Methodenartikel

Differenzierung und Bildgebung von braunen Adipozyten aus der stromalen vaskulären Fraktion des interscapularen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen

DOI:

10.3791/64604

⸱

3. Februar 2023

 ,  ,  , 
1Department of Nutrition, Diabetes and Metabolism, Pontificia Universidad Católica de Chile

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Präadipozyten werden aus der stromalen Gefäßfraktion des interskapularen braunen Fettgewebes von neugeborenen Mäusen isoliert und zu Zellen differenziert, die Lipidtröpfchen akkumulieren, molekulare Marker exprimieren und die mitochondriale Morphologie reifer brauner Adipozyten zeigen. Diese Zellen werden weiter mittels Immunfluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie analysiert.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Braunes Fettgewebe (BVT) kommt nur bei Säugetieren vor und hat eine thermogene Funktion. Braune Adipozyten zeichnen sich durch ein multilokuläres Zytoplasma mit mehreren Lipidtröpfchen, einen zentralen Kern, einen hohen mitochondrialen Gehalt und die Expression des Entkopplungsproteins 1 (UCP1) aus. Die BVT wurde als potenzielles therapeutisches Ziel für Adipositas und die damit verbundenen Stoffwechselstörungen vorgeschlagen, da sie in der Lage ist, Stoffwechselenergie in Wärme abzuleiten. Um die Funktion und Regulation der BAT zu untersuchen, ist die Kultivierung der braunen Adipozyten unerlässlich. Das vorliegende Protokoll optimiert die Gewebeverarbeitung und Zelldifferenzierung für die Kultivierung von braunen Adipozyten aus neugeborenen Mäusen. Darüber hinaus werden Verfahren zur Bildgebung differenzierter Adipozyten sowohl mit konfokaler Immunfluoreszenz als auch mit Transmissionselektronenmikroskopie gezeigt. In den braunen Adipozyten, die mit den hierin beschriebenen Techniken differenziert wurden, bleiben die wichtigsten definierenden Merkmale der klassischen BVT erhalten, einschließlich hoher UCP1-Spiegel, erhöhter mitochondrialer Masse und sehr engem physikalischem Kontakt zwischen den Lipidtröpfchen und Mitochondrien, was diese Methode zu einem wertvollen Werkzeug für BVT-Studien macht.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Weißes und braunes Fettgewebe unterscheiden sich in ihrer anatomischen Lage, ihrem zellulären Ursprung, ihrer Funktion, ihrer Morphologie und ihrer Gesamtmasse. Weißes Fettgewebe (WAT) ist das wichtigste physiologische Energiereservoir des Körpers und speichert große Mengen an Triacylglycerin (TAG) in hochspezialisierten Zellen, die ein einzelnes riesiges Lipidtröpfchen haben, das den größten Teil ihres Zellvolumens einnimmt1. Bei der TAG-Lipolyse werden freie Fettsäuren freigesetzt, die in den systemischen Kreislauf gelangen, um den Energiebedarf während des Fastens oder anderer Zustände negativer Energiebilanz zu decken. Darüber hinaus sezerniert das WAT Protein- und Lipidprodukte, die als Adipokine bzw. Lipokine bezeichnet werden und metabolische, immunologische und reproduktive regulatorische Funktionen haben, wodurch das WAT zum größten endokrinen Gewebe im Körper wird2.

Braunes Fettgewebe (BAT) ist ein viel kleineres Organ, dessen physiologische Hauptfunktion die nicht zitternde Thermogenese ist, um eine Unterkühlung zu verhindern. Bei Mäusen und neugeborenen Menschen ist BAT ein gut definiertes Organ, das sich im Zwischenschulterraum befindet. Erwachsenen Menschen fehlt die interscapuläre BAT (iBAT); Nichtsdestotrotz entwickeln sie Cluster von braunen Adipozyten-ähnlichen Zellen, die in Depots integriert sind, die sonst hauptsächlich WAT umfassen. Diese "Brown-in-White"-Adipozyten (Brite) haben morphologische und molekulare Merkmale mit den klassischen iBAT-Adipozyten gemeinsam, haben jedoch einen anderen zellulären Ursprung 3,4.

