Summary
यह प्रोटोकॉल इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों की सीकुम दीवार में रोगी-व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक आरोपण का वर्णन करता है। मॉडल उन्नत कोलोरेक्टल कैंसर मेटास्टैटिक बीमारी को पुन: उत्पन्न करता है और फेफड़ों और यकृत मेटास्टेस के नैदानिक रूप से प्रासंगिक परिदृश्य में नई चिकित्सीय दवाओं के मूल्यांकन की अनुमति देता है।
Abstract
पिछले दशक में, रोगी-व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं और 3 डी ट्यूमरोइड्स का उपयोग करके अधिक परिष्कृत प्रीक्लिनिकल कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) मॉडल स्थापित किए गए हैं। चूंकि रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर ऑर्गेनोइड मूल ट्यूमर की विशेषताओं को बनाए रख सकते हैं, इसलिए ये विश्वसनीय प्रीक्लिनिकल मॉडल कैंसर की दवा स्क्रीनिंग और दवा प्रतिरोध तंत्र के अध्ययन को सक्षम करते हैं। हालांकि, रोगियों में सीआरसी से संबंधित मृत्यु ज्यादातर मेटास्टैटिक बीमारी की उपस्थिति से जुड़ी होती है। इसलिए विवो मॉडल में प्रासंगिक कैंसर-विरोधी उपचारों की प्रभावकारिता का मूल्यांकन करना आवश्यक है जो वास्तव में मानव कैंसर मेटास्टेसिस की प्रमुख आणविक विशेषताओं को पुन: प्रस्तुत करते हैं। हमने सीआरसी रोगी-व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं के इंजेक्शन के आधार पर एक ऑर्थोटोपिक मॉडल स्थापित किया है जो सीधे चूहों की सीकुम दीवार में है। ये ट्यूमर कोशिकाएं सीकुम में प्राथमिक ट्यूमर विकसित करती हैं जो यकृत और फेफड़ों को मेटास्टेसाइज करती हैं, जो अक्सर उन्नत सीआरसी वाले रोगियों में देखी जाती हैं। इस सीआरसी माउस मॉडल का उपयोग माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी (μCT) द्वारा निगरानी की गई दवा प्रतिक्रियाओं का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है, एक नैदानिक रूप से प्रासंगिक छोटे पैमाने पर इमेजिंग विधि जो आसानी से रोगियों में प्राथमिक ट्यूमर या मेटास्टेस की पहचान कर सकती है। यहां, हम इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों की सीकुम दीवार में रोगी-व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं को प्रत्यारोपित करने के लिए शल्य चिकित्सा प्रक्रिया और आवश्यक पद्धति का वर्णन करते हैं।
Introduction
कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) दुनिया भर में कैंसर से होने वाली मौतों का दूसरा प्रमुख कारण है। व्यक्तिगत रोगी ट्यूमर कोशिकाओं से प्राप्त इन विट्रो या विवो ट्यूमर मॉडल में उत्पन्न करने की क्षमता ऑन्कोलॉजी में उन्नत सटीक दवा है। पिछले दशक में, रोगी व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स (पीडीओ) या जेनोग्राफ्ट्स (पीडीएक्स) का उपयोग दुनिया भर के कई शोध समूहों द्वारा किया गया है। पीडीओ बहुकोशिकीय इन विट्रो संरचनाएं हैं जो मूल ट्यूमर ऊतक की विशेषताओं से मिलती-जुलती हैं और स्व-व्यवस्थित और आत्म-नवीनीकरण कर सकतीहैं। इन आशाजनक इन विट्रो मॉडल का उपयोग सफलतापूर्वक दवा स्क्रीनिंग और ट्रांसलेशनल अनुसंधान की सुविधा के लिए किया जा सकता है। दूसरी ओर, पीडीएक्स मॉडल सभी प्रासंगिक स्तरों पर मूल सीआरसी को ईमानदारी से पुन: प्रस्तुत करते हैं, हिस्टोलॉजी से आणविक लक्षण और दवा प्रतिक्रिया 2,4 तक।
विवो में । पीडीएक्स मॉडल ज्यादातर इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों में चमड़े के नीचे ट्यूमर के रूप में उगाए जाते हैं। इस दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, पीडीएक्स कैंसर अनुसंधान में स्वर्ण मानक बन गए हैं, विशेष रूप से दवा संवेदनशीलता या प्रतिरोध का अध्ययन करने के लिए। हालांकि, सीआरसी से संबंधित मौतें ज्यादातर यकृत, फेफड़े या पेरिटोनियल गुहा में मेटास्टैटिक घावों की उपस्थिति से जुड़ी होती हैं, और दोनों दृष्टिकोणों (पीडीओ या पीडीएक्स) में से कोई भी उन्नत नैदानिक सेटिंग को पुन: उत्पन्न नहीं कर सकता है। इसके अलावा, ट्यूमर के विकास की विशिष्ट साइट को महत्वपूर्ण जैविक विशेषताओं को निर्धारित करने के लिए दिखाया गया है जो दवा प्रभावकारिता और रोग के पूर्वानुमान2 पर प्रभाव डालते हैं। इसलिए, प्रीक्लिनिकल मॉडल स्थापित करने की तत्काल आवश्यकता है जिसका उपयोग नैदानिक रूप से प्रासंगिक मेटास्टैटिक सेटिंग6 में एंटीकैंसर दवाओं की प्रभावकारिता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।
