Summary
ここでは、市販のリアルタイムATPベースの発光微生物生存率アッセイを使用して予防的臨床応用をシミュレートするために、抗生物質溶出ポリマーの抗菌効果を評価するためのプロトコルを提示します。この方法は、薬物溶出物質の縦方向活性のモニタリングを可能にし、抗菌薬物送達プラットフォームの試験に広く適応することができる。
Abstract
超高分子量ポリエチレン(UHMWPE)は、耐荷重面として関節全置換術に広く使用されています。人工関節周囲感染症は、その大多数が関節置換術の直後に発生し、膝関節再手術全体のほぼ25%を占めており、細菌感染の完全な根絶は大きな課題となっています。この問題に取り組む有望な方法は、日常的な全身抗生物質予防をサポートするために細菌を阻害するのに十分な抗生物質濃度の局所持続送達を確実にすることです。効率的な局所薬物送達装置の開発に関する研究が増加しています。薬物溶出物質の抗菌効果を試験するために確立された薬物の抗菌試験法は可能であるが、これらのデバイスからの抗生物質の溶出プロファイルと相関させることができるリアルタイムおよび縦断的な抗菌効果データを提供するという点では不十分である。ここでは、抗生物質溶出UHMWPEインプラントの抗菌効果を決定するための直接的で汎用性の高い方法論を報告します。この方法論は、長い実験の各時点で細菌培養を回避するためのプラットフォームとして使用でき、他の局所薬物送達デバイスにも適応できます。
Introduction
変形性関節症は、世界中で5億人の成人を苦しめる重大な変性状態です1。末期関節炎の治療におけるゴールドスタンダードは関節全置換術であり、2030年までに米国だけで年間200万人以上の患者に実施されると予測されており2、世界的な需要も途方もなく増加しています3,4。この手順では、関節の関節軟骨表面を、金属/セラミックおよび高度に架橋された超高分子量ポリエチレン(UHMWPE)で作られた耐荷重合成材料で置き換えます。関節全置換術は、関節炎に苦しむ患者の生活の質を大幅に改善します5が、インプラントの性能と患者の満足度を危険にさらす重大な合併症は、人工関節周囲感染症(PJI)であり、これは修正手術の15%〜25%を占めています6。ほとんどの場合、感染の原因は手術中のインプラント部位の微生物汚染であると考えられています7。汚染集団は、次いで、インプラントおよび組織表面8上で拡大する。宿主免疫系は応答して引き起こされるが、汚染生物の増殖速度およびバイオフィルム形成は、それらが免疫細胞を回避することを可能にし、細菌の根絶なしにサイトカインおよびケモカインストームの上昇をもたらし得る9,10,11。結果として生じる骨の深部感染は、インプラントの固定および性能ならびに患者の健康を危険にさらす12。
黄色ブドウ球菌およびコアグラーゼ陰性ブドウ球菌は、PJI13の主な原因生物です。ブドウ球菌感染症の重症度は、抗生物質に対する耐性の増加、バイオフィルム形成、および小さなコロニー変異体として持続する能力のために高いです14、15、16。インプラント関連感染症は、インプラントの表面への微生物の付着と、細菌が有害な宿主免疫因子および抗生物質の有効濃度を回避することを可能にする複雑なバイオフィルムマトリックスの確立によって発生します14,15,16。従来の治療法には、長期間にわたる抗生物質の静脈内投与と経口投与の組み合わせが含まれます17。このアプローチの主な欠点は、感染部位での薬物のバイオアベイラビリティが低く、治療期間にわたって細菌を一貫して根絶するのに十分な濃度の抗生物質を達成することが困難であり、その結果、しばしば悪い結果をもたらす18。これらの欠点に対処するために、完全に機能する局所性薬物溶出性UHMWPEインプラントは、関節腔への有効濃度の抗生物質の持続放出を確実にするように設計されました19。薬剤溶出インプラントからの局所溶出は、インプラントの除去および組織の創面切除後に残っている細菌の増殖およびコロニー形成を防ぐための補完的なツールとして使用されます。この抗生物質溶出UHMWPEのインビトロ抗菌試験は、材料を細菌と直接インキュベートし、スプレッドプレート法によって細菌を定量することによって行うことができる20,21。あるいは、溶離液培地のアリコートは、寒天ディスク拡散法、ブロス希釈法、およびタイムキル試験22などの方法を使用して細菌に対して試験することができる。これらの方法はすべて、コロニーカウントおよび濁度測定によるアリコートの収集後約16〜18時間の成長観察に依存しています。そのようなデバイスからの抗生物質の溶出は、これらのin vitro法を用いて縦断的に定量することができる。ただし、これらの濃度プロファイルの翻訳値を決定するには、抗菌活性を評価するための堅牢なリアルタイムin vitro法が必要です。
