Summary
Dit protocol beschrijft de orthotope implantatie van kankercellen van patiënten in de blindedarmwand van immunodeficiënte muizen. Het model recapituleert gevorderde uitgezaaide ziekte van colorectale kanker en maakt de evaluatie van nieuwe therapeutische geneesmiddelen mogelijk in een klinisch relevant scenario van long- en levermetastasen.
Abstract
In het afgelopen decennium zijn meer geavanceerde preklinische modellen voor colorectale kanker (CRC) ontwikkeld met behulp van kankercellen van patiënten en 3D-tumoroïden. Aangezien tumororganoïden afkomstig van patiënten de kenmerken van de oorspronkelijke tumor kunnen behouden, maken deze betrouwbare preklinische modellen screening van kankergeneesmiddelen en de studie van resistentiemechanismen voor geneesmiddelen mogelijk. CRC-gerelateerde sterfte bij patiënten wordt echter meestal geassocieerd met de aanwezigheid van gemetastaseerde ziekte. Het is daarom essentieel om de werkzaamheid van antikankertherapieën te evalueren in relevante in vivo modellen die de belangrijkste moleculaire kenmerken van menselijke kankermetastasen echt samenvatten. We hebben een orthotopisch model opgesteld op basis van de injectie van CRC-kankercellen rechtstreeks in de blindedarmwand van muizen. Deze tumorcellen ontwikkelen primaire tumoren in de blindedarm die uitzaaien naar de lever en longen, wat vaak wordt waargenomen bij patiënten met gevorderde CRC. Dit CRC-muismodel kan worden gebruikt om geneesmiddelresponsen te evalueren die worden gecontroleerd door microcomputertomografie (μCT), een klinisch relevante kleinschalige beeldvormingsmethode die gemakkelijk primaire tumoren of metastasen bij patiënten kan identificeren. Hier beschrijven we de chirurgische ingreep en de vereiste methodologie om kankercellen van patiënten te implanteren in de blindedarmwand van immunodeficiënte muizen.
Introduction
Colorectale kanker (CRC) is wereldwijd de tweede belangrijkste doodsoorzaak doorkanker1. Het vermogen om in vitro of in vivo tumormodellen te genereren die zijn afgeleid van tumorcellen van individuele patiënten, heeft de precisiegeneeskunde in de oncologie geavanceerd. In het afgelopen decennium zijn van patiënten afgeleide organoïden (BOB's) of xenotransplantaten (PDX'en) door veel onderzoeksgroepen over de hele wereld gebruikt2. BOB's zijn meercellige in vitro structuren die lijken op de kenmerken van het oorspronkelijke tumorweefsel en zichzelf kunnen organiseren en vernieuwen3. Deze veelbelovende in vitro modellen kunnen met succes worden gebruikt voor het screenen van geneesmiddelen en het faciliteren van translationeel onderzoek. Aan de andere kant geven PDX-modellen getrouw het oorspronkelijke CRC weer op alle relevante niveaus, van histologie tot moleculaire eigenschappen en geneesmiddelrespons 2,4.
In vivo PDX-modellen worden meestal gekweekt als subcutane tumoren in immunodeficiënte muizen. Met behulp van deze aanpak zijn PDX'en de gouden standaard geworden in kankeronderzoek, met name voor het bestuderen van de gevoeligheid of resistentie van geneesmiddelen. CRC-gerelateerde sterfgevallen worden echter meestal geassocieerd met de aanwezigheid van gemetastaseerde laesies in de lever, de longen of de peritoneale holte, en geen van de twee benaderingen (PDO of PDX) kan de geavanceerde klinische setting recapituleren. Bovendien is aangetoond dat de specifieke plaats van tumorgroei belangrijke biologische kenmerken bepaalt die van invloed zijn op de werkzaamheid van geneesmiddelen en de prognose van de ziekte2. Daarom is er dringend behoefte aan het opstellen van preklinische modellen die kunnen worden gebruikt om de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen kanker in een klinisch relevante gemetastaseerde setting te beoordelen6.
Microcomputertomografie (μCT)-scanners kunnen functioneren als verkleinde klinische CT-scanners, die primaire tumor- en metastasebeeldvorming bij muizen bieden met een geschaalde beeldresolutie die evenredig is met die van CT-beelden van kankerpatiënten7. Om het slechte wekedelencontrast van de μCT-techniek tegen te gaan, kunnen radiologische jodiumhoudende contrastmiddelen worden gebruikt om het contrast te verbeteren en de tumorbelasting te evalueren. Met behulp van een dubbele contrastbenadering wordt oraal en intraperitoneaal jodium op verschillende tijdstippen toegediend. Het contrast dat oraal wordt toegediend, helpt bij het bepalen van de grenzen tussen tumorweefsel en blindedarm in de darm. Aan de andere kant maakt het intraperitoneaal toegediende contrast het mogelijk om de externe limieten van de tumormassa te identificeren, die vaak groeit en het peritoneum binnendringt8.
