Methodenartikel

Neue methodische Perspektiven in der Erforschung der Biologie von Mücken

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DOI:

10.3791/64602

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11. August 2022

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1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, 2Department of Entomology & Nematology, Florida Medical Entomology Laboratory, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida

In diesem Artikel

Zusammenfassung

DISKUTIERTE ARTIKEL:

Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (159), e61375 (2020).

Carballar-Lejarazú, R., Pham, T. B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A. A. Laborversuche mit gentechnisch veränderten Anophelin-Mücken in kleinen Käfigen. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (171), e62588 (2021a).

Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T. B., James, A. A. Mikroinjektionsmethode für Anopheles gambiae-Embryonen . Zeitschrift für visualisierte Experimente. (173), e62591(2021b).

Chen, T. Y. et al. Ein auf Magnetbeads basierendes Mücken-DNA-Extraktionsprotokoll für die Sequenzierung der nächsten Generation. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (170), e62354 (2021).

Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Vermehrung des Mikrosporidienparasiten Edhazardia aedis in Aedes aegypti-Mücken . Zeitschrift für visualisierte Experimente. (162), e61574 (2020).

Jensen, B. M. et al. Bioassay für topische Anwendung zur Quantifizierung der Insektizidtoxizität für Mücken und Fruchtfliegen. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (179), e63391 (2022).

Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T. M., Duvall, L. B. Fütterung und Quantifizierung von tierischem Blut und künstlichen Mahlzeiten bei Aedes aegypti-Mücken . Zeitschrift für visualisierte Experimente. (164), e61835 (2020).

Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. P. V. Untersuchung der Aktivität von Neuropeptiden und anderen Regulatoren des Ausscheidungssystems in der erwachsenen Mücke. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (174), e61849 (2021).

Liu, X. et al. Ein bakterieller oraler Fütterungstest mit Antibiotika-behandelten Mücken. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (163), e61341 (2020).

Meuti, M. E., Harrell, R. Vorbereitung und Injektion von Embryonen von Culex-Mücken zur Erzeugung von Nullmutationen mit CRISPR/Cas9. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (163), e61651 (2020).

Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum Gametozytenkultur und Mückeninfektion durch künstliche Membranfütterung. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (161), e61426 (2020).

Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Verbesserter Fruchtbarkeits- und Fertilitätstest für Aedes aegypti unter Verwendung von 24-Well-Gewebekulturplatten (EAgaL-Platten). Zeitschrift für visualisierte Experimente. (171), e61232 (2021).

Wang, X. et al. Heterologe Expression und funktionelle Analyse von Geruchsrezeptoren von Aedes aegypti für menschliche Gerüche in Xenopus-Oozyten . Zeitschrift für visualisierte Experimente. (172), e61813 (2021).

Editorial

Von Stechmücken übertragene Krankheitserreger sind jedes Jahr für Millionen von Infektionen beim Menschen verantwortlich. Um Krankheiten zu bekämpfen, die durch diese Krankheitserreger verursacht werden, wie Malaria und Dengue 1,2,3, stärken Forscher das Verständnis der Mückenbiologie und entwickeln neuartige Instrumente zur Mückenbekämpfung 4,5,6. Diese Sammlung erleichtert neue Forschungen in diesen Bereichen durch methodische Fortschritte in den Bereichen Mückenbiologie, Mückenbekämpfung, Krankheitserregerinfektion und Mückentransgenese.

Jensen et al.7 beschreiben einen insektiziden Aktivitätsassay in Mücken und Fruchtfliegen, der eine direkte topische Anwendung von Insektiziden und ein Dosisbestimmungsverfahren auf der Grundlage der Insektenmasse beinhaltet. Der Artikel behandelt die Vorbereitung des Arbeitsbereichs und der chemischen Lösungen, die Anwendung von Insektiziden und die Bestimmung des Überlebens von Insekten nach der Exposition. Die topische Anwendungsmethodik ermöglicht eine konsistente Exposition gegenüber definierten Insektiziddosen und reduziert die interspezifische und inter-assay-Variabilität, was für diejenigen, die an der Schädlingsbekämpfung oder der Untersuchung von Insektizidresistenzen in Mückenpopulationen beteiligt sind, von großem Interesse sein wird.