本研究で用いた微生物生存率アッセイは、ルシフェリン-ルシフェラーゼベースの検出技術を用いて生菌体から放出されるアデノシン三リン酸(ATP)に対応する発光を測定することにより、生菌を定量するために開発されました。ATPは、生細胞のエネルギー通貨として、生理学的に生存可能な細胞の直接的な指標として機能します。試薬は細胞溶解を行い、生存細胞からATP分子を放出し、発光の形で検出します。この発光は、試料23内の生菌細胞の割合と直接的な相関関係を有する。これは、グラム陽性菌とグラム陰性菌の両方を使用したさまざまなアッセイデザインや条件に適応できる、リアルタイム、シンプル、汎用性、高速、単一試薬ベースのアッセイです。ここでは、微生物生存率アッセイに基づく修正タイムキルアッセイ(BacTiter Gloなど)を使用して、黄色 ブドウ球菌 の実験室および臨床株とインキュベートした抗生物質溶出UHMWPEのリアルタイムの抗菌活性を決定する方法を報告します。方法論は、特定のインプラント材料および特定の整形外科用途で説明されているが、この方法は、臨床応用を有する他の抗生物質溶出送達装置を試験するためのプラットフォームを提供することができる。
Protocol
1. 試薬の調製
- ミューラーヒントンブロス(MHB)調製:22 gの陽イオン調整MHBを1 Lの脱イオン水に溶解します。培地を121°C、15ポンドの圧力で20分間オートクレーブし、ボトルのキャップが緩いことを確認します。調製した滅菌液を使用時まで4°Cで保存する。
- トリプシン大豆寒天(TSA)製剤:20 gのTSA粉末を500 mLの脱イオン水に溶解します。寒天混合物を121°C、15ポンドで20分間オートクレーブします。滅菌培地を55°Cの水浴に移し、溶融寒天の温度を下げます。冷やした寒天を滅菌ペトリ皿(~15mL)に注ぎ、固化させます。固化した寒天プレートは結露しないように逆さまに保管してください。
- トリプシン大豆ブロス(TSB)製剤:15 gのTSB粉末を500 mLの脱イオン水に溶解します。ブロス混合物を121°C、15ポンドで20分間オートクレーブします。調製した滅菌液を使用時まで4°Cで保存する。
- リン酸緩衝生理食塩水(PBS):オートクレーブは、滅菌使用前に121°Cおよび15ポンドで20分間1x PBSを市販購入しました。
- 微生物生存率アッセイ試薬の調製:アッセイの内容物を室温に平衡化します。10 mLのバッファーを凍結乾燥発光試薬粉末と混合し、調製した試薬を1 mLアリコートとして-20°Cで保存します。各時点の前に、光感受性試薬を解凍し、室温に戻します。
- 硫酸ゲンタマイシンストック溶液:硫酸ゲンタマイシン(GS)80 mgを1x PBSの10 mLに溶解します。薬液を徹底的にボルテックスし、8 mg/mL GSストック溶液を得ます。
- 塩酸バンコマイシン原液:塩酸バンコマイシン粉末10 mgを10 mLの脱イオン水に完全に溶解し、1 mg / mLストック溶液を得ます。
- ホウ酸緩衝液:24.7 g(0.4 M)のホウ酸を900 mLの脱イオン水に溶解します。50%(w / v)水酸化ナトリウム溶液で溶液のpHを10.4に調整します。この工程にさらに、脱イオン水を加えて1Lにします。
- O-プタルジアルデヒド試薬(OPA):0.2 gのOPAを1 mLのメタノールに溶解します。19 mLの0.4 Mホウ酸緩衝液(pH 10.4)をOPA溶液に加えます。OPA-ホウ酸混合物に0.4 mLの2-メルカプトエタノールを加えます。試薬バイアルをアルミホイルで覆い、調製後2〜3日まで使用するために4°Cで保存します。
注意: 皮膚、目、衣服との接触を避けてください。OPAおよび2メルカプトエタノール試薬の取り扱いは、適切な個人用保護具を着用しながら、適切な排気換気を備えたヒュームフードの下でのみ実行する必要があります。.蒸気、ほこり、またはエアロゾルを吸い込まないでください。
2.バージンおよび薬物を装填したUHMWPEの調製
- 硫酸ゲンタマイシンおよび塩酸バンコマイシン粉末を篩(孔径75μm)で各2gふるいにかけ、真空オーブン(<0.1気圧)中で45°Cで18〜24時間脱水する。