Im Gegensatz zu weißen Adipozyten haben braune Adipozyten mehrere kleine Lipidtröpfchen und reichlich Mitochondrien5. Das Entkopplungsprotein 1 (UCP1, auch bekannt als Thermogenin) wird ausschließlich von braunen und britischen Adipozyten exprimiert und vermittelt die Protonenleckage in der inneren Mitochondrienmembran (IMM), wodurch der Elektronentransport von der ATP-Synthese entkoppelt und Wärme erzeugt wird. Die nicht zitternde Thermogenese in BAT wird durch Noradrenalin (NE) aktiviert, das als Reaktion auf die Kältestimulation aus den sympathischen Enden in der BAT freigesetzt wird6. NE bindet an beta-Adrenozeptoren (meist Beta 3) auf der Oberfläche brauner Adipozyten und löst eine intrazelluläre cAMP-vermittelte Signalkaskade aus. Dies führt zur TAG-Lipolyse, der Beta-Oxidation mitochondrialer Fettsäuren, und zur Wärmeerzeugung bei UCP1-Aktivierung3. Die enge funktionelle Beziehung zwischen Lipidtröpfchen und Mitochondrien in braunen Adipozyten weist strukturelle Parallelen auf, wie z. B. die Wechselwirkung zwischen diesen Organellen in Bereichen, die groß sind und einen sehr engen physischen Kontakt haben 7,8.

iBAT hat reichlich Blutgefäße und sympathische Endungen9. Diese Strukturen bilden zusammen mit den Präadipozyten, Immunzellen, Fibroblasten und extrazellulären Matrixmolekülen die fette stromale vaskuläre Fraktion (SVF)10. Es wurde berichtet, dass viele Protokolle reife Adipozyten aus den Präadipozyten 11,12,13,14,15 erzeugen (Ergänzende Tabelle 1); Dennoch weisen sie extreme Unterschiede in der Gewebeverarbeitung und der Zusammensetzung der Differenzierungskulturmedien auf. Das hierin beschriebene Protokoll ermöglicht die effiziente und reproduzierbare Differenzierung von braunen Adipozyten, die (1) die wichtigsten adipogenen Transkriptionsfaktoren Peroxisom-Proliferator-aktivierter Rezeptor gamma (PPARγ) und CCAAT/Enhancer-bindendes Protein alpha (C/EBPα) exprimieren, (2) die reifen Adipozytenmarker perilipin1 (PLIN1) und Cluster-Determinante 36 (CD36) exprimieren, (3) reichlich Lipidtröpfchen akkumulieren, (4) eine hohe mitochondriale Masse und eine hohe Häufigkeit von OXPHOS-Komplexen aufweisen, (5) haben ein thermogenes Potenzial, das durch hohe UCP1-Spiegel bestimmt wird, und (6) weisen mitochondriale morphologische Veränderungen auf, die mit dem Phänotyp reifer brauner Adipozyten verbunden sind. Diese Methodik wird verwendet, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der generalisierten Lipodystrophie zugrunde liegen 15,16,17.

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Protokoll

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Die Tierverfahren wurden vom Institutionellen Ausschuss für Tierpflege und -verwendung an der Pontificia Universidad Católica de Chile genehmigt. Für diese Studie wurden P0,5 neugeborene Mäuse beiderlei Geschlechts verwendet, die aus einem gemischten Hintergrund von C57BL/6J- und 129J-Stämmen stammten.

1. Entnahme von Gewebe

  1. Reinigen und desinfizieren Sie die Werkbank mit einer 70%igen Ethanollösung und verwenden Sie steriles chirurgisches Material.
  2. Einschläferung von P0,5-Neugeborenen durch Enthauptung mit einer chirurgischen Schere nach institutionell anerkanntem Protokoll.
  3. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage (mit dem Gesicht nach unten) und machen Sie mit einer scharfen Schere einen 1 cm langen Schnitt in die Haut in der Mitte des Rückens des Tieres. Entfernen Sie vorsichtig die Haut.
    HINWEIS: Dieser Schritt ist von entscheidender Bedeutung, denn wenn die Haut nicht gut entfernt wird, kann dies die iBAT zerreißen und beschädigen und die optimale Vorbereitung des SVF verhindern.
  4. Lösen Sie die iBAT mit einer kleinen Schere chirurgisch von der Karkasse.
    HINWEIS: Die iBAT wird als zwei Fettläppchen visualisiert, die unabhängig voneinander entfernt werden können.
  5. Entnehmen Sie beide iBAT-Lappen, indem Sie die Lappen mit einer Zange mit gebogener Spitze unabhängig voneinander entfernen.
  6. Legen Sie die beiden Lappen in ein Kunststoffröhrchen mit 1,5 mL sterilem PBS bei Raumtemperatur. Bewahren Sie das Gewebe in den einzelnen Röhrchen auf, bis die Gewebeentnahme für alle benötigten Welpen abgeschlossen ist.