Het manuscript beschrijft een protocol om orthotope implantatie uit te voeren van kankercellen van patiënten in de blindedarmwand van immunodeficiënte muizen, en de methodologie om de groei van darmtumoren te volgen met behulp van μCT-scanning. Het huidige manuscript laat zien dat het model het klinische scenario van gevorderde darmtumoren en gemetastaseerde ziekte bij CRC-patiënten recapituleert die niet kunnen worden bestudeerd met behulp van PDO- of PDXO-modellen. Aangezien orthotope PDX-modellen van CRC het klinische scenario van CRC-patiënten samenvatten, concluderen we dat ze tot nu toe de beste zijn voor het testen van de werkzaamheid van antitumorale geneesmiddelen bij gevorderde darmtumoren en gemetastaseerde ziekte.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Van alle patiënten werd schriftelijke geïnformeerde toestemming verkregen. Het project werd goedgekeurd door de Commissie Onderzoeksethiek van het Universitair Ziekenhuis Vall d'Hebron, Barcelona, Spanje (goedkeuring ID: PR(IR)79/2009 PR(AG)114/2014, PR(AG)18/2018). Menselijke darmweefselmonsters bestonden uit biopsieën van niet-necrotische gebieden met primaire adenocarcinomen of levermetastasen, overeenkomend met patiënten met darm- en endeldarmkanker die tumorresectie ondergingen. De experimenten werden uitgevoerd volgens de dierenverzorgingsrichtlijn van de Europese Unie (86/609/EEG) en werden goedgekeurd door de Ethische Commissie voor Dierproeven van het VHIR-the Vall d'Hebron Research Institute (ID: 40/08 CEEA, 47/08/10 CEEA en 12/18 CEEA).
OPMERKING: Vrouwelijke NOD-SCID (NOD. CB17-Prkdcscid/NcrCrl) muizen vanaf de leeftijd van 8 weken werden gekocht bij Charles River Laboratories.
1. Afleiding van patiëntcellen
- Tumor extractie
OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd in een biologische kast bij kamertemperatuur (RT) in de dierenfaciliteit.- Verkrijg tumormonsters van de operaties of biopsieën van de patiënt en van PDX's die subcutaan groeien bij muizen.
- Bereid voor de orthotope injectie de tumorcellen voor van gevestigde subcutane PDX-tumormodellen in plaats van weefsel dat rechtstreeks van patiënten is verkregen9.
- Genereer PDX-tumoren door subcutaan een suspensie van 1 x 105 tumorcellen in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) (50 μL) gemengd met Matrigel-matrix (50 μL) subcutaan te inoculeren in de flank van NOD-SCID-muizen2.
- Meet de tumorgroei om de dag met een schuifmaat.
OPMERKING: Belangrijk is dat ons laboratorium een biobank van meer dan 350 PDX-modellen heeft gegenereerd. De CRC-PDX-tumormodellen die in het protocol worden gebruikt, zijn gevestigde PDX-modellen in het laboratorium die meer dan drie passages bij muizen zijn geamplificeerd en de inclusie-/exclusiecriteria met een positief resultaat hebben doorstaan (tabel 1).
- Meet de tumorgroei om de dag met een schuifmaat.
- Euthanaseer de muizen door cervicale dislocatie wanneer subcutane tumoren de maximale grootte bereiken die is vastgesteld door de CEEA (1 cm diameter), of wanneer de dieren eindpuntcriteria bereiken.
- Haal de tumor eruit en verwijder deze voorzichtig van de huid en het omliggende niet-tumorweefsel met een schaar en een pincet.
- Bewaar de geoogste tumoren in PBS bij 4 °C tot de volgende stap.
OPMERKING: Dissocieer de tumoren in celsuspensie zo snel mogelijk na verwijdering van hun oorspronkelijke locatie in de laesies van de patiënt of subcutane xenotransplantaten bij muizen. De levensvatbaarheid van de cellen is 24 uur na weefselverwijdering aanzienlijk verminderd, wat resulteert in een inefficiënte implantatie bij ontvangende muizen.