माइक्रोकंप्यूटेड टोमोग्राफी (μCT) स्कैनर स्केल-डाउन क्लिनिकल सीटी स्कैनर के रूप में कार्य कर सकते हैं, जोकैंसर रोगियों की सीटी छवियों के आनुपातिक स्केल छवि रिज़ॉल्यूशन पर चूहों में प्राथमिक ट्यूमर और मेटास्टेसिस इमेजिंग प्रदान करते हैं। μCT तकनीक के खराब नरम ऊतक कंट्रास्ट का मुकाबला करने के लिए, रेडियोलॉजिकल आयोडीनयुक्त कंट्रास्ट एजेंटों का उपयोग कंट्रास्ट को बेहतर बनाने और ट्यूमर के बोझ का मूल्यांकन करने के लिए किया जा सकता है। दोहरे विपरीत दृष्टिकोण का उपयोग करते हुए, मौखिक और इंट्रापरिटोनियल आयोडीन को अलग-अलग समय पर प्रशासित किया जाता है। मौखिक रूप से प्रशासित विपरीत आंत्र के अंदर ट्यूमर ऊतक और सीकुम सामग्री के बीच की सीमाओं को परिभाषित करने में मदद करता है। दूसरी ओर, इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित कंट्रास्ट ट्यूमर द्रव्यमान की बाहरी सीमाओं की पहचान के लिए अनुमति देता है, जो अक्सर बढ़ता है और पेरिटोनियम8 पर आक्रमण करता है।
पांडुलिपि में इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों की सीकुम दीवार में रोगी-व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं के ऑर्थोटोपिक प्रत्यारोपण करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन किया गया है, और μCT स्कैनिंग का उपयोग करके आंतों के ट्यूमर के विकास की निगरानी करने के लिए पद्धति। वर्तमान पांडुलिपि से पता चलता है कि मॉडल सीआरसी रोगियों में उन्नत आंतों के ट्यूमर और मेटास्टैटिक बीमारी के नैदानिक परिदृश्य को पुन: प्रस्तुत करता है जिसे पीडीओ या पीडीएक्सओ मॉडल का उपयोग करके अध्ययन नहीं किया जा सकता है। चूंकि सीआरसी के ऑर्थोटोपिक पीडीएक्स मॉडल सीआरसी रोगियों के नैदानिक परिदृश्य को फिर से परिभाषित करते हैं, इसलिए हम निष्कर्ष निकालते हैं कि वे उन्नत आंतों के ट्यूमर और मेटास्टैटिक बीमारी में एंटी-ट्यूमरल दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने के लिए आज तक सबसे अच्छे हैं।
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Protocol
सभी रोगियों से लिखित सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। परियोजना को वाल डी'हेब्रोन यूनिवर्सिटी अस्पताल, बार्सिलोना, स्पेन की अनुसंधान आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था (अनुमोदन आईडी: पीआर (आईआर) 79/2009 पीआर (एजी) 114/2014, पीआर (एजी) 18/2018)। मानव बृहदान्त्र ऊतक के नमूनों में प्राथमिक एडेनोकार्सिनोमा या यकृत मेटास्टेस के गैर-नेक्रोटिक क्षेत्रों से बायोप्सी शामिल थी, जो बृहदान्त्र और मलाशय के कैंसर वाले रोगियों के अनुरूप थी, जो ट्यूमर रिसेक्शन से गुजरे थे। यूरोपीय संघ के पशु देखभाल निर्देश (86/609 / ईईसी) के बाद प्रयोग किए गए थे और वीएचआईआर-द वाल डी'हेब्रोन रिसर्च इंस्टीट्यूट (आईडी: 40/08 सीईईए, 47/08/10 सीईईए और 12/18 सीईईए) के पशु प्रयोग की नैतिक समिति द्वारा अनुमोदित किए गए थे।
नोट: महिला एनओडी-एससीआईडी (एनओडी। 8 सप्ताह की उम्र से CB17-Prkdcscid / NCRCRL) चूहों को चार्ल्स रिवर प्रयोगशालाओं से खरीदा गया था।
1. रोगी कोशिकाओं की व्युत्पत्ति
- ट्यूमर निष्कर्षण
नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया पशु सुविधा में कमरे के तापमान (आरटी) पर एक जैविक कैबिनेट में की जाती है।- रोगियों की सर्जरी या बायोप्सी से और चूहों में चमड़े के नीचे बढ़ने वाले पीडीएक्स से ट्यूमर के नमूने प्राप्त करें।
- ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन के लिए, रोगियों से सीधे प्राप्त ऊतक के बजाय स्थापित चमड़े के नीचे पीडीएक्स ट्यूमर मॉडल से ट्यूमर कोशिकाओं को तैयार करें।
- एनओडी-एससीआईडी चूहों2 के फ्लैंक में चमड़े के नीचे मैट्रिगेल मैट्रिक्स (50 μL) के साथ मिश्रित फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (50 μL) में 1 x 105 ट्यूमर कोशिकाओं के निलंबन को इंजेक्ट करके पीडीएक्स ट्यूमर उत्पन्न करें।
- हर दूसरे दिन कैलिपर का उपयोग करके ट्यूमर के विकास को मापें।
नोट: महत्वपूर्ण रूप से, हमारी प्रयोगशाला ने 350 से अधिक पीडीएक्स मॉडल का बायोबैंक उत्पन्न किया है। प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले सीआरसी-पीडीएक्स ट्यूमर मॉडल प्रयोगशाला में पीडीएक्स मॉडल स्थापित किए गए हैं जिन्हें चूहों में तीन से अधिक मार्ग प्रवर्धित किया गया है, और सकारात्मक परिणाम के साथ समावेश / बहिष्करण मानदंड पारित किया गया है (तालिका 1)।
- हर दूसरे दिन कैलिपर का उपयोग करके ट्यूमर के विकास को मापें।
- गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु करें जब चमड़े के नीचे के ट्यूमर सीईईए (1 सेमी व्यास) द्वारा स्थापित अधिकतम आकार तक पहुंच जाते हैं, या जब जानवर समापन बिंदु मानदंड तक पहुंचते हैं।
- ट्यूमर निकालें और कैंची और बल का उपयोग करके त्वचा और आसपास के गैर-ट्यूमर ऊतक से इसे सावधानीपूर्वक हटा दें।
- अगले चरण तक पीबीएस में काटे गए ट्यूमर को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