2. Verdauung des Gewebes

  1. Aliquot 300 μl Kollagenase Typ II Verdauungspuffer (0,2 % Typ II Kollagenase im Puffer [25 mM KHCO3, 1,2 mM MgSO4, 120 mM NaCl, 5 mM Glukose, 12 mM KH2PO4, 4,8 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 2,5 % BSA und 1 % Penicillin/Streptomycin, bei pH 7,4]) (Tabelle 1) in 1,5 ml Röhrchen.
    HINWEIS: Bereiten Sie ausreichend Röhrchen für die Anzahl der einzelnen Gewebe vor, die entnommen werden sollen. In der vorliegenden Studie wurden sieben Schläuche verwendet, was einem Wurf von sieben Welpen entspricht.
  2. Stellen Sie sich auf die Bank und legen Sie die iBAT-Lappen in einen Kollagenase-Typ-II-Verdauungspuffer, um die extrazelluläre Matrix abzubauen.
  3. Inkubieren Sie das iBAT-Gewebe 45 Minuten lang bei 37 °C und schütteln Sie es kontinuierlich sanft bei 800 U/min (Abbildung 1).

3. Gewebe-Verarbeitung

HINWEIS: Führen Sie nach dem Aufschluss alle folgenden Schritte in einer Laminar-Flow-Gewebekulturhaube der Klasse II durch.

  1. Bereiten Sie zwei Sätze 1,5-ml-Kunststoffröhrchen für jede einzelne Probe vor und beschriften Sie sie.
  2. Unterbrechen Sie mechanisch die Gewebesuspension im Kollagenase-Typ-II-Verdauungspuffer, indem Sie mit einer P1.000-Mikropipette und filtrierten Spitzen auf und ab pipettieren. Verwenden Sie für jede Probe eine neue Spitze.
    HINWEIS: Dies ist ein kritischer Schritt. Stellen Sie sicher, dass das Gewebe mit der Spitze mechanisch disaggregiert wird und pipettieren Sie auf und ab, bis die makroskopische Homogenisierung abgeschlossen ist.
  3. Das disaggregierte Gewebe wird durch einzelne 100-μm-Zellsiebe (siehe Materialtabelle) in neue 1,5-ml-Röhrchen geleitet.
  4. Geben Sie 500 μl ACK-Puffer (siehe Materialtabelle) zu den gefilterten Gewebeproben, drehen Sie die Röhrchen 4-5 Mal um und inkubieren Sie sie 4 Minuten lang bei Raumtemperatur.
    HINWEIS: Überschreiten Sie nicht die Inkubationszeit, da dies die interessierenden Zellen beschädigen kann.
  5. Zentrifugieren Sie die Gewebeproben bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
  6. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie das Röhrchen umdrehen, und resuspendieren Sie das Pellet in 1 ml Kulturmedium (DMEM-F12 mit 10 % FBS, 1 % Antibiotikum, Antimykotikum, pH 7,2) (siehe Materialtabelle).
  7. Geben Sie die Suspensionen mit einer P1.000-Mikropipette und filtrierten Spitzen durch ein 40-μm-Zellsieb in neue 1,5-ml-Röhrchen.
  8. Die Proben bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren.
    HINWEIS: Das Pellet entspricht dem Präadipozyten-haltigen SVF.
  9. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie das Röhrchen umdrehen, und resuspendieren Sie das Pellet durch Pipettieren in 1 ml Kulturmedium.
  10. Bereiten Sie ein 15-ml-Röhrchen für jede Probe vor, indem Sie 5 ml Kulturmedium hinzufügen.
  11. Geben Sie jedes resuspendierte Pellet in das entsprechende 15-ml-Röhrchen mit 5 mL Nährmedium. Drehen Sie das Röhrchen 4-5 Mal um, um den Zellinhalt zu mischen.
  12. Säen Sie jede Probe in sechs Vertiefungen einer 24-Well-Kulturplatte aus, indem Sie 1 ml der Suspension in jede Vertiefung geben (Abbildung 1).