- Cel voorbereiding
OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd in een biologische kast bij kamertemperatuur (RT) in de weefselkweekruimte.- Dissocieer de tumoren met behulp van een mesje in een kweekplaat van 10 cm met 1 ml volledig CoCSCM 6Ab-medium (tabel 2) (om het hakken te vergemakkelijken). Plaats het homogene gedissocieerde monster in een conische buis van 15 ml.
- Voeg volledig CoCSCM 6Ab medium toe aan een eindvolume van 5 ml (gebruik niet meer dan 3 ml gedissocieerd monster in hetzelfde buisje).
OPMERKING: Primaire CRC die bij patiënten wordt verwijderd, is van nature besmet met bacteriën en schimmels. Het is essentieel om ziekteverwekkers die aanwezig zijn in het oorspronkelijke patiëntmonster te verwijderen met behulp van een cocktail van zes antibiotica (penicilline, streptomycine, fungizone, kanamycine, gentamycine en nystatine). Injectie van tumorcellen die besmet zijn met bacteriën bij immunodeficiënte muizen kan leiden tot de dood van dieren. - Incubeer met 50 μL DNase I (0,08 kU/ml) en 50 μL collagenase (1,5 mg/ml) (verteringsmedium; Tabel 2) gedurende 1 uur bij 37 °C in een celkweekincubator, op een 45°-positie. Meng de oplossing elke 15 minuten goed met een pipet van 5 ml vóór de incubatie.
OPMERKING: Dissocieer het tumorweefsel en verteer het door meerdere keren te pipetteren om een eencellige oplossing te verkrijgen. Dit is essentieel voor het tellen van de cellen voordat ze in ontvangende muizen worden geïnjecteerd en dus voor het bereiken van een homogene implantatie van tumorcellen. - Voeg 5 ml volledig CoCSCM 6Ab medium toe en meng goed met een pipet van 5 ml.
- Sorteer de oplossing met een celzeef van 100 μm met behulp van een nieuwe steriele buis van 50 ml.
- Draai de gesorteerde cellen op 500 x g gedurende 8 minuten bij RT.
- Aspireer de supernatant.
- Resuspendeer de pellet in 3 ml 1x RBC lysisbufferoplossing.
- Incubeer gedurende 10 minuten bij RT.
- Voeg 3 ml volledig CoCSCM 6Ab medium toe, pipet het monster en draai gedurende 10 minuten op 500 x g bij RT. Zuig het supernatant op.
- Resuspendeer de pellet met 5-10 ml volledig CoCSCM 6Ab-medium en gebruik een cellenteller om het totale aantal cellen te berekenen.
- Draai de cellen gedurende 10 minuten op 500 x g bij RT en resuspendeer in 10 ml PBS.
- Resuspendeer de pellet tot een concentratie van 20 x 106 cellen/ml en meng goed om een homogene celsuspensie te verkrijgen.
- Bereid spuiten van 29 G (0,5 ml U 100 naald, 0,33 mm [29 G] x 12,7 mm) voor op blindedarminjectie in de weefselkweek (één spuit/muis). Laad 50 μL van de tumorcelsuspensie (1 x 106 cellen/injectie) in de spuit en bewaar deze op ijs. Zorg ervoor dat luchtbellen uit de celsuspensie worden verwijderd.
OPMERKING: Het elimineren van luchtbellen wanneer de tumorcellen in de spuit worden geladen, is essentieel om injectie van een te groot volume in de blindedarmwand te voorkomen, wat kan leiden tot weefselbreuk en monsterverlies. Het is absoluut noodzakelijk om de celsuspensie goed te mengen bij het laden van de spuit om ongelijke tumorgrootte bij muizen in hetzelfde experiment te voorkomen.
2. Orthotope injectie in blindedarm
OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd op een werkbank in een specifieke pathogeenvrije (SPF) ruimte in de dierenfaciliteit. De gebruikte apparatuur is vooraf gereinigd en gesteriliseerd. Bovendien wordt het opnieuw gesteriliseerd in een draagbare sterilisator tussen personen of zones in de dierenfaciliteit.
- Reinig de operatieplaats door te besproeien met desinfecterend schoonmaakmiddel en af te vegen.
- Ontharen van de buik van de muis met behulp van een muizenontharingsmachine.
- Plaats de muis in rugligging. Gebruik 2% isofluraan om het dier te verdoven. Bevestig het effect van anesthesie door zachtjes in de extremiteit te knijpen en de afwezigheid van stimulatie te observeren.