नोट: चूहों में रोगियों के घावों या चमड़े के नीचे के जेनोग्राफ्ट्स में उनके मूल स्थान से हटाने के बाद जितनी जल्दी हो सके सेल निलंबन में ट्यूमर को अलग करें। ऊतक हटाने के 24 घंटे बाद सेल व्यवहार्यता काफी कम हो जाती है, जिसके परिणामस्वरूप प्राप्तकर्ता चूहों में एक अक्षम आरोपण होता है।
- सेल की तैयारी
नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया ऊतक संवर्धन कक्ष में कमरे के तापमान (आरटी) पर एक जैविक कैबिनेट में की जाती है।- 10 सेमी कल्चर प्लेट में ब्लेड का उपयोग करके ट्यूमर को 1 एमएल पूर्ण सीओसीएससीएम 6एबी माध्यम (तालिका 2) के साथ अलग करें (मिंकिंग को आसान बनाने के लिए)। सजातीय विघटित नमूने को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में रखें।
- 5 एमएल की अंतिम मात्रा में पूर्ण CoCSCM 6AB माध्यम जोड़ें (एक ही ट्यूब में 3 मिलीलीटर से अधिक अलग नमूने का उपयोग न करें)।
नोट: रोगियों से निकाले गए प्राथमिक सीआरसी स्वाभाविक रूप से बैक्टीरिया और कवक से दूषित होते हैं। छह एंटीबायोटिक दवाओं (पेनिसिलिन, स्ट्रेप्टोमाइसिन, कवकज़ोन, कनामाइसिन, जेंटामाइसिन और निस्टैटिन) के कॉकटेल का उपयोग करके मूल रोगी के नमूने में मौजूद रोगजनकों को हटाना आवश्यक है। इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों में बैक्टीरिया से दूषित ट्यूमर कोशिकाओं के इंजेक्शन से जानवरों की मौत हो सकती है। - DNase I (0.08 kU / mL) के 50 μL और 50 μL कोलेजनेस (1.5 मिलीग्राम / एमएल) (पाचन माध्यम; तालिका 2) सेल कल्चर इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए, 45 डिग्री की स्थिति में। इनक्यूबेशन से पहले 5 एमएल पिपेट के साथ हर 15 मिनट में घोल को अच्छी तरह मिलाएं।
नोट: ट्यूमर ऊतक को अलग करें और एकल कोशिका समाधान प्राप्त करने के लिए कई बार पाइप िंग करके इसे पचाएं। यह प्राप्तकर्ता चूहों में इंजेक्शन लगाने से पहले कोशिकाओं की गिनती के लिए आवश्यक है और इसलिए ट्यूमर कोशिकाओं के एक सजातीय आरोपण को प्राप्त करता है। - पूर्ण CoCSCM 6AB माध्यम के 5 मिलीलीटर जोड़ें और 5 मिलीलीटर पिपेट के साथ अच्छी तरह मिलाएं।
- एक नई बाँझ 50 एमएल ट्यूब का उपयोग करके 100 μm सेल छन्नी के साथ समाधान को क्रमबद्ध करें।
- आरटी पर 8 मिनट के लिए 500 x g पर क्रमबद्ध कोशिकाओं को घुमाएं।
- सतह पर तैरने वाला यंत्र।
- 1x आरबीसी लाइसिस बफर समाधान के 3 मिलीलीटर में गोली को फिर से निलंबित करें।
- आरटी पर 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
- पूर्ण CoCSCM 6AB माध्यम के 3 मिलीलीटर जोड़ें, नमूने को पिपेट करें, और आरटी पर 10 मिनट के लिए 500 x g पर स्पिन करें।
- पूर्ण CoCSCM 6AB माध्यम के 5-10 मिलीलीटर के साथ गोली को पुन: निलंबित करें, और कोशिकाओं की कुल संख्या की गणना करने के लिए सेल काउंटर का उपयोग करें।
- आरटी पर 10 मिनट के लिए 500 x g पर कोशिकाओं को स्पिन करें, और पीबीएस के 10 एमएल में फिर से निलंबित करें।
- 20 x 106 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता प्राप्त करने के लिए गोली को फिर से निलंबित करें, और एक सजातीय सेल निलंबन प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह मिलाएं।
- टिशू कल्चर (एक सिरिंज/माउस) में सेकुम इंजेक्शन के लिए 29 ग्राम सिरिंज (0.5 एमएल यू 100 सुई, 0.33 मिमी [29 ग्राम] x 12.7 मिमी) तैयार करें। ट्यूमर सेल सस्पेंशन (1 x 106 कोशिकाओं / इंजेक्शन) के 50 μL को सिरिंज में लोड करें और इसे बर्फ पर रखें। सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन से हवा के बुलबुले हटा दिए गए हैं।
नोट: सिरिंज में ट्यूमर कोशिकाओं को लोड करने पर हवा के बुलबुले को खत्म करना सीकुम दीवार में अत्यधिक मात्रा के इंजेक्शन से बचने के लिए आवश्यक है, जिसके परिणामस्वरूप ऊतक टूटना और नमूना हानि हो सकती है। एक ही प्रयोग में चूहों के बीच असमान ट्यूमर के आकार से बचने के लिए सिरिंज लोड करते समय सेल निलंबन को अच्छी तरह से मिलाना अनिवार्य है।
2. सीकुम में ऑर्थोटोपिक इंजेक्शन
नोट: निम्नलिखित प्रक्रिया पशु सुविधा में एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) कमरे में एक बेंच पर की जाती है। उपयोग किए जाने वाले उपकरण पहले साफ और निष्फल होते हैं। इसके अलावा, इसे पशु सुविधा में व्यक्तियों या क्षेत्रों के बीच एक पोर्टेबल स्टरलाइज़र में फिर से बाँझ किया जाता है।
- कीटाणुरहित डिटर्जेंट और पोंछने के साथ छिड़काव करके सर्जिकल साइट को साफ करें।
- माउस हेयर रिमूवल मशीन का उपयोग करके चूहों के पेट को पतला करें।
- माउस को लापरवाह स्थिति में रखें। जानवर को एनेस्थेटाइज करने के लिए 2% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करें। धीरे-धीरे सिरा को चुटकी मारकर और उत्तेजना की अनुपस्थिति को देखकर संज्ञाहरण के प्रभाव की पुष्टि करें।
- संज्ञाहरण के दौरान सूखापन को रोकने के लिए आंखों में पशु चिकित्सा मरहम (3 मिलीग्राम / ग्राम लैक्रिविस्क) की 50-100 μL बूंद रखें।