- メカニカルミキサーを使用して、脱水薬物をUHMWPE粉末と7%w / w(抗生物質1.12 g + UHMWPE14.88 g)で容器内で5分間ブレンドします。
- アルミニウム青銅のカスタム金型(85 mm x 50 mm)をステンレス鋼のインサートプレートで180°Cに対流式オーブンで1時間予熱します。プレスのプラテンを170°Cに予熱します。
- 配合した粉末を金型に加え、10MPaで圧縮し、170°Cで10分間、続いて10MPaで45分間水冷サイクルを行った。
- 油圧プレスを使用して、成形されたUHMWPEブロック(~3.5 mm)をプレスから取り外します。
- コンピューター化された数値制御(CNC)を使用してブロックの上面と底面をフライス加工し、表面の凹凸や汚染物質を取り除きます。
- CNCを使用してブロックを3 mm x 5 mm x 20 mmのストリップにカットします。
- 研究の対照として記載されているのと同じ方法論を使用して、処女UHMWPE(抗生物質を追加せずに)を準備します。
補足図1:UHMWPEサンプルの成形に使用した金型の部品。 (A)ステンレス鋼インサートプレート;(b)金型キャビティ;(c)プランジャー;(D)バックプレート このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
3. 薬物溶出性UHMWPEの溶出速度の決定
- ルアーロックと25Gニードルを備えた3 mLシリンジに3 mm x 5 mm x 20 mmのストリップを置きます。
- シリンジに脱イオン水を満たし、シリンジを複数回反転させてストリップを洗浄します。
- シリンジに2 mLの目盛りまでの脱イオン水を入れます。
- シリンジセットアップを室温で100rpmのシェーカーに置きます。
- 各時点(6時間、1日、2日、3日、1週間)で、溶離液を2 mLバイアルに回収します。
- 各時点で、シリンジに脱イオン水を満たし、シリンジを反転させてストリップを洗浄します。溶液を廃棄し、2 mLの目盛りまでシリンジに脱イオン水を満たして、次の時点まで実験を続行します。
4.バンコマイシン濃度の決定
- 脱イオン水中のバンコマイシン濃度をピーク吸収波長280nmで分光光度的に検出します。
- UV 96ウェルプレートに100 μLの1 mg/mLストック溶液を加え、100 μLの脱イオン水を使用して段階希釈して、6段階の既知の濃度(1 mg/mL〜0.03125 mg/mL)を得ることにより、既知の濃度範囲の標準を準備します。
- 100 μLの溶離液をUVクリアな96ウェルプレートに移し、マイクロプレートリーダーを使用して280 nmでの濃度を測定します。
- 対応する吸光度値に対して既知の薬物濃度をプロットすることにより、検量線を生成します。溶離液中の未知薬物濃度は、検量線によって生成された一次方程式を使用して計算されます。
- 濃度に溶離液容量(~1.7 mL)を掛けて、薬物量を決定します。
- 前のすべての時点からの薬物放出を合計することにより、ある時点での累積薬物放出(mg)を計算します。
- 薬物放出をストリップの表面積(3.5cm 2)に正規化して、インプラントの平方センチメートル(cm2)あたりの累積薬物放出を決定します。
5. OPAタグ付け法によるゲンタマイシン濃度の測定 27
- OPAアッセイを実行するためのGS標準溶液を調製します。
- 1 mLの80 μg/mL GS溶液を遠沈管に移します。
- さらに5本の遠心チューブに500 μLのPBSを加えます。
- これらのチューブで段階希釈を行い、80 μg/mL、40 μg/mL、20 μg/mL、10 μg/mL、5 μg/mL、および2.5 μg/mLのGS濃度を取得します。これらは、アッセイのキャリブレーションソリューションとして機能します。
- 透明な96ウェルプレートで、80 μLのPBSをウェルA-1に、80 μLのキャリブレーション溶液をウェルA-2からA-7に昇順濃度で加えます。これは、アッセイの内部キャリブレーションとして機能します。
- 各サンプル80 μLを3連の空のウェルに追加し、同じ96ウェルプレートで分析します。ウェルプレートあたりのサンプル数を<50に制限して、サンプルにOPA溶液を添加するタイミングがすべてのサンプルでほぼ同じになるようにし、蒸発を回避します。