- Breng een druppel veterinaire zalf van 50-100 μL (3 mg/g Lacryvisc) in de ogen om uitdroging tijdens de anesthesie te voorkomen.
- Desinfecteer de buik van de muis door meerdere keren in een cirkelvormige beweging te schrobben met chloorhexidine of povidonjodium.
- Maak een incisie in de lengterichting van 1 cm over de onderbuik met behulp van een operatieschaar. Scheid de huid zorgvuldig op elke plaats om het buikvlies dat zich onder de huid bevindt te presenteren.
- Maak een incisie van 0,5-1 cm in het buikvlies, groot genoeg om de blindedarm naar buiten te brengen.
OPMERKING: Exterioriseer de blindedarm zonder de inwendige organen overmatig te manipuleren, wat de dodelijkheid van de procedure dramatisch zou kunnen verhogen. - Isoleer de blindedarm zorgvuldig van de muis met behulp van een voorgesneden, steriel gaasje.
- Bevochtig de blindedarm gedurende de hele procedure met een zoutoplossing.
- Immobiliseer de blindedarm door deze voorzichtig met een tang vast te pakken en breng de naald oppervlakkig in de blindedarmwand. Vermijd haarvaten en bloedvaten op de injectieplaats. Verwijder luchtbellen uit de celsuspensie.
- Injecteer langzaam de hele 50 μL tumorcelsuspensie. Het duurt meestal ongeveer 10 seconden om toe te dienen. Vermijd het perforeren van het blindedarmlumen met de naald, omdat dit resulteert in de eliminatie van de tumorcelsuspensie uit het lichaam via de darmperistaltiek.
OPMERKING: Het injecteren van de tumorcelsuspensie in de blindedarm van de muizen is de meest uitdagende stap van de hele procedure. In dit deel van het protocol moet een fel licht worden gebruikt dat gericht is op de injectieplaats en een vergrotende loep. Breng de naald evenwijdig aan het oppervlak van de blindedarm in. De blindedarm is een zeer kwetsbaar weefsel; Daarom moet immobilisatie van de blindedarm worden uitgevoerd met behulp van een chirurgische pincet en door lichte druk uit te oefenen om weefselbreuk te voorkomen die tot bloeding leidt. Succesvolle implantatie resulteert in een witte bel (korrel van cellen) in de blindedarmwand. Als de bel niet kan worden gevisualiseerd, kan dit erop wijzen dat de blindedarm is geperforeerd en dat de cellen zijn geëindigd in het blindedarmlumen, waardoor ze door het darmkanaal worden opgeruimd. - Verwijder na de injectie langzaam de naald uit de blindedarm en oefen lichte druk uit op de injectieplaats met een applicator met wattenstaafjes, om te voorkomen dat tumorcellen ontsnappen en lichte bloedingen te verminderen.
- Reinig de blindedarm met een zoutoplossing om vuil te verwijderen.
- Breng de blindedarm terug in de buik van het dier.
- Sluit het buikvlies met 5/0 hechtingen.
- Sluit de huid van de buik met 5/0 hechtingen.
- Dien postoperatieve antibiotica (100 mg/kg amoxicilline of 20 mg/kg enrofloxacine) en analgetica (5 mg/ml metacam/meloxicam) toe door middel van subcutane injectie. Leg de muizen op een verwarmingskussen en houd ze daar totdat ze volledig hersteld zijn. Breng ze vervolgens terug naar de kooi met andere dieren.
3. Evaluatie van orthotope tumorgroei met behulp van μCT-scanning
OPMERKING: De volgende procedure wordt uitgevoerd in het preklinische beeldvormingsplatform (PIP) van de dierfaciliteit.
- Voer alle dierproeven uit volgens de voorschriften van de ethische commissie van de instelling.
- Begin 2 weken na celinjectie met het monitoren van het tumorvolume met μCT en daarna elke week.
- Verdun het contrastmiddel iopamiro (300 mg/ml) vers in een zoutoplossing, in een verhouding van 3:1 voor beide doses. Dien 300 ml iopamiro toe via een orale maagsonde.