- एक गोलाकार गति में कई बार क्लोरहेक्सिडाइन या पोविडोन-आयोडीन के साथ स्क्रब करके माउस पेट को कीटाणुरहित करें।
- सर्जरी कैंची का उपयोग करके पेट के निचले हिस्से पर 1 सेमी अनुदैर्ध्य चीरा लगाएं। त्वचा के नीचे मौजूद पेरिटोनियम को पेश करने के लिए प्रत्येक साइट पर त्वचा को सावधानीपूर्वक अलग करें।
- पेरिटोनियम झिल्ली में 0.5-1 सेमी चीरा लगाएं, जो सीकुम को बाहर निकालने के लिए पर्याप्त बड़ा है।
नोट: आंतरिक अंगों में अत्यधिक हेरफेर किए बिना सीकुम को बाहरी करें, जो नाटकीय रूप से प्रक्रिया की घातकता को बढ़ा सकता है। - पूर्व-कट, बाँझ धुंध का उपयोग करके माउस से सीकुम को सावधानीपूर्वक अलग करें।
- पूरी प्रक्रिया के दौरान खारे घोल के साथ सेकुम को नम करें।
- सीकुम को सावधानी पूर्वक बल के साथ पकड़कर गतिहीन करें, और सुई को ऊपरी तौर पर सेकुम की दीवार में पेश करें। इंजेक्शन साइट में केशिकाओं और वाहिकाओं से बचें। सेल निलंबन से बुलबुले निकालें।
- ट्यूमर सेल निलंबन के पूरे 50μL को धीरे-धीरे इंजेक्ट करें। इसे प्रशासित करने में आमतौर पर लगभग 10 सेकंड लगते हैं। सुई के साथ सेकम लुमेन को दबाने से बचें, क्योंकि इसके परिणामस्वरूप आंतों के पेरिस्टलोसिस के माध्यम से शरीर से ट्यूमर सेल निलंबन का उन्मूलन होता है।
नोट: चूहों के सेकुम में ट्यूमर सेल निलंबन इंजेक्ट करना पूरी प्रक्रिया का सबसे चुनौतीपूर्ण कदम है। इंजेक्शन साइट पर केंद्रित एक उज्ज्वल प्रकाश और प्रोटोकॉल के इस हिस्से में एक मैग्नीफाइंग लूप का उपयोग किया जाना चाहिए। सेकुम सतह के समानांतर सुई का परिचय दें। सेकुम एक बहुत नाजुक ऊतक है; इसलिए, सीकुम का स्थिरीकरण सर्जिकल बल का उपयोग करके और ऊतक टूटने से बचने के लिए कोमल दबाव लागू करके किया जाना चाहिए जिसके परिणामस्वरूप रक्तस्राव होता है। सफल आरोपण के परिणामस्वरूप सेकुम की दीवार में एक सफेद बुलबुला (कोशिकाओं की गोली) होता है। यदि बुलबुले की कल्पना नहीं की जा सकती है, तो यह संकेत दे सकता है कि सेकुम छिद्रित हो गया है और कोशिकाएं सेकुम लुमेन में समाप्त हो गई हैं, जिसके परिणामस्वरूप आंत्र पथ द्वारा उनकी निकासी होती है। - इंजेक्शन के बाद, धीरे-धीरे सीकुम से सुई निकालें और एक कपास युक्त एप्लिकेटर के साथ इंजेक्शन साइट पर कोमल दबाव लागू करें, ताकि ट्यूमर कोशिकाओं से बचने और मामूली रक्तस्राव को कम किया जा सके।
- किसी भी मलबे को हटाने के लिए सेकुम को खारे घोल से साफ करें।
- सीकुम को जानवर के पेट में वापस लौटाएं।
- 5/0 सीवन का उपयोग करके पेरिटोनियम को बंद करें।
- 5/0 सीवन का उपयोग करके पेट की त्वचा को बंद करें।
- ऑपरेशन के बाद के एंटीबायोटिकदवाओं (100 मिलीग्राम / किग्रा एमोक्सिसिलिन या 20 मिलीग्राम / किग्रा एनरोफ्लोक्सासिन) और एनाल्जेसिक (5 मिलीग्राम / एमएल मेटाकैम / मेलॉक्सिकैम) को चमड़े के नीचे इंजेक्शन द्वारा प्रशासित करें। चूहों को एक हीटिंग पैड पर रखें और उन्हें तब तक वहां रखें जब तक कि वे पूरी तरह से ठीक न हो जाएं। फिर, उन्हें अन्य जानवरों के साथ पिंजरे में वापस कर दें।
3. μCT स्कैनिंग का उपयोग कर ऑर्थोटोपिक ट्यूमर के विकास का मूल्यांकन
नोट: पशु सुविधा से प्रीक्लिनिकल इमेजिंग प्लेटफॉर्म (पीआईपी) में निम्नलिखित प्रक्रिया की जाती है।
- संस्थागत नैतिक समिति के नियमों का पालन करते हुए सभी पशु प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करें।
- सेल इंजेक्शन के 2 सप्ताह बाद और उसके बाद हर हफ्ते μCT द्वारा ट्यूमर की मात्रा की निगरानी शुरू करें।
- दोनों खुराक के लिए 3: 1 के अनुपात में खारा घोल में कंट्रास्ट एजेंट आयोपामिरो (300 मिलीग्राम / एमएल) को ताजा पतला करें। मौखिक गैवेज द्वारा 300 मिलीलीटर आयोपामिरो का प्रबंधन करें।
नोट: μCT के खराब नरम ऊतक कंट्रास्ट के कारण, तकनीक की संवेदनशीलता में सुधार के लिए एक कंट्रास्ट एजेंट की सिफारिश की जाती है। प्रोटोकॉल में इंट्राल्यूमिनल ट्यूमर के बोझ को कम करने के लिए आयोडीन-आधारित एजेंट (आयोपामिरो) का मौखिक प्रशासन शामिल है, और आंत के आंत के चेहरे में ट्यूमर के बोझ को परिभाषित करने के लिए उसी एजेंट का एक द्वितीयक इंट्रापरिटोनियल प्रशासन शामिल है। पायलट प्रयोग ों को पहले सटीक समय निर्धारित करने के लिए किया गया है कि कंट्रास्ट एजेंट को इसके उन्मूलन से पहले चूहों के सीकुम तक पहुंचने की आवश्यकता है। आयोपामिरो के मामले में, यह लगभग 2 घंटे है। - 2 घंटे के बाद, पहले से पतला आयोपामिरो के 300 एमएल का इंट्रापरिटोनियल इंजेक्शन दें। प्रशासन पार्श्विका चेहरे में ट्यूमर सीमा को परिभाषित करने में मदद करता है।
- 2% आइसोफ्लुरेन का उपयोग करके जानवरों को एनेस्थेटाइज करें।
- यह पुष्टि करने के बाद कि माउस के पैर को पिंच करके जानवर को सही ढंग से एनेस्थेटाइज्ड किया गया है, जानवर को μCT के स्कैनिंग बेड में रखें। सबसे अच्छी स्थिति लापरवाह (फेस अप) है।