Chen et al.8 stellen ein einfaches, handhabbares Hochdurchsatz-DNA-Extraktionsprotokoll von Mückenproben für die Sequenzierung des gesamten Genoms unter Verwendung magnetischer DNA-bindender Kügelchen vor. Das Protokoll umfasst die Homogenisierung der Probe und den gesamten Extraktionsprozess. Dieser Ansatz fördert eine hochergiebige und dennoch hoch reproduzierbare DNA-Extraktionsmethode, die für Labore mit begrenzten Ressourcen geeignet ist. Es wird für diejenigen interessant sein, die mit Anwendungen in der Mückengenomik arbeiten, insbesondere mit DNA-Präparaten für Feldmücken.

Mehrere Artikel in der Sammlung befassen sich mit methodischen Fortschritten im Zusammenhang mit dem Studium der Biologie von Mücken. Jové et al.9 beschreiben eine fluoreszenzbasierte Hochdurchsatz-Quantifizierung des Mahlzeitenvolumens für künstlich gefütterte Mücken. Es umfasst die Zubereitung von Mahlzeiten, die Zugabe des Fluoreszeinfarbstoffs, die Verabreichung der Mahlzeit auf einem kostengünstigen Feeder-System, gefolgt von der Quantifizierung des Mahlzeitenvolumens in gefütterten Mückenproben. Die beschriebene Methodik ermöglicht eine effektive Beurteilung der Mückenfütterung, die für Fütterungsversuche mit künstlicher Nahrung, Blut, Zucker oder Nektar relevant ist. Es wird für diejenigen wertvoll sein, die das Fressverhalten von Insekten untersuchen. Tsujimoto und Adelman10 skizzieren eine neuartige Technik zur Bestimmung der Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit von Mücken unter Verwendung von mit Agarose gefüllten 24-Well-Zellkulturplatten. Das Protokoll beschreibt die Plattenvorbereitung, die Mückenfütterung, die Eiablage, die Bildgebung der Platten und die Datenerfassung. Es reduziert Zeit, Platz und Arbeit im Vergleich zu herkömmlichen Methoden und wird Forscher interessieren, die die Fitness von Mücken oder die molekularen Grundlagen der Mückenvermehrung bewerten. Lajevardi et al.11 verwenden den Ramsay-Assay, um den Ionentransport und die Flüssigkeitssekretion in Mückenausscheidungsgeweben zu untersuchen. Das Protokoll passt den Ramsay-Assay für die Verwendung mit einer kleinen Menge Insektengewebe an und erörtert auch die Vorbereitung und Kalibrierung von Elektroden, die Vorbereitung von Mückengewebe für den Assay und die Aufzeichnung von Messwerten aus malpighischen Tubuli und Verdauungsgewebe. Dieses Protokoll ist für diejenigen interessant, die sich mit Verdauungs- oder Ausscheidungssystemen und der Neuropeptid-/endokrinen Regulation von Insektengeweben beschäftigen. Wang et al.12 beschreiben die heterologe Expression von Ae. aegypti-Geruchsrezeptoren in Xenopus-Oozyten , um deren Reaktion auf menschliche Gerüche zu bewerten. Es umfasst die Klonierung von Odorantenrezeptorgenen, die cRNA-Synthese, die Dissektion und Isolierung von Xenopus-Oozyten , die heterologe Expression der Gene und die anschließende Aufzeichnung einzelner Sensillum zur Messung der Rezeptoraktivität. Dieses Protokoll bietet ein einzigartiges System zur Bewertung der genetischen und funktionellen Grundlagen des Geruchssinns von Mücken, mit potenziellen Anwendungen im Zusammenhang mit der Verhaltensforschung von Mücken.

