykol-Chitin verwendet und wird als Substrat für die enzymatische Reaktion
D-GlucoseHi-media verwendet, IndienMB037Wird als Medienkomponente verwendet.
Imidazol-Hi-Medien, IndienGRM1864Wird in Lysepuffern verwendet
, IndienGRM017Wird als Medienkomponente verwendet.
MethanolFinar, Indien30930LC250Zur Herstellung von SDS-PAGE-Färbe- und Destaierungslösung
Natriumchlorid (NaCl)Hi-Medien, IndienMB023Zur Herstellung von Lysepuffern
PhosphorsäureHi-Medien, IndienMB157Zur Herstellung von Bardford-Assay
Natriumdodecylsulfat (SDS)Hi-Medien, IndienGRM6218Zur Herstellung von SDS-PAGE-Gel
Natriumphosphat zweibasisches wasserfreiesHi-Medium, IndienMB024Wird zur Vorbereitung von TB-Sald für Medien und Puffer für enzymatische Reaktionen verwendet.
Natriumphosphat monobasisch wasserfreiesHi-Medium, IndienGRM3964Wird zur Vorbereitung von TB-Sald für Medien und Puffer für enzymatische Reaktionen verwendet.
Tetramethylethylendiamin (TEMED)Hi-media, IndienMB026Wird zur Herstellung von SDS-PAGE-Gel
verwendet Tris-baseHi-media, IndienMB029Wird zur Herstellung von SDS-PAGE-Gel
TryptonHi-media, IndienRM7707Wird als Medienkomponente verwendet.
HefeextraktHi-media, IndienRM027Wird als Medienkomponente verwendet.
Equipment
AlphaImager HP Gel-DokumentationseinheitProteinSimple, USA92-13823-00Zur Aufnahme von SDS-PAGE-Fotos
TischmixerEppendorf, Deutschland 9.776 660Zur Aufbewahrung für enzymatische Reaktionen mit 2 mL Adapter
Bioinkubator-SchüttlerTrishul Instruments, Indien13410622Zur Inkubation von Bakterienkulturen bei unterschiedlichen Temperaturen und RPM
BiospektralphotometerEppendorf, Deutschland 6135000009Zur Erfassung aller spektroskopischen Messwerte
KühlzentrifugeEppendorf, Deutschland 5805000017Zur Zentrifugation von Kulturen, Lysat und allen anderen Zentrifugationsprotokollen
TrockenbadLabnet International, USAS81522039Zur Denaturierung von Proteinproben für SDS-PAGE
MikropipettenEppendorf, Deutschland 3123000900Wird über das Protokoll für Volumenmessungen verwendet
Rocker-ShakerTrishul Instruments, Indien11770719Wird zum Schütteln von SDS-PAGE-Gel zum Färben und Entfärben von
SDS-PAGE-Gerätverwendet Bio-Rad, USA1658001FCWird zum Gießen und Betreiben von SDS-PAGE-Gel
verwendet UltrasonicatorSonics & Materials, Inc., USAVCX 130Wird zur Lyse der Bakterienzelle durch Ultraschall
WaageSartorius, DeutschlandBSA124 SWird zur Gewichtsmessung während des gesamten Protokolls
Devices
Nanosep Zentrifugalgeräte mit Omega-Membran (3 kDa)PALL life sciences, USAOD003C33Wird verwendet, um Enzyme nach Substrat zu trennen treatment
SoftwaresVersionentwickelt in
MINITAB17.0  (Testversion)  The Pennsylvania State UniversityWird verwendet, um das experimentelle Modell zu entwerfen und die Daten
zu analysieren ImageJ1.53oNational Institutes of Health (NIH)Wird verwendet, um das Expressionsniveau mit SDS-PAGE zu analysieren image
Plasmid
pET22b (+) DNA– NovagenMerck- Millipore, USA69744Gelagert bei − 20 ° C
Cells
E. coli Rosetta pLysS— NovagenMerck- Millipore, USA70956gewartet in Luria– Bertani (LB) Brühe mit 25 % Glycerin bei − 80°; C
durchzuführen Lactose-Hi-Medienverwendet verwendet verwendet

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