- नियंत्रण सॉफ्टवेयर में, स्कैनर के क्षेत्र के दृश्य क्षेत्र (एफओवी) में पेट के क्षेत्र को रखने के लिए लाइव मोड (फ्लोरोस्कोपी मोड) शुरू करें। ऐसा करने के लिए, बिस्तर को आगे और पीछे और पार्श्व रूप से तब तक ले जाएं जब तक कि वांछित स्थिति प्राप्त न हो जाए। एक्स-रे ट्यूब और डिटेक्टर को 90 ° घुमाएं, और जानवर को पूरी तरह से केंद्र में रखने के लिए वाई-अक्ष में स्कैनिंग बिस्तर को स्थानांतरित करें।
- एक FX μCT इमेजिंग सिस्टम का उपयोग करते हुए, μCT स्कैन छवियों के लिए निम्न मापदंडों का उपयोग करें: 30 mm FOV, 26 s का अधिग्रहण समय, 90 kV का वर्तमान वोल्टेज, और 200 μA वर्तमान एम्परेज।
- स्कैन समाप्त होने पर जानवरों को वसूली के लिए उनके पिंजरों में वापस कर दें। थर्मल सहायता प्रदान करें और जानवरों की निगरानी करें जब तक कि वे आवास पर लौटने से पहले संज्ञाहरण से ठीक न हो जाएं।
- μCT अधिग्रहण प्रत्येक स्कैन के लिए आकार में 250 Mb फ़ाइल उत्पन्न करता है। बनाई गई डेटा फ़ाइलों में VOX स्वरूप होता है. उन्हें किसी भी इमेजिंग विश्लेषण सॉफ्टवेयर के लिए सुलभ बनाने के लिए, μCT के डेटाबेस प्रबंधन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके फ़ाइलों को DICOM प्रारूप में परिवर्तित करें। उपलब्ध इमेजिंग सॉफ़्टवेयर के साथ किसी भी कंप्यूटर का उपयोग करके उनका विश्लेषण करने के लिए बनाई गई फ़ाइलों के बैच को पोर्टेबल हार्ड डिस्क में संग्रहीत करें।
नोट: छवि विश्लेषण के दौरान, सीकुम को रेडियोडेंस सामग्री (आयोपामिरो) के साथ एक पतला आंत्र के रूप में स्थानीयकृत किया जाता है, जो अक्सर पुच्छल पेट के बाईं ओर होता है। सीकुम के आंत के लचीलेपन में, आसन्न आंतों के क्षेत्रों की तुलना में एक दीवार मोटी देखी जाती है। मोटा होना ट्यूमर के विकास से मेल खाता है। - एक बार जब ट्यूमर स्थानीयकृत हो जाता है, तो विभिन्न दृश्यों (अक्षीय, कोरोनल और धन) में उच्चतम व्यास का पता लगाएं। इन तीन अक्षों को मापें और दीर्घवृत्त सूत्र का पालन करते हुए ट्यूमर की मात्रा की गणना करें: वॉल्यूम = 4/3 : x (x-सेमीएक्सिस x y-सेमीएक्सिस x z-सेमीअक्षिस)10।
4. ऑर्थोटोपिक ट्यूमर वाले चूहों में चिकित्सीय हस्तक्षेप।
- साप्ताहिक ऑर्थोटोपिक ट्यूमर वाले चूहों की निगरानी करें।
- जब अधिकांश चूहों में एक ट्यूमर μCT स्कैन सिग्नल का पता चलता है, तो ट्यूमर की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए अगले सप्ताह एक और μCT स्कैन करें।
नोट: उपचार शुरू करने का समय उपयोग किए गए पीडीएक्स मॉडल पर निर्भर करता है, और सीकुम में ट्यूमर सेल टीकाकरण के 3-12 सप्ताह बाद से भिन्न होता है। - चूहों को चार समूहों में यादृच्छिक करें: एक वाहन समूह (एन = 10-15 चूहे), एक परीक्षण दवा समूह (एन = 10-15 चूहे), देखभाल कीमोथेरेपी समूह का एक मानक (एन = 10-15 चूहे), और एक संयोजन उपचार समूह (एन = 10-15 चूहे)।
- चूहों को इंट्रापरिटोनियल रूप से नमकीन (वाहन समूह), परीक्षण दवा (20 मिलीग्राम / किग्रा) (परीक्षण दवा समूह), इरिनोटेकन (50 मिलीग्राम / किग्रा) (देखभाल समूह का मानक), या परीक्षण दवा (20 मिलीग्राम / किग्रा) के साथ इरिनोटेकन (50 मिलीग्राम / किग्रा) (संयोजन उपचार समूह) के साथ इलाज करें। प्रयोग के अंत तक सप्ताह में एक बार प्रशासन करें।
- प्रयोग के दौरान μCT स्कैनिंग द्वारा साप्ताहिक ट्यूमर के विकास की निगरानी करें।
- प्रयोग के अंत में, गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था द्वारा चूहों को इच्छामृत्यु करें और यकृत, फेफड़े और अन्य अंगों में किसी भी अन्य संभावित घावों को इकट्ठा करें।
- कैसेट में ऊतक के नमूने शामिल करें और उन्हें रात भर 4% फॉर्मेलिन में इनक्यूबेट करें। एक नियंत्रण के रूप में सेकुम में ट्यूमर के बिना माउस से आंत के ऊतकों का उपयोग करें।
- फॉर्मेलिन से कैसेट निकालें और कम से कम 3 घंटे के लिए 70% इथेनॉल के साथ इनक्यूबेट करें।
- हिस्टोपैथोलॉजी सुविधा मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके पैराफिन के साथ कैसेट एम्बेड करें।
- हिस्टोपैथोलॉजी सुविधा मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके, सीकुम, यकृत और फेफड़े से हेमटोक्सीलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला करें।
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Representative Results