OPMERKING: Vanwege het slechte wekedelencontrast van de μCT wordt een contrastmiddel aanbevolen om de gevoeligheid van de techniek te verbeteren. Het protocol omvat een orale toediening van een op jodium gebaseerd middel (iopamiro) om de intraluminale tumorbelasting af te bakenen, en een secundaire intraperitoneale toediening van hetzelfde middel om de tumorbelasting in het viscerale gezicht van de darm te definiëren. Er zijn eerder pilot-experimenten uitgevoerd om de exacte tijd te bepalen die het contrastmiddel nodig heeft om bij de blindedarm van muizen aan te komen voordat het wordt geëlimineerd. In het geval van iopamiro is het ongeveer 2 uur. - Dien na 2 uur een intraperitoneale injectie toe van 300 ml eerder verdunde iopamiro. De toediening helpt bij het bepalen van de tumorlimieten in het pariëtale gezicht.
- Verdoof de dieren met 2% isofluraan.
- Nadat u hebt bevestigd dat het dier correct is verdoofd door in de voet van de muis te knijpen, plaatst u het dier in het scanbed van de μCT. De beste positie is rugligging (met de voorkant naar boven).
- Start in de besturingssoftware de live-modus (fluoroscopiemodus) om de buikstreek in het gezichtsveld (FOV) van de scanner te plaatsen. Beweeg daarvoor het bed naar voren en naar achteren en zijwaarts totdat de gewenste positie is bereikt. Draai de röntgenbuis en de detector 90° en beweeg het scanbed in de y-as om het dier volledig te centreren.
- Gebruik de volgende parameters voor de μCT-scanbeelden: 30 mm gezichtsveld, 26 s acquisitietijd, 90 kV stroomspanning en 200 μA stroomsterkte, met behulp van een FX μCT-beeldvormingssysteem.
- Breng de dieren terug naar hun kooien om te herstellen wanneer de scan is voltooid. Zorg voor thermische ondersteuning en bewaak de dieren totdat ze herstellen van de anesthesie voordat ze terugkeren naar de huisvesting.
- De μCT-acquisitie levert een bestand op van 250 Mb per scan. De aangemaakte gegevensbestanden hebben een VOX-formaat. Om ze toegankelijk te maken voor alle beeldvormingsanalysesoftware, converteert u de bestanden naar DICOM-formaat met behulp van de databasebeheersoftware van de μCT. Sla de batch gemaakte bestanden op een draagbare harde schijf op om ze te analyseren met behulp van elke computer met beschikbare beeldvormingssoftware.
OPMERKING: Tijdens beeldanalyse is de blindedarm gelokaliseerd als een verwijde darm met een radiodense inhoud (iopamiro), vaak aan de linkerkant van de caudale buik. In de viscerale buiging van de blindedarm wordt een wandverdikking waargenomen in vergelijking met de aangrenzende darmgebieden. De verdikking komt overeen met tumorgroei. - Zodra de tumor is gelokaliseerd, zoekt u de hoogste diameter in de verschillende weergaven (axiaal, coronaal en sagittaal). Meet deze drie assen en bereken het tumorvolume volgens de ellipsoïde formule: volume = 4/3π x (x-halve as x y-halve as x z-halve as)10.
4. Therapeutische interventie bij muizen met orthotope tumoren
- Controleer wekelijks de muizen met orthotope tumoren.
- Wanneer bij de meeste muizen een μCT-scansignaal van de tumor wordt gedetecteerd, voert u de volgende week nog een μCT-scan uit om de aanwezigheid van de tumor te bevestigen.
OPMERKING: De tijd om de behandeling te starten is afhankelijk van het gebruikte PDX-model en varieert van 3-12 weken na inoculatie van tumorcellen in de blindedarm. - Randomiseer de muizen in vier groepen: een vehiculumgroep (n = 10-15 muizen), een testgroep voor geneesmiddelen (n = 10-15 muizen), een standaardbehandelingsgroep voor chemotherapie (n = 10-15 muizen) en een combinatiebehandelingsgroep (n = 10-15 muizen).
- Behandel de muizen intraperitoneaal met zoutoplossing (mediumgroep), het testgeneesmiddel (20 mg/kg) (testgeneesmiddelgroep), irinotecan (50 mg/kg) (standaardzorggroep) of het testgeneesmiddel (20 mg/kg) met irinotecan (50 mg/kg) (combinatiebehandelingsgroep). Voer de toediening één keer per week uit tot het einde van het experiment.
- Controleer de tumorgroei wekelijks door middel van μCT-scanning in de loop van het experiment.
- Aan het einde van het experiment euthanaseer je de muizen door cervicale dislocatie en verzamel je levers, longen en andere mogelijke laesies in andere organen.
- Voeg de weefselmonsters toe aan cassettes en incubeer ze een nacht in 4% formaline. Gebruik darmweefsel van een muis zonder tumor in de blindedarm als controle.