- すべての標準物質とサンプル溶液にOPA試薬を追加します。
- ヒュームフード内で、25 mLの試薬リザーバーにメタノールを充填します。
- 8 mLのメタノールと1 mLの調製したOPA溶液を2番目の試薬リザーバーに追加します(セクション1.8)。上下にピペッティングして溶液を完全に混合します。
- マルチチャンネル100 μLマイクロピペットを使用して、最初のリザーバーから96ウェルプレート内のすべてのサンプル含有ウェルに48 μLのメタノールを追加します。
- このステップにさらに、2番目のリザーバーからの72 μLの希釈OPA溶液を96ウェルプレートのすべてのサンプル含有ウェルに追加します。ウェルプレートを室温で10分間インキュベートします。
- 10分間インキュベーションした直後にマイクロプレートリーダーを用いて蛍光強度(励起340 nm、発光455 nm)を測定した。
- GSの濃度がわかっている溶液の強度測定値を使用して検量線をプロットします。直線を追加して最適適合を決定し、対応する方程式を生成します。
- 既知の薬物濃度を対応する吸光度値に対してプロットすることによって生成された検量線から溶離液中の薬物濃度を計算します。
- 濃度に溶離液容量(~1.7 mL)を掛けて、薬物質量を計算します。
- 前のすべての時点からの薬物放出を合計することにより、ある時点での累積薬物放出(mg)を決定します。
- 薬物放出をストリップの表面積(3.5cm 2)に正規化して、インプラントの平方センチメートル(cm2)あたりの累積薬物放出を決定します。
6.バクテリアの準備
注:この研究では、次の 黄色ブドウ球菌 株が使用されました:タイプ株12600、臨床株L1101およびL1163(ロードアイランド大学のケリーラプラント博士から入手)。これらの株の感受性プロファイルを 表1に示す。
| 細菌株 | ゲンタマイシンマイク | バンコマイシンMIC | |
| ATCC 12600 | ≤1 μg/mL (センシティブ) | ≤0.5 μg/mL (センシティブ) | |
| L1101 (臨床株) | ≥16 μg/mL (耐性) | 8 μg/mL (中間体) | |
| L1163 (臨床株) | ≤1 μg/mL (センシティブ) | 8 μg/mL (中間体) | |
表1:対照および臨床 黄色ブドウ球菌 株の抗生物質感受性プロファイル。
注意: 細菌培養と懸濁液の取り扱いを含むすべての手順は、クラスII、タイプA2バイオセーフティキャビネット内のBSL-2ラボスペースで実行されました。
- 細菌ストックを-80°CからTSAプレートに解凍して、 黄色ブドウ球菌の増殖を促進します。プレートを35°Cで一晩静置インキュベートします。
- 一晩増殖させた寒天平板培養物から2〜3コロニーを1 mLの滅菌TSBに移し、35°Cで一晩静置インキュベートします。
- 100 μLの細菌を透明な96ウェルプレートに移し、600 nmの吸光度を測定することにより濁度を分光光度測定します。
- 発光アッセイを使用して生菌数を決定する前に、滅菌MHBを使用して細菌を10,000倍に希釈します。
7. リアルタイム微生物生存率アッセイの実施
- 白色不透明底96ウェルプレートを用いて発光ベースのアッセイを行う。
- 100 μLの希釈細菌懸濁液を、セクション1.5で調製した100 μLのアッセイ試薬と混合します。
- 調製した96ウェルプレートの上にアルミホイルで覆われた蓋を置き、100rpmで振とうしながら5分間インキュベートする。
- Gen5 3.11ソフトウェアの次の設定を使用して、マイクロプレートリーダーで発光をすぐに測定します。
- [ 新規 ] をクリックして、[ タスク マネージャー ] ウィンドウでプロトコルを設定します。
- [プレートタイプ]のドロップダウンメニューで[Costar 96ホワイト不透明]を選択します。
- 「ステップ>アクションの選択」メニューの下にある「読み取り」をクリックします。
- [読み取り方法]ウィンドウ内の発光をクリックします。エンドポイント/キネティックファイバーオプションと発光ファイバーオプションは、それぞれ読み取りタイプと光学タイプで選択し続けます。OKをクリックします。
- [読み取りステップ]ウィンドウの<デフォルト>設定を維持します(ゲイン= 135、積分時間= 1秒、読み取り高さ= 4.5 mm)。OKをクリックします。