रोगी-व्युत्पन्न कैंसर कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित चूहों को साप्ताहिक रूप से μCT स्कैनिंग द्वारा निगरानी की गई थी। प्रयोग के अंत में, जानवरों को इच्छामृत्यु दी गई थी। आंतों, सीका (चित्रा 1 ए, बी), यकृत, फेफड़े, और किसी भी अन्य संभावित घाव को एकत्र किया गया था, एक कैसेट में शामिल किया गया था, और रात भर 4% फॉर्मलिन के साथ तय किया गया था। सेकुम में ट्यूमर के बिना माउस से आंत के ऊतक का उपयोग नियंत्रण के रूप में किया गया था (चित्रा 1 सी)। अंत में, कैसेट को कम से कम 3 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में बदल दिया गया और पैराफिन एम्बेडेड किया गया। ट्यूमर कोशिकाओं की पहचान करने के लिए हिस्टोपैथोलॉजी सुविधा मानक प्रोटोकॉल का उपयोग करके सेका, यकृत और फेफड़ों से हेमटोक्सिलिन और ईओसिन (एच एंड ई) धुंधला होना किया गया (चित्रा 2, चित्रा 3, और चित्रा 4)।
एक अन्य प्रयोग में, ऑर्थोटोपिक ट्यूमर वाले चूहों की साप्ताहिक निगरानी की गई। जब अधिकांश चूहों में एक ट्यूमर μCT स्कैन सिग्नल का पता चला (लगभग 2-4 सप्ताह, पीडीएक्स मॉडल के आधार पर), जानवरों को चार समूहों में यादृच्छिक किया गया और वाहन, परीक्षण दवा (20 मिलीग्राम / किग्रा), देखभाल कीमोथेरेपी के मानक इरिनोटेकन (50 मिलीग्राम / किग्रा), या इरिनोटेकन के साथ परीक्षण दवा के साथ इलाज किया गया। प्रयोग के अंत तक दवाओं को सप्ताह में एक बार इंट्रापरिटोनियल रूप से प्रशासित किया गया था। प्रयोग के दौरान म्यूसीटी स्कैनिंग द्वारा ट्यूमर के विकास की साप्ताहिक निगरानी की गई थी। परिणामों ने संकेत दिया कि परीक्षण दवा ने ट्यूमर की मात्रा में कमी को प्रेरित किया, जिसकी गणना μCT स्कैन छवियों द्वारा की गई थी, और इसे इरिनोटिकन उपचार (चित्रा 5 और चित्रा 6) के साथ संयोजन में बढ़ाया गया था।
हमारी प्रयोगशाला में पिछले अध्ययनों से पता चला है कि ऑर्थोटोपिक सीआरसी-पीडीएक्स मॉडल की मेटास्टैटिक क्षमता (कार्सिनोमैटोसिस, फेफड़े और यकृत मेटास्टेसिस) उपयोग किए गए पीडीएक्स मॉडल (तालिका 3)2 पर निर्भर करती है। वर्तमान अध्ययन में, मेटास्टेसिस गठन पर चिकित्सीय प्रभावकारिता का भी मूल्यांकन किया गया था। परिणामों ने संकेत दिया कि परीक्षण दवा, इरिनोटेकन, और संयोजन ने इलाज किए गए चूहों में फेफड़ों और यकृत मेटास्टेसिस के गठन को मिटा दिया (तालिका 4)11)।
चित्रा 1: ऑर्थोटोपिक सीआरसी-पीडीएक्स ट्यूमर वाले चूहों की आंत की मैक्रोस्कोपिक छवियां। प्रयोग के अंत में ऑर्थोटोपिक पीडीएक्स ट्यूमर (ए, बी) वाले दो चूहों से मैक्रोस्कोपिक आंत की छवियां। छवियों में सीकुम ट्यूमर को लाल रंग में परिभाषित किया गया है। (सी) एक नियंत्रण के रूप में सेकुम में ट्यूमर के बिना माउस की आंत छवि। स्केल बार = 5 मिमी (ए, बी); 1 सेमी (सी) कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: ऑर्थोटोपिक सीआरसी-पीडीएक्स ट्यूमर की हिस्टोलॉजिकल छवियां। कम (ए) और उच्च (ए) आवर्धन पर प्रयोग के अंत में सेकुम में पीडीएक्स ट्यूमर मॉडल का एच एंड ई धुंधला होना। छवियों में सीकुम ट्यूमर को लाल रंग में परिभाषित किया गया है। स्केल बार = 2.5 मिमी (ए); 100 मिमी (ए)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 3: ऑर्थोटोपिक सीआरसी-पीडीएक्स ट्यूमर एच एंड ई से प्राप्त फेफड़ों के मेटास्टेसिस की हिस्टोलॉजिकल छवियां एक ऑर्थोटोपिक पीडीएक्स ट्यूमर वाले माउस से फेफड़े का धुंधला हो जाती हैं। फेफड़े के मेटास्टेसिस को कम (ए) और उच्च (ए) आवर्धन पर देखा जा सकता है। फेफड़ों के मेटास्टेस को छवियों में लाल रंग में परिभाषित किया गया है। स्केल बार = 250 मिमी (ए); 100 मिमी (ए)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: ऑर्थोटोपिक सीआरसी-पीडीएक्स ट्यूमर से प्राप्त यकृत मेटास्टेसिस की हिस्टोलॉजिकल छवियां। ऑर्थोटोपिक पीडीएक्स ट्यूमर वाले माउस से यकृत का एच एंड ई धुंधला होना। यकृत मेटास्टेसिस को कम (ए) और उच्च (ए) आवर्धन पर देखा जा सकता है। छवियों में यकृत मेटास्टेस को लाल रंग में परिभाषित किया गया है। छवियों में स्केल बार इंगित किए गए हैं। स्केल बार = 500 मिमी (ए); 50 मिमी (ए)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 5: ऑर्थोटोपिक सीआरसी-पीडीएक्स मॉडल में एक परीक्षण दवा की चिकित्सीय प्रभावकारिता। चार समूहों (वाहन, परीक्षण दवा, इरिनोटेकन, और इरिनोटेकन के साथ परीक्षण दवा) के साथ एक प्रयोग का उदाहरण। μCT स्कैन छवियों से प्राप्त ट्यूमर की मात्रा समय (A) और प्रयोग के अंत में (दिन 42) (B) का प्रतिनिधित्व किया जाता है। बार, ± एसई (एन = 15-30) और * पी < 0.05, ***पी < 0.001, ****पी < 0.0001 बनाम वाहन (टी-टेस्ट, दो तरफा)। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 6: उपचार के तहत ऑर्थोटोपिक सीआरसी-पीडीएक्स ट्यूमर वाले चूहों से μCT छवियां। ऑर्थोटोपिक ट्यूमर वाले चूहों की प्रतिनिधि μCT छवियों को एक चिकित्सीय दवा के साथ इलाज किया जाता है। छवियों में सेकुम (लाल) और ट्यूमर द्रव्यमान (नीला) परिभाषित किया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