- Verwijder de cassettes van formaline en incubeer met 70% ethanol gedurende ten minste 3 uur.
- Sluit de cassettes in met paraffine, met behulp van standaardprotocollen voor histopathologiefaciliteiten.
- Voer hematoxyline- en eosinekleuring (H&E) uit de blindedarm, lever en longen uit, met behulp van standaardprotocollen voor histopathologiefaciliteiten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Muizen die orthotopisch waren geïmplanteerd met kankercellen van de patiënt werden wekelijks gecontroleerd door middel van μCT-scans. Aan het einde van het experiment werden de dieren geëuthanaseerd. Darmen, ceca (figuur 1A,B), levers, longen en andere mogelijke laesies werden verzameld, opgenomen in een cassette en 's nachts gefixeerd met 4% formaline. Darmweefsel van een muis zonder tumor in de blindedarm werd gebruikt als controle (Figuur 1C). Ten slotte werden de cassettes gedurende ten minste 3 uur vervangen door 70% ethanol en werd er paraffine ingebed. Hematoxyline- en eosine (H&E)-kleuring van ceca, levers en longen werden uitgevoerd met behulp van standaardprotocollen van histopathologische faciliteiten om tumorcellen te identificeren (Figuur 2, Figuur 3 en Figuur 4).
In een ander experiment werden muizen met orthotope tumoren wekelijks gecontroleerd. Toen bij de meeste muizen (ongeveer 2-4 weken, afhankelijk van het PDX-model) een tumor μCT-scansignaal werd gedetecteerd, werden de dieren gerandomiseerd in vier groepen en behandeld met ofwel het vehiculum, het testmedicijn (20 mg/kg), de standaardbehandeling chemotherapie irinotecan (50 mg/kg) of het testmedicijn met irinotecan. De medicijnen werden eenmaal per week intraperitoneaal toegediend tot het einde van het experiment. De tumorgroei werd in de loop van het experiment wekelijks gecontroleerd door middel van μCT-scanning. De resultaten gaven aan dat het testgeneesmiddel een vermindering van het tumorvolume induceerde, berekend door de μCT-scanbeelden, en dat dit werd versterkt in combinatie met behandeling met irinotecan (Figuur 5 en Figuur 6).
Eerdere studies in ons lab hebben aangetoond dat de metastatische potentiaal (carcinomatose, long- en levermetastase) van de orthotope CRC-PDX-modellen afhankelijk is van het gebruikte PDX-model (tabel 3)2. In de huidige studie werd ook de therapeutische werkzaamheid op de vorming van metastasen geëvalueerd. De resultaten gaven aan dat het testmedicijn, irinotecan, en de combinatie de vorming van long- en levermetastasen bij behandelde muizen uitroeiden (tabel 4)11.
Figuur 1: Macroscopische beelden van de darm van muizen met orthotope CRC-PDX-tumoren. Macroscopische darmbeelden van twee muizen met een orthotope PDX-tumor (A,B) aan het einde van het experiment. Blindedarmtumoren worden in de afbeeldingen in rood gedefinieerd. (C) Een darmbeeld van een muis zonder tumor in de blindedarm als controle. Schaalbalken = 5 mm (A,B); 1 cm (C). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Histologische beelden van orthotope CRC-PDX-tumoren. H&E-kleuring van een PDX-tumormodel in de blindedarm aan het einde van het experiment bij lage (A) en hoge (a) vergroting. Blindedarmtumoren worden in de afbeeldingen in rood gedefinieerd. Schaalbalken = 2,5 mm (A); 100 mm (a). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Histologische beelden van longmetastasen afgeleid van orthotope CRC-PDX-tumor H&E-kleuring van een long van een muis met een orthotope PDX-tumor. Longmetastasen kunnen worden waargenomen bij lage (A) en hoge (a) vergroting. Longmetastasen worden op de afbeeldingen in rood weergegeven. Schaalbalken = 250 mm (A); 100 mm (a). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Histologische beelden van levermetastasen afgeleid van orthotope CRC-PDX-tumoren. H&E-kleuring van een lever van een muis met een orthotope PDX-tumor. Levermetastasen kunnen worden waargenomen bij lage (A) en hoge (a) vergroting. Levermetastasen worden in de afbeeldingen in rood weergegeven. Schaalbalken worden aangegeven in de afbeeldingen. Schaalstaven = 500 mm (A); 50 mm (a). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Therapeutische werkzaamheid van een testgeneesmiddel in een orthotopisch CRC-PDX-model. Voorbeeld van een experiment met vier groepen (medium, testdrug, irinotecan en testdrug met irinotecan)11. Het tumorvolume verkregen uit de μCT-scanbeelden wordt weergegeven in de tijd (A) en aan het einde van het experiment (dag 42) (B). Staven, ± SE (n = 15-30) en *p < 0,05, ***p < 0,001, ****p < 0,0001 versus voertuig (t-toets, tweezijdig). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: μCT-beelden van muizen met orthotope CRC-PDX-tumoren in behandeling. Representatieve μCT-beelden van muizen met orthotope tumoren die zijn behandeld met een therapeutisch geneesmiddel. De blindedarm (rood) en tumormassa (blauw) zijn gedefinieerd in de afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Vaststelling van de subcutane PDX. Voorbeeld van drie PDX-modellen die in het laboratorium zijn opgesteld (P1, P2 en P3) uit onze biobank2 van meer dan 350 PDX-modellen met het aantal geïnoculeerde cellen, de incidentie van PDX-vestiging en de passages bij muizen. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: Reagentia voor de bereiding van de groeifactoren (GF) MIX 10X, de CoCSCM 6Ab zonder EGF, FGF2 en groeifactoren, het CoCSCM 6Ab complete medium en het digestiemedium. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Metastatisch potentieel van orthotope CRC-PDX-modellen. Voorbeeld van drie orthotope CRC-PDX-modellen die in het laboratorium zijn opgesteld (P1, P2 en P3) uit onze biobank2. Hier worden het aantal geïnoculeerde cellen, de incidentie van blindedarmtumorvorming en de incidentie om carcinomatose, longmetastase of levermetastase te genereren, aangegeven. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: Therapeutische metastatische werkzaamheid van een testgeneesmiddel in een orthotopisch CRC-PDX-model. Voorbeeld van een experiment met vier groepen (medium, testdrug, irinotecan en testdrug met irinotecan)11. Hier wordt het aantal muizen in elke groep aangegeven en welke van hen aan het einde van het experiment carcinomatose, longmetastase of levermetastase ontwikkelden. Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In de afgelopen decennia zijn er veel nieuwe antikankertherapieën ontwikkeld en getest bij patiënten met verschillende tumortypes, waaronder colorectale kanker (CRC). Hoewel in veel gevallen veelbelovende resultaten in preklinische modellen zijn waargenomen, is de therapeutische werkzaamheid bij patiënten met gevorderde gemetastaseerde CRC vaak beperkt. Daarom is er dringend behoefte aan preklinische modellen die het mogelijk maken om de werkzaamheid van nieuwe therapeutische geneesmiddelen te testen in een klinisch relevant metastatisch scenario.
Het manuscript beschrijft in detail een geavanceerd CRC orthotope PDX-model op basis van de implantatie van tumorcellen van patiënten in de blindedarmwand van immunodeficiënte muizen12.
De methodiek is tijdrovend en vergt concentratie. Gemiddeld kan de injectie van een experiment met 30 muizen in totaal ongeveer 11 uur duren, waaronder: 1) PDX-tumorverzameling (1 uur); tumorverwerking (4 uur); en blindedarm implantatie (6 uur). De procedure moet worden uitgevoerd in steriele omstandigheden, waarbij de tijd voor tumorverwerking en injectie tot een minimum wordt beperkt, terwijl inwendige organen zeer zorgvuldig worden gemanipuleerd om operatiegerelateerde sterfte te voorkomen. Het wordt daarom ten zeerste aanbevolen om verschillende pilot-experimenten uit te voeren met tumorcellijnen of PDX-cellen, om de onderzoekers op te leiden en vertrouwd te maken met de procedure. Bovendien moeten twee onderzoekers bij de procedure betrokken zijn, één om de tumor te verzamelen en te verwerken, evenals te helpen met de hechtingen van de dieren, en de andere om de eigenlijke operatie uit te voeren.
Het is ook belangrijk om te bedenken dat blindedarmtumoren kunnen uitgroeien tot in het lumen van de darm of in de blindedarm, afhankelijk van het PDX-model en de specifieke plaats van de injectie. De uitkomst van de tumorgroei is moeilijk te controleren en kan de overleving van de muizen dramatisch beïnvloeden, wat resulteert in kleinere tumoren en een ernstige darmobstructie wanneer de tumoren in het lumen groeien. De muizen moeten daarom wekelijks worden gecontroleerd, vanaf de week na celimplantatie. Zodra de meeste muizen een tumorsignaal vertonen door de μCT-scan, moeten dieren zonder signaal worden uitgesloten en de rest worden gerandomiseerd in experimentele groepen op basis van tumorvolume. Om statistisch significante resultaten te verkrijgen, moet elke experimentele groep 12-15 muizen bevatten.