Vier Artikel der Sammlung befassen sich mit gentechnisch veränderten Mücken und dem Prozess der Transgenese. Carballar-Lejarazú et al.13 skizzieren detaillierte Verfahren zur Herstellung transgener Anopheles gambiae-Mücken durch embryonale Mikroinjektion, während Bui et al.14 die Mikroinjektion von Culex quinquefasciatus-Embryonen für die CRISPR/Cas9-basierte Genomeditierung demonstrieren. Ersteres ist ein Schlüsselvektor von menschlichen Malariaparasiten, während letzteres ein Schlüsselvektor von Arboviren, einschließlich des West-Nil-Virus, ist und im Zusammenhang mit der Transgenese zu wenig untersucht wird. Diese Protokolle umfassen das Ziehen und Laden von Nadeln, die Vorbereitung und Ausrichtung der Eizellen mit anschließender Injektion sowie die Embryonengewinnung und das Screening auf Transgen-Phänotypen. Das An. gambiae-Protokoll beschreibt die Verfahren zur Eiablage und Eizellentnahme und stellt erfolgreiche Injektionen visuell dar. Die Cx. Das Quinquefasciatus-Protokoll beschreibt spezifische Parameter für das Nadelziehen und Tipps zur Erhöhung der Mutagenese-Raten. Der Artikel von Meuti und Harrell15 bietet einen detaillierten Fokus auf die Transgenese bei Culex pipiens, insbesondere auf den Injektionsprozess. Das Video zeigt den gesamten Injektionsprozess in großer Tiefe; Es beschreibt das Hinterfüllen und Anbringen der Nadel, das Positionieren der Eizellen und des Injektors sowie die Einzelheiten zur erfolgreichen Injektion. Es bietet strenge technische Anweisungen und Fehlerbehebungen zum Injektionsprozess und bietet Tipps zur Maximierung der Eischlüpfrate und der Larvenfitness. Diese drei Artikel werden sowohl für diejenigen interessant sein, die nach der Entwicklung neuartiger Vektorkontrollstrategien suchen, als auch für diejenigen, die sich mit der Genetik von Anopheles und Culex und Wirt-Pathogen-Interaktionen befassen. Carballar-Lejarazú et al.16 beschreiben den Prozess zur Durchführung von Versuchen in kleinen Käfigen, um zu beurteilen, ob Gene-Drive-Systeme spezifische Gene unter verschiedenen Bedingungen in naiven Mückenpopulationen verbreiten können. Das Protokoll untersucht die Mechanismen von überschwemmten Versuchen zur Freisetzung von Mücken ohne Trieb und von Gene-Drive-Versuchen mit überlappenden oder nicht überlappenden Mückengenerationen. Es liefert genaue Details zu Wildtyp-transgenen Additionsverhältnissen, Screening-Prozessen und der Anpassung experimenteller Parameter an Fitness-Assays oder zur Modellierung der Ausbreitung von Gene-Drive-Allelen. Dieses Protokoll wird Forschern auf dem Gebiet der Vektorkontrolle zugute kommen, die neuartige Gene-Drive-Systeme entwickeln und die Wirksamkeit von Gene Drives untersuchen.

Die letzten drei Artikel der Sammlung befassen sich mit der Kultivierung und Exposition von Krankheitserregern. Liu et al.17 demonstrieren das Protokoll für die Wiedereinführung von Bakterien in erwachsene Mücken nach einer Antibiotikabehandlung, um die biologische Rolle der Mikrobiota zu verstehen. Es umfasst die Kultivierung und Isolierung von Bakterien, die Antibiotikabehandlung und bakterielle Fütterungsassays. Das Protokoll bietet eine gute Synthese eines komplexen, facettenreichen Verfahrens. Es wird nützlich für diejenigen sein, die sich für die Erforschung der Mikrobiota von Mücken oder die Entwicklung erwachsener gnotobiotischer Mücken interessieren. Grigsby et al.18 heben das Protokoll für die Integration der Kultivierung des Mikrosporidianparasiten Edhazardia aedis in die Standardaufzucht von Aedes aegypti hervor. Es beschreibt die Isolierung, Identifizierung und Zählung infektiöser Sporen vor der Reinfektion von Mücken und die Konservierung der infizierten Mückeneier. Es gibt Ratschläge zur Fehlerbehebung zum Aufspüren von Sporen und zur Koordination des Schlüpfens von Mücken mit der Sporenvorbereitung. Dieses Protokoll ist für diejenigen interessant, die Mikrosporidien-Parasiten zu Versuchszwecken kultivieren möchten, und für diejenigen, die die Auswirkungen einer Parasiteninfektion auf die Immunität oder die Vektorkapazität von Mücken untersuchen. Tripathi et al.19 beschreiben detailliert das Protokoll für die Kultivierung von Plasmodium falciparum-Gametozyten , die Durchführung von Infektionen mit Anopheles-Mücken über das Membran-Glas-Feeder-System und die Zählung von Oozysten und Sporozoiten. Es ist ein wesentliches Protokoll für die P. falciparum-Kultur , das schwer zu erreichen sein kann. Das Protokoll wird sehr wertvoll sein für diejenigen, die Plasmodium-Infektionen und -Übertragungen bei Stechmücken untersuchen, für diejenigen, die Anti-Malaria-Strategien entwickeln wollen, einschließlich Tools zur Blockierung der Übertragung, und für diejenigen, die die Vektorkompetenz von An. gambiae-Populationen untersuchen, einschließlich transgener Linien und Gene-Drive-Strategien.