तालिका 1: चमड़े के नीचे पीडीएक्स की स्थापना। हमारे बायोबैंक 2 से 350 से अधिक पीडीएक्स मॉडल के प्रयोगशाला (पी 1, पी2 , और पी 3) में स्थापित तीन पीडीएक्स मॉडल का उदाहरण टीका लगाए गए कोशिकाओं की संख्या, पीडीएक्स स्थापना की घटना और चूहों में मार्ग के साथ। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
तालिका 2: विकास कारक (जीएफ) मिक्स 10 एक्स, ईजीएफ के बिना सीओसीएससीएम 6 एबी, एफजीएफ 2, और विकास कारक, सीओसीएससीएम 6 एबी पूर्ण माध्यम, और पाचन माध्यम तैयार करने के लिए अभिकर्मक। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
तालिका 3: ऑर्थोटोपिक सीआरसी-पीडीएक्स मॉडल की मेटास्टैटिक क्षमता। हमारे बायोबैंक 2 से प्रयोगशाला (पी 1, पी2, और पी 3) में स्थापित तीन ऑर्थोटोपिक सीआरसी-पीडीएक्स मॉडल का उदाहरण। यहां, टीका लगाए गए कोशिकाओं की संख्या, सीकुम ट्यूमर गठन की घटना, और कार्सिनोमैटोसिस, फेफड़ों के मेटास्टेसिस या यकृत मेटास्टेसिस उत्पन्न करने की घटनाओं का संकेत दिया जाता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
तालिका 4: ऑर्थोटोपिक सीआरसी-पीडीएक्स मॉडल में एक परीक्षण दवा की चिकित्सीय मेटास्टैटिक प्रभावकारिता। चार समूहों (वाहन, परीक्षण दवा, इरिनोटेकन, और इरिनोटेकन के साथ परीक्षण दवा) के साथ एक प्रयोग का उदाहरण। यहां, प्रत्येक समूह में चूहों की संख्या और उनमें से किसने प्रयोग के अंत में कार्सिनोमैटोसिस, फेफड़े के मेटास्टेसिस या यकृत मेटास्टेसिस विकसित किया है, इसका संकेत दिया गया है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।
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Discussion
पिछले कुछ दशकों में, कोलोरेक्टल कैंसर (सीआरसी) सहित विभिन्न ट्यूमर प्रकारों वाले रोगियों में कई नए एंटी-कैंसर उपचार विकसित और परीक्षण किए गए हैं। हालांकि कई मामलों में प्रीक्लिनिकल मॉडल में आशाजनक परिणाम देखे गए हैं, उन्नत मेटास्टैटिक सीआरसी वाले रोगियों में चिकित्सीय प्रभावकारिता अक्सर सीमित रही है। इसलिए, प्रीक्लिनिकल मॉडल की तत्काल आवश्यकता है जो नैदानिक रूप से प्रासंगिक मेटास्टैटिक परिदृश्य में नई चिकित्सीय दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने की अनुमति देते हैं।
पांडुलिपि में एक उन्नत सीआरसी ऑर्थोटोपिक पीडीएक्स मॉडल का विस्तार से वर्णन किया गया है जो इम्यूनोडेफिशिएंटचूहों की सीकुम दीवार में रोगी ट्यूमर कोशिकाओं के आरोपण पर आधारित है।
कार्यप्रणाली समय लेने वाली और एकाग्रता की मांग है। औसतन, 30 चूहों के साथ एक प्रयोग के इंजेक्शन में कुल मिलाकर लगभग 11 घंटे लग सकते हैं, जिनमें शामिल हैं: 1) पीडीएक्स ट्यूमर संग्रह (1 घंटे); ट्यूमर प्रसंस्करण (4 घंटे); और सीकुम प्रत्यारोपण (6 घंटे)। सर्जरी से संबंधित मृत्यु दर से बचने के लिए आंतरिक अंगों में बहुत सावधानी से हेरफेर करते हुए, ट्यूमर प्रसंस्करण और इंजेक्शन के लिए समय को कम करते हुए, प्रक्रिया को बाँझ स्थितियों में किया जाना चाहिए। इसलिए यह अत्यधिक अनुशंसा की जाती है कि जांचकर्ताओं को प्रशिक्षित करने और प्रक्रिया से परिचित करने के लिए ट्यूमर सेल लाइनों या पीडीएक्स कोशिकाओं के साथ कई पायलट प्रयोग किए जाते हैं। इसके अलावा, दो शोधकर्ताओं को प्रक्रिया में शामिल किया जाना चाहिए, एक ट्यूमर को इकट्ठा करने और संसाधित करने के लिए, साथ ही जानवरों के सीवन के साथ मदद करने के लिए, और दूसरा वास्तविक सर्जरी करने के लिए।
यह विचार करना भी महत्वपूर्ण है कि पीडीएक्स मॉडल और इंजेक्शन की विशिष्ट साइट के आधार पर सेकम ट्यूमर आंत के लुमेन में या सेकुम के अंदर बढ़ सकते हैं। ट्यूमर के विकास के परिणाम को नियंत्रित करना मुश्किल है और नाटकीय रूप से चूहों के अस्तित्व को प्रभावित कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप छोटे ट्यूमर और एक गंभीर आंतों की रुकावट होती है जब ट्यूमर लुमेन के अंदर बढ़ते हैं। इसलिए चूहों को साप्ताहिक रूप से निगरानी की जानी चाहिए, सेल आरोपण के बाद सप्ताह से शुरू होती है। एक बार जब अधिकांश चूहे μCT स्कैन द्वारा ट्यूमर सिग्नल पेश करते हैं, तो सिग्नल के बिना जानवरों को बाहर रखा जाना चाहिए, और बाकी को ट्यूमर की मात्रा के आधार पर प्रयोगात्मक समूहों में यादृच्छिक किया जाना चाहिए। सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए, प्रत्येक प्रयोगात्मक समूह में 12-15 चूहे शामिल होने चाहिए।
नैदानिक रूप से प्रासंगिक ऑर्थोटोपिक मॉडल में नए चिकित्सीय एजेंटों की प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए ट्यूमर असर चूहों की निगरानी आवश्यक है। μCT स्कैन चूहों में प्राथमिक ट्यूमर की मात्रा की पहचान और परिमाणीकरण को सक्षम करता है। डबल कंट्रास्ट का उपयोग μCT तकनीक की संवेदनशीलता में काफी वृद्धि करता है, जिससे छवियों की गुणवत्ता में सुधार होताहै। सीकुम में ट्यूमर कोशिकाओं की वृद्धि से इंट्राल्यूमिनल ट्यूमर हो सकता है यदि वे आंत के लुमेन की ओर बढ़ते हैं, या एक्स्ट्राल्यूमिनल ट्यूमर यदि वे आंत के लुमेन से बाहर बढ़ते हैं। दोनों परिदृश्यों को पिछली पद्धति के साथ देखा गया है, और उपयोग किए गए पीडीएक्स मॉडल और इंजेक्शन साइट पर निर्भर करता है। स्कैनिंग से चूहे पूरी तरह से ठीक हो गए, गुर्दे की क्षति या अन्य घटनाओं का कोई नैदानिक सबूत नहीं था। परिणाम बताते हैं कि सीआरसी के विकास और अनुदैर्ध्य विकास की निगरानी के लिए μCT इमेजिंग एक उपयोगी उपकरण हो सकता है।