4. Kultur der stromalen vaskulären Fraktion (SVF)

  1. Wechseln Sie das Kulturmedium alle zwei Tage, bis die Zellen eine Konfluenz von 100 % erreicht haben.
    HINWEIS: Während dieser Zeit werden nicht-plastische adhärente Zellen entfernt, was zu einer Primärkultur führt, die mit einem Präadipozyten-haltigen SVF angereichert ist.
  2. Wenn die Zellen zu 100 % konfluent sind, entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Zellen mit 800 μl sterilem PBS.
  3. Geben Sie 150 μl 0,25 % Trypsin-EDTA (siehe Materialtabelle) in jede Vertiefung und stellen Sie die Kulturplatte für 3 Minuten in den Inkubator, um die Zellen abzulösen.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Zellen mit einem Phasenkontrastlichtmikroskop abgetrennt sind.
  4. Inaktivieren Sie das Trypsin, indem Sie 850 μl Kulturmedium in jede Vertiefung geben.
  5. Entnehmen Sie die Zellen aus den sechs Vertiefungen, die in Schritt 3.12 ausgesät wurden, und geben Sie sie in ein 15-ml-Röhrchen.
  6. Erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 12 ml, indem Sie 6 mL Nährmedium hinzufügen. Drehen Sie das Rohr 4-5 Mal um, um den Inhalt zu mischen.
  7. 1 ml der Probe in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte aussäen. Wechseln Sie das Kulturmedium alle zwei Tage, bis die Zellen die Konfluenz erreichen.
  8. Wenn die Zellen zu 100 % konfluent sind, lösen Sie sie mit 150 μl 0,25 % Trypsin-EDTA unter den gleichen Inkubationsbedingungen wie in Schritt 4.3 ab und säen Sie sie entsprechend der für das Experiment erforderlichen Oberfläche der Vertiefung aus.
  9. Führen Sie eine hochauflösende Bildgebung durch, nachdem Sie die Zellen gemäß Schritt 8 fixiert haben.
    HINWEIS: Für weitere Experimente wird eine Dichte von 35.000 Zellen/cm² empfohlen (Protein- und Gesamt-RNA-Extraktion, 330.000 Zellen [eine Vertiefung einer 6-Well-Platte]; Immunfluoreszenz [IF], 10.500 Zellen [eine Vertiefung einer 96-Well-Platte]).

5. Adipogene Differenzierung

  1. Inkubieren Sie die Zellen mit Induktionsmedium (DMEM-F12 mit 10 % FBS, 1 % Antibiotikum, Antimykotikum, pH 7,2, ergänzt mit 500 nM Dexamethason, 125 nM Indomethacin, 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin [IBMX], 5 μM Rosiglitazon, 1 nM T3 und 20 nM Insulin) (Tabelle 1) für 72 h (Tag 0 bis Tag 2) (Abbildung 2).
    HINWEIS: Der Nährboden muss alle zwei Tage gewechselt werden. Der erste Mediumwechsel muss also am Tag 2 nach der ersten Induktion erfolgen.
  2. Wechseln Sie an Tag 3 zu einem Erhaltungsmedium (DMEM-F12 mit 10 % FBS, 1 % Antibiotikum, pH 7,2, ergänzt mit 5 μM Rosiglitazon, 1 nM T3 und 20 nM Insulin) (Tabelle 1) und halten Sie dieses Erhaltungsmedium bis zum Tag 7 aufrecht (Abbildung 2).
    HINWEIS: Das Wartungsmedium muss an Tag 5 und Tag 7 gewechselt werden. Kleine Lipidtröpfchen können ab dem 3. Tag der Differenzierung durch Phasenkontrastmikroskopie sichtbar gemacht werden. Große Lipidtröpfchen sind am 7. Tag der Differenzierung sichtbar. Differenzierungsverfahren, die länger als 7 Tage dauern, führen zu Zellverlust durch Ablösung, wahrscheinlich aufgrund des hohen Auftriebs der lipidbeladenen Zellen.