Die Artikelsammlung befasst sich mit vielen Forschungsthemen, die für die Zukunft der Stechmücke und der durch Stechmücken übertragenen Krankheitserreger wichtig sind. Das Verständnis der Resistenz von Mücken gegen Pestizide ist von entscheidender Bedeutung, da es den Erfolg der aktuellen Bekämpfungsprogramme widerspiegelt. Darüber hinaus kann die Detektion von Resistenzen ein Signal dafür sein, dass Änderungen der Kontrollstrategien erforderlich sind. Gentechnische Technologien, einschließlich der Transgenese von Mücken, Genome Editing und Gene-Drive, werden aufgrund ihrer hohen Nachvollziehbarkeit und Anpassungsfähigkeit wahrscheinlich im kommenden Jahrzehnt und darüber hinaus eine Schlüsselrolle bei der Bekämpfung von Mücken spielen. Verbesserte Kenntnisse der Mückenbiologie, insbesondere in den Bereichen Populationsgenomik, Wirt-Pathogen-Interaktionen, Mückenverhalten und die molekularen Grundlagen wichtiger biologischer Merkmale, werden wertvolle Erkenntnisse liefern, die zur Entwicklung neuer Bekämpfungsinstrumente genutzt werden können. So könnte beispielsweise die Identifizierung von Genen, die am Geruchssinn beteiligt sind, Forschern helfen, neuartige Repellentien zu entwickeln, während die Identifizierung von Genen, die an Wirt-Krankheitserreger-Interaktionen beteiligt sind, schließlich zur Entwicklung transgener Mücken führen könnte, die antipathogene Effektoren tragen. Diese Sammlung berührt all diese Themen, und in den Händen von Vektorbiologen aus der ganzen Welt werden die hier beschriebenen Methoden dazu beitragen, neue und einzigartige Einblicke in viele Aspekte der Mückenbiologie zu ermöglichen. Eine zentrale Herausforderung für die Zukunft wird es sein, das in diesen Themenbereichen generierte Wissen zu nutzen, um neue Regelungsstrategien zu entwickeln oder bestehende Strategien zu ergänzen oder zu optimieren.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Veröffentlichung wurde vom National Institute of Food and Agriculture des US-Landwirtschaftsministeriums (USDA) unterstützt, Hatch-Projekt 1026692 EPC.

Referenzen

  1. Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
  2. Bhutta, Z. A., Sommerfeld, J., Lassi, Z. S., Salam, R. A., Das, J. K. Global burden, distribution, and interventions for infectious diseases of poverty. Infectious Diseases of Poverty. 3, 21(2014).
  3. Caminade, C., McIntyre, K. M., Jones, A. E. Impact of recent and future climate change on vector-borne diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1436 (1), 157-173 (2019).
  4. Caragata, E. P., et al. Prospects and pitfalls: Next-Generation tools to control mosquito-transmitted disease. Annual Review of Microbiology. 74, 455-475 (2020).
  5. Jones, R. T., Ant, T. H., Cameron, M. M., Logan, J. G. Novel control strategies for mosquito-borne diseases. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 376 (1818), 20190802(2021).
  6. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (1), 0007831(2020).
  7. Jensen, B. M., et al. Topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies. Journal of Visualized Experiments. (179), e63391(2022).
  8. Chen, T. Y., et al. A magnetic-bead-based mosquito DNA extraction protocol for next-generation sequencing. Journal of Visualized Experiments. (170), e62354(2021).
  9. Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T. M., Duvall, L. B. Feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (164), e61835(2020).
  10. Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Improved fecundity and fertility assay for Aedes aegypti using 24 well tissue culture plates (EAgaL plates). Journal of Visualized Experiments. (171), e61232(2021).
  11. Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. V. Studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito. Journal of Visualized Experiments. (174), e61849(2021).
  12. Wang, X., et al. Heterologous expression and functional analysis of Aedes aegypti odorant receptors to human odors in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (172), e61813(2021).
  13. Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T. B., James, A. A. Microinjection method for Anopheles gambiae embryos. Journal of Visualized Experiments. (173), e62591(2021).
  14. Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in Culex quinquefasciatus. Journal of Visualized Experiments. (159), e61375(2020).
  15. Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing and injecting embryos of Culex mosquitoes to generate null mutations using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (163), e61651(2020).
  16. Carballar-Lejarazú, R., Pham, T. B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A. A. Small-Cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (171), e62588(2021).
  17. Liu, X., et al. A bacterial oral feeding assay with antibiotic-Tteated mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61341(2020).
  18. Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Propagation of the microsporidian parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (162), e61574(2020).
  19. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426(2020).

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