ऑर्थोटोपिक मॉडल नैदानिक सीआरसी12 को सटीक रूप से पुन: प्रस्तुत करते हैं और प्राथमिक ट्यूमर के विकास और यकृत और फेफड़ों के मेटास्टेस 2,11 पर नई चिकित्सीय दवाओं के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए बहुत उपयोगी हैं। हालांकि, एक विस्तृत लिखित प्रोटोकॉल ऐसे जटिल मॉडल स्थापित करने के लिए एक नए शोध समूह के लिए पर्याप्त नहीं हो सकता है। जवाब में, वर्तमान वीडियो का उद्देश्य अनुसंधान समूहों को अपने शोध में इस प्रक्रिया को लागू करने के लिए मार्गदर्शन करना है। यह इम्यूनोडेफिशिएंट चूहों की सीकुम दीवार में कोशिकाओं की आरोपण प्रक्रिया और μCT स्कैनिंग का उपयोग करके आंतों के ट्यूमर के विकास की निगरानी करने की पद्धति को दर्शाता है।
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Disclosures
कोई नहीं।
Acknowledgments
हम सेलेक्स फाउंडेशन, सिबेरोएनसी नेटवर्क और इंस्टीट्यूटो डी सलूद कार्लोस III को उनके समर्थन के लिए स्वीकार करते हैं। इसके अलावा, हम वाल डी'हेब्रोन रिसर्च इंस्टीट्यूट (वीएचआईआर) में प्रीक्लिनिकल इमेजिंग प्लेटफॉर्म को भी धन्यवाद देते हैं, जहां प्रयोग किए गए थे।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| REAGENT | |||
| Apo-Transferrin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | T1147-500MG | |
| B27 Supplement | Life Technologies S.A (Spain) | 17504044 | |
| Chlorhexidine Aqueous Solution 2% | DH MATERIAL MÉDICO, S.L. | 1111696250 | |
| Collagenase | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | C0130-500MG | |
| D-(+)-Glucose | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | G6152 | |
| DMEM /F12 | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 21331-020 | |
| DNase I | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | D4263-5VL | |
| EGF | PEPRO TECH EC LTD. | AF-100-15-500 µg | |
| FGF basic | PEPRO TECH EC LTD. | 100-18B | |
| Fungizone | Life Technologies S.A (Spain) | 15290026 | |
| Gentamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15750037 | |
| Heparin Sodium Salt | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | H4784-250MG | |
| Insulin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | I9278-5ML | |
| Iopamiro | |||
| Isoflurane | - | - | |
| Kanamycin | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 15160047 | |
| L-Glutamine | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 25030032 | |
| Matrigel Matrix | CULTEK, S.L.U. | 356235/356234/354234 | |
| Metacam, 5 mg/mL | - | - | |
| Non-essential amino acids | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11140035 | |
| Nystatin | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | N4014-50MG | |
| Pen/Strep | Life Technologies S.A (Spain) | 15140122 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS), sterile | Labclinics S.A | L0615-500 | |
| Progesterone | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P0130-25G | |
| Putrescine | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | P5780-5G | |
| RBC Lysis Buffer | Labclinics S.A | 00-4333-57 | |
| Sodium Pyruvate | LIFE TECHNOLOGIES S.A. | 11360039 | |
| Sodium Selenite | MERCK LIFE SCIENCE S.L.U. | S5261-25G | |
| ESSENTIAL SUPPLIES | |||
| 8 weeks-old NOD.CB17-Prkdcscid/NcrCrl mice | - | - | |
| BD Micro-Fine 0.5 ml U 100 needle 0.33 mm (29G) x 12.7 mm | BECTON DICKINSON, S.A.U. | 320926 | |
| Blade #24 | - | - | |
| Cell Strainer 100 µm | Cultek, SLU | 45352360 | |
| Forceps and Surgical scissors | - | - | |
| Heating pad | - | - | |
| Lacryvisc, 3 mg/g, ophthalmic gel | - | - | |
| Surfasafe | - | - | |
| Suture PROLENE 5-0 | JOHNSON&JOHNSON S, A. | 8720H | |
| EQUIPMENT/SOFTWARE | |||
| Quantum FX µCT Imaging system | Perkin Elmer | Perkin Elmer | http://www.perkinelmer.com/es/product/quantum-gx-instrument-120-240-cls140083 |
References
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