6. Herstellung des zellulären Homogenats

  1. Entfernen Sie das Kulturmedium an Tag 0 und Tag 7 der Differenzierung und waschen Sie die Zellen 3 Mal mit sterilem PBS.
  2. Geben Sie nach der letzten Reinigung 1,3 ml steriles PBS in jede Vertiefung.
    HINWEIS: Halten Sie die Zellen bis zur Reinigung der letzten Platte im Eis.
  3. Ernten Sie die Zellen mechanisch aus einer Vertiefung einer 6-Well-Platte (~330.000 Zellen) mit einem Zellschaber und geben Sie die Zellsuspension in ein 1,5-ml-Röhrchen.
  4. Zentrifugieren Sie die Proben bei 2.800 x g für 5 min bei 4 °C.
  5. Entfernen Sie das PBS mit einer Mikropipette und halten Sie die Röhrchen auf Eis.
  6. Resuspendieren Sie das zelluläre Pellet in RIPA-Puffer mit Protease- und Phosphatase-Inhibitoren (siehe Materialtabelle) und inkubieren Sie es 30 Minuten lang auf Eis.
    HINWEIS: Um das zelluläre Pellet zu lysatieren, sind 70-80 μl ausreichend.
  7. Die Proben werden bei 21.000 x g für 15 min bei 4 °C zentrifugiert.
  8. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand zu einem 1,5-ml-Röhrchen und entsorgen Sie das Pellet.
    HINWEIS: Der Überstand stellt das zelluläre Homogenat dar.
  9. Bestimmung der Proteinkonzentration des zellulären Homogenats unter Verwendung von Bicinchoninsäure (BCA) für den kolorimetrischen Nachweis und die Quantifizierung des Gesamtproteins18,19.

7. Westliche Blotting

  1. Bereiten Sie 30 μg des zellulären Homogenats (aus Schritt 6.8) vor und fügen Sie den im Handel erhältlichen SDS-PAGE-Probenladepuffer hinzu (siehe Materialtabelle).
  2. In Polyacrylamid-Gelelektrophorese-SDS20 (PAGE-SDS) entsprechend dem Molekulargewicht jedes Proteins auflösen.
    HINWEIS: Verwenden Sie 10 % PAGE-SDS für PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 und UCP1, 12 % PAGE-SDS für OXPHOS und 15 % PAGE-SDS für TOM20 (siehe Materialtabelle).
  3. Übertragen Sie die Proteine für 2 h bei 350 mA auf die PVDF-Membran (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Der Eisbehälter muss nach 1 h gewechselt werden. Halten Sie die Kammer während des gesamten Vorgangs auf Eis.
  4. Blockieren Sie die Membranen mit 5 % BSA oder fettfreier Milch in Tris-gepufferter Kochsalzlösung (TBS) 0,1 % Tween 20 (TBS-T) für 2 h gemäß den Empfehlungen aus den Datenblättern der Antikörper.
  5. Inkubieren Sie mit den Primärantikörpern (die in dieser Studie verwendeten Antikörper sind in der Materialtabelle aufgeführt) über Nacht bei 4 °C.
    HINWEIS: Alle in dieser Studie verwendeten Antikörper wurden in Blockierungslösung auf 1:1.000 verdünnt.
  6. Waschen Sie die Membranen 3 Mal mit 0,1 % TBS-T und inkubieren Sie sie mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern (siehe Materialtabelle) für 2 h bei Raumtemperatur.
  7. Waschen Sie die Membranen 3 Mal mit 0,1%. TBS-T. Führen Sie eine letzte Wäsche mit 1x TBS durch und lagern Sie die Membranen bis zur Visualisierung in 1x TBS. Eine Lagerung von maximal 1 h wird empfohlen.
  8. Visualisieren Sie die Membranen durch Chemilumineszenz20 oder eine andere bevorzugte Methode.