Het monitoren van tumordragende muizen is essentieel om de werkzaamheid van nieuwe therapeutische middelen in klinisch relevante orthotope modellen te bepalen. μCT-scans maken de identificatie en kwantificering van het primaire tumorvolume bij muizen mogelijk. Het gebruik van een dubbel contrast verhoogt de gevoeligheid van de μCT-techniek aanzienlijk, waardoor de kwaliteit van de beelden wordt verbeterd8. De groei van tumorcellen in de blindedarm kan leiden tot intraluminale tumoren als ze naar het lumen van de darm groeien, of extraluminale tumoren als ze uit het lumen van de darm groeien. Beide scenario's zijn waargenomen met de vorige methodologie en zijn afhankelijk van het gebruikte PDX-model en de injectieplaats. De muizen herstelden volledig van het scannen, zonder klinisch bewijs van nierbeschadiging of andere incidenten. De resultaten tonen aan dat μCT-beeldvorming een nuttig hulpmiddel kan zijn voor het monitoren van de ontwikkeling en longitudinale groei van CRC.
Orthotope modellen geven een nauwkeurige samenvatting van klinische CRC12 en zijn zeer nuttig om het effect van nieuwe therapeutische geneesmiddelen op primaire tumorgroei en lever- en longmetastasen te testen. Het is echter mogelijk dat een gedetailleerd schriftelijk protocol niet voldoende is voor een nieuwe onderzoeksgroep om dergelijke complexe modellen op te stellen. Als reactie hierop is de huidige video bedoeld om onderzoeksgroepen te begeleiden bij het implementeren van deze procedure in hun onderzoek. Het toont de implantatieprocedure van cellen in de blindedarmwand van immunodeficiënte muizen en de methodologie om de groei van darmtumoren te volgen met behulp van μCT-scanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen.
Acknowledgments
We danken de Cellex Foundation, het CIBERONC-netwerk en het Instituto de Salud Carlos III voor hun steun. Bovendien bedanken we ook het preklinische beeldvormingsplatform van het Vall d'Hebron Research Institute (VHIR), waar de experimenten werden uitgevoerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | - | - | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | - | - | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | - | - | |
| Heating pad | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
- Sung, H., et al. Global Cancer Statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).
- Puig, I., et al. A personalized preclinical model to evaluate the metastatic potential of patient-derived colon cancer initiating cells. Clinical Cancer Research. 19 (24), 6787-6801 (2013).
- Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
- Byrne, A. T., et al. Interrogating open issues in cancer precision medicine with patient-derived xenografts. Nature Reviews. Cancer. 17 (4), 254-268 (2017).
- Vatandoust, S., Price, T. J., Karapetis, C. S. Colorectal cancer: Metastases to a single organ. World Journal of Gastroenterology. 21 (41), 11767-11776 (2015).
- Cespedes, M. V., et al. Orthotopic microinjection of human colon cancer cells in nude mice induces tumor foci in all clinically relevant metastatic sites. The American Journal of Pathology. 170 (3), 1077-1085 (2007).
- Durkee, B. Y., Weichert, J. P., Halberg, R. B.
- Boll, H., et al. Double-contrast micro-CT colonoscopy in live mice. International Journal of Colorectal Disease. 26 (6), 721-727 (2011).
- O'Brien, C. A., Pollett, A., Gallinger, S., Dick, J. E. A human colon cancer cell capable of initiating tumour growth in immunodeficient mice. Nature. 445 (7123), 106-110 (2007).
- Jensen, M. M., Jorgensen, J. T., Binderup, T., Kjaer, A. Tumor volume in subcutaneous mouse xenografts measured by microCT is more accurate and reproducible than determined by 18F-FDG-microPET or external caliper. BMC Medical Imaging. 8, 16 (2008).
- Herpers, B., et al. Functional patient-derived organoid screenings identify MCLA-158 as a therapeutic EGFR x LGR5 bispecific antibody with efficacy in epithelial tumors. Nature Cancer. 3 (4), 418-436 (2022).
- Chicote, I., Camara, J. A., Palmer, H. G. Advanced colorectal cancer orthotopic patient-derived xenograft models for cancer and stem cell research. Methods in Molecular Biology. 2171, 321-329 (2020).