- プレートレイアウトウィンドウが実行の準備ができているように見えます。ロードプレートウィンドウの[蓋を使用]チェックボックスをオンにして、[ OK]をクリックします。
- 96ウェルプレートを機械に入れて、発光値を読み取ります。
8. 各細菌株の発光対生菌数標準曲線の生成
注:セクション6で説明されている方法論に従って、すべての 黄色ブドウ球菌 株を培養および列挙します。
- 標準物質として機能するように連続希釈された細菌懸濁液を調製する。
- 濁度を分光光度測定することにより一晩増殖した細菌懸濁液を列挙する。
- 6,000 × g で5分間遠心分離して細菌をペレット化し、ペレットを滅菌MHBに再懸濁して濃度を1 x 109 CFU/mLに調整します。
- 900 μLのMHBを使用して100 μLのニート懸濁液を希釈し、10倍の段階希釈を実行して1 x 101 CFU/mLに到達します。
- セクション7に記載されているように、調製された細菌懸濁液に対して発光アッセイを実行します。
- 実験のブランクコントロールとして滅菌MHBを使用し、試験サンプルの発光値からブランク発光値を差し引きます。
- 対数(CFU)を対数(発光)に対してプロットして、検量線を生成します。式とR2 値を記録します。
- 研究全体を通して、菌株固有の式を使用して発光値に対応するCFU/mLを決定します。
9.時間依存抗菌活性研究のセットアップ
図1:実験セットアップの概略図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 1 mLのTSBブロスで細菌を一晩培養します。
- 一晩増殖した細菌懸濁液を滅菌MHBで105 CFU / mLに希釈し(セクション6)、実験開始前に発光ユニットを使用して生菌数を確認します(セクション7)。
- バージンUHMWPEおよび薬物装填UHMWPEストリップ(3 mm x 5 mm x 10 mm、セクション2の溶出研究用に準備されたストリップの半分の寸法)を3 mLシリンジに入れます。
- 105 CFU / mLを含むMHBを、付属の針を通して1.5 mLマーク(MHBの1.35 mLに相当)までシリンジに引き込みます(図1:ステップ1)。
- シリンジのセットアップを振とうインキュベーター(100 rpm)に置き、6時間、1日目、2日目、3日目、4日目、5日目、6日目、および7日目の指示された時点まで37°Cで行います(図1:ステップ2)。
- 指示された各時点で、シリンジのセットアップを取り出し、100 μLの細菌懸濁液についてセクション7に従ってリアルタイムの微生物生存率アッセイを実行します(図1:ステップ3-4)。
- 6時間、1日目、2日目、3日目、および7日目の時点で生菌数を決定します。対応する検量線を使用して、発光単位からCFU/mLを決定します。
- TSAプレート上でスプレッドプレート法を実行し、35°Cで一晩インキュベートすることにより、検出限界以下の発光値を示したサンプルに生菌が存在しないことを確認します。翌日、コロニーの存在を確認します。
- 残りの細菌懸濁液を10,000 × g で10分間遠心分離し、使用済み培地を静かに吸引します。薬剤の抗菌作用によりペレットが目視で観察されないチューブの場合は、見えないペレットが乱れないように、チューブ内に100μLを残します(図1:ステップ5)。
- ペレット化した細菌を新鮮なMHBに再懸濁し、付属の針を介して細菌懸濁液を同じシリンジセットアップに引き戻します(図1:ステップ6)。
10. UHMWPE表面の付着菌の定量
- 7日目の研究終了後、シリンジのセットアップからバージンUHMWPEおよび薬物負荷UHMWPE表面を取得します。
- 表面を1.5 mLチューブに移し、1 mLの滅菌PBSですすいでください(3回)。
- 1mLの滅菌PBSで40分間表面を超音波処理する。セクション7に記載されているように、超音波処理されたサンプルの100μLで発光アッセイを実行することによって、付着細菌の生存率を決定します。
Representative Results
プロトコルに従って、UHMWPEをゲンタマイシンとバンコマイシンで7%w / wで成形し、脱イオン水に溶出しました。材料からの溶離液中の薬物濃度は、6時間、1日、2日、3日、および1週間で決定した。バンコマイシンおよびゲンタマイシンを装填したUHMWPEからの薬物放出は、6時間でバースト放出を示し、その後7日まで最小阻害濃度(MIC)を超える放出濃度で安定した放出速度を示しました(図2、 表 2)。
抗菌研究の前に、発光単位を各 黄色ブドウ球菌 株(ATCC 12600、L1101、およびL1163)の細菌のCFU / mLと相関させるための標準曲線が生成されました。対応する対数(発光)値を対数(CFU/mL)に対してプロットし、検量線を作成しました(図3)。算出されたR2 値は、ATCC 12600、L1101、L1163についてそれぞれ0.997、0.996、0.994であり、濃度範囲に強く適合していることを示した。導出された式は、その後、すべての実験にわたる細菌生存率を計算するために使用されました。ATCC 12600およびL1101は、1 x 102-1 x10 3 CFU/mLの範囲内で検出限界を示しました。一方、L1163株の検出限界は1 x10 4 CFU/mLであることが示された。
時間依存抗菌活性アッセイは、12600、L1163、およびL1101の開始接種材料として1 x 105 CFU/mLを使用して実施され、7%w/wの薬物溶出物質に1週間曝露されました。各時点(6時間、1日、2日、3日、1週間)で、培地をリフレッシュし、細菌集団を再懸濁した。材料からの薬物のその後の放出への細菌の曝露は、次の時点まで続けられた。バンコマイシンを7%w/wで投与したUHMWPEとゲンタマイシンを7%w/wで投与したUHMWPEは、感受性ATCC 12600について6時間から>3logの減少を示し、3日後に完全な根絶(コロニー増殖なし)が観察されました(図4A)。ゲンタマイシン感受性およびバンコマイシン中間株L1163では、両方の薬物溶出物質が6時間で>3log減少を引き起こし、実験の1日目に完全な根絶(コロニー増殖なし)が観察されました(図4B)。ゲンタマイシン耐性およびバンコマイシン中間株L1101の場合、UHMWPEからのゲンタマイシン溶出はL1101の細菌生存率に影響を与えませんでした(図4C)。細菌は増殖し、抗生物質溶出なしでバージンUHMWPEの存在下で個体群は6時間以内に安定しました。ゲンタマイシン溶出UHMWPEの存在下では、人口は2日目に同様の成長レベルに達しました。それどころか、UHMWPEからのバンコマイシン溶出は、6時間で細菌の生存率(>3log)を有意に低下させ、4日目までに完全な生存率の損失(コロニー増殖なし)が実証されました。
ゲンタマイシン溶出およびバンコマイシン溶出UHMWPEの両方の表面は、7日目または完全根絶のいずれか早い方の後に感受性および中間耐性株に曝露された場合、生存可能な付着細菌を示さなかった。いくつかの生菌(1 x 105 CFU / mL)は、ゲンタマイシン耐性L1101に曝露されたゲンタマイシン溶出UHMWPEに存在していました。.同様に、約1 x 10 5 CFU/mLの生菌がコントロールバージンPEから回収されました(図5)。
図2:抗生物質を配合した7%w/wのUHMWPEストリップからの経時的な平均抗生物質放出。1つの7%w / wゲンタマイシンおよびバンコマイシン装填UHMWPEストリップ(3 mm 3 x 5 mm 3 x 10 mm 3 ~ 2 cm2表面積)からの時点間の平均抗生物質放出。対照株ATCC 12600に対するMICを、ゲンタマイシンについては点線、バンコマイシンについては実線として示す。エラーバーは、6回の反復からの平均の標準偏差を表します(n = 6)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:すべての 黄色ブドウ球菌 株のリアルタイム発光アッセイ標準曲線。 log(発光)をlog(CFU / mL)に対してプロットして、対照、(A)ATCC 12600、および臨床株、(B)L1101および(C)L1163の標準曲線を生成しました。ベストフィットの線と対応するR2 値を記述する式がプロットに示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:7%w / wゲンタマイシン溶出および7%w / wバンコマイシン溶出UHMWPEの発光アッセイを使用して決定された細菌生存率。 対照株、(A)ATCC 12600、および臨床株、(B)L1163および(C)L1101に対するUHMWPEから溶出されたゲンタマイシンおよびバンコマイシンの経時的抗菌活性が示されている。Virgin 