8. Hochauflösende Bildgebung

  1. Führen Sie den Immunfluoreszenz-Assay mit den folgenden Schritten durch.
    1. Die Primärkulturen von braunen Präadipozyten von P0,5-neugeborenen Mäusen (nach Schritt 4.8) in 96-Well-Platten mit optischem Boden aussäen und differenzieren (siehe Materialtabelle).
    2. Fixieren Sie die Zellen am Tag 0 und 7 der Differenzierung mit 4% PFA für 20 min und waschen Sie sie 3 Mal mit sterilem PBS.
    3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit 0,1 % Triton X-100 für 15 min und blockieren Sie sie mit 3 % Fischgelatine (siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur.
    4. 3-mal mit sterilem PBS waschen und mit PLIN1-Antikörper (1:400, siehe Materialtabelle) in 1 % BSA/PBS über Nacht bei 4 °C in einer feuchten Kammer inkubieren.
    5. 3-maliges Waschen mit sterilem PBS und Inkubieren mit Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpern bei 1:1.000 (1 % BSA/PBS) (siehe Materialtabelle) für 1 h bei Raumtemperatur.
    6. Die Zellkerne mit 1 μg/mL Hoechst 33342 und die Lipidtröpfchen mit 1 μg/mL BODIPY für 30 min bei Raumtemperatur einfärben.
      HINWEIS: Die Fluoreszenzbilder wurden mit einem Zellbildgebungssystem aufgenommen (siehe Materialtabelle). Insgesamt wurden 9 bzw. 16 Fotos pro Vertiefung mit zwei bis drei Kanälen mit einer 20-fachen Vergrößerung aufgenommen.
  2. Führen Sie die Transmissionselektronenmikroskopie mit den folgenden Schritten durch.
    1. Züchten und differenzieren Sie die braunen Präadipozyten in 35 mm x 10 mm großen Zellkulturschalen.
    2. Am Tag 0 und Tag 7 der Differenzierung das Medium entfernen und die Zellen 1 h lang mit 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Natriumcacodylatpuffer, pH 7,0 fixieren (siehe Materialtabelle).
    3. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit 0,05 M Natriumcacodylatpuffer für 10 min und behandeln Sie sie 15 min lang mit 1% wässrigem Osmiumtetroxid (siehe Materialtabelle).
    4. Waschen Sie die Zellen 3 Mal mit bi-destilliertem Wasser für 5 min und behandeln Sie sie 15 min lang mit 1% wässrigem Uranylacetat (siehe Materialtabelle).
    5. Dehydrieren Sie die Zellen mit einem Ethanolgradienten von 30%, 50%, 70%, 95% und 100% für jeweils 5 Minuten.
    6. Betten Sie die Zellen 30 min lang in 1:1 Epon/Ethanol und anschließend 1 h in Epon ein (siehe Materialtabelle).
      HINWEIS: Der Einschluss der Zellen erfolgt direkt in der Schale, indem frisches Epon hinzugefügt wird, um die gesamte Zellkultur-Monoschicht zu bedecken. Lassen Sie das Epon im Backofen bei 60 °C 24 h polymerisieren.
    7. Tauchen Sie die Zellkulturschale 2 Minuten lang in flüssigen Stickstoff und brechen Sie sie dann mit einer Zange, um den Kunststoffeinschluss zu lösen.
    8. Kleben Sie die Einschlusssegmente mit Zellen auf einen Harzblock, um feine Schnitte (80 nm) parallel zur Oberfläche in einem Ultramikrotom zu erhalten (siehe Materialtabelle).
    9. Färben Sie die Schnitte 4 min lang mit 1% wässrigem Uranylacetat und 5 min mit Bleicitrat ein, so Reynolds et al.21.
    10. Visualisieren Sie die Gitter in einem Elektronenmikroskop (siehe Materialtabelle).

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Adipogenese wird durch ein Netzwerk von Transkriptionsfaktoren reguliert, die sowohl für die Expression von Schlüsselproteinen verantwortlich sind, die die Bildung und Funktion von braunen Adipozyten induzieren22, einschließlich klassischer adipogener Regulatoren wie PPARγ und C/EBPα 23,24,25, sowie Marker reifer Adipozyten 26,27. Durch das Te...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Das vorliegende Protokoll ist ein einfaches und replizierbares zweiphasiges Differenzierungsverfahren (Abbildung 2) zur Erzeugung von Zellen mit den molekularen und morphologischen Eigenschaften reifer brauner Adipozyten. Die chirurgische Entnahme des iBAT ist der erste kritische Schritt, da das Einreißen des Gewebes die Lebensfähigkeit des Ausgangsmaterials stark einschränkt. Die Gewebeaufbereitung ist ebenfalls von entscheidender Bedeutung, da eine homogene Zellsuspension, die frei von Abl...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Finanzierung erfolgte durch FONDECYT (1181214 und 1221146) und Anillos (ACT210039) für VC- und Doktorandenstipendien ANID 21171743 für AMF und ANID 21150665 für FS. Wir danken Alejandro Munizaga für die Hilfe bei der Bearbeitung der Proben und die technische Beratung für die Transmissionselektronenmikroskopie. Die Illustrationen wurden mit BioRender erstellt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
10x Tris/Glycin-PufferBioRad1610734
16% Paraformaldehyd wässrige LösungElektronenmikroskopie Sciences15710
35 mm TC-behandelte Easy-Grip Style ZellkulturschaleFalcon353001
3-Isobutyl-1-methylxanthin (IBMX)Calbiochem410957
40% Acrylamid/Bis-Lösung, 37,5:1BioRad1610148
6-Well-Platte SPL Life Science -
96 Well optisches Schwarz mit Deckel sterilThermo Scientific165305
AccuRuler RGB Plus vorgefärbte Proteinleiter Maöstrogen02102-250
ACK Lysing-Puffer GibcoA10492-01
Ammoniumpersulfat BioRad1610700
Antibiotisch-AntimykotikumGibco 
Anti-Maus-IgG, HRP-gebundener AntikörperZellsignalisierung7076
Anti-Kaninchen-IgG, HRP-gebundener Antikörper   Zellsignalisierung7074
Blocker in Blotting-Qualität BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C/EBPα AntikörperZellsignalisierung2295
CaCl2Calbiochem 
CD36 AntikörperInvitrogenPA1-16813
Cell Strainer 100 µ m, NylonFalcon352360
Cell Strainer 40 µ m, NylonFalcon352340
Kollagenase Typ IIGibco17101-015
Cytation 5 Cell Imaging Multimode ReaderBiotek
Dexamethason SigmaD4902
DMEM/F-12, PulverGibco12500062
EMBed-812 EMBEDDING KIT (Epon)Elektronenmikroskopie14120
Ethanol absolutMerck 100983 
Fötales Rinderserum Gibco16000-044
Gelatine aus KaltwasserfischhautSigmaG7041
GlukoseGibco 15023-021
Glutaraldehyd 25% wässrige LösungElektronenmikroskopie Sciences16210
Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG (H+L) kreuzadsorbierter Sekundärantikörper, Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11012
Halt Phosphatase Inhibitor Cocktail 100X Thermo Scientific78427
Halt Proteasehemmer Cocktail 100X Thermo Scientific78429
Hoechst 33258InvitrogenH1398
Immun-Blot PVDF Membran BioRad1620177
Indomethacin Sigma I7378 
Insulin SigmaI3536
KClCalbiochem 
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Lane Marker zur Reduzierung des Probenpuffers Thermo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
MilliQ wassersteril --
Mitoprofil Gesamt OXPHOS Nagetier WB Antikörper Cocktail Abcam MS604
NaClMerck 
OmniPur  10x PBS FlüssigkonzentratCalbiochem6505-OP
Osmiumtetroxid Elektronenmikroskopie19100
Perilipin 1 AntikörperZellsignalisierung9349
PPAR & gamma; (81B8)Antikörper-Zell-Signalisierung2443
RIPA-Puffer-Lyse Thermo Scientific89901
RosiglitazonMerck557366
NatriumbicarbonatSigmaS5761
Natriumcacpdylat-ElektronenmikroskopieSciences12300
Natriumdodecylsulfat BioRad1610301
T3SigmaT6397
Talos F200C G2Thermo Scientific
TEMED BioRad1610800
TOM20 AntikörperZellsignalisierung42406
Tris gepufferte Kochsalzlösung (TBS-10X)Zellsignalisierung12498
Triton X-100 Sigma93443
Trypsin-EDTA (0,25%)Gibco25200056
Tween 20, MolekularbiologischesPromega H5152
UCP1 AntikörperZell-Signalisierung14670
Ultracut RLeica  
UranylacetatElektronenmikroskopie Sciences22400
Westar Sonne  CyanagenXLS063
Westar Supernova CyanagenXLS3
152400622082915295521064041000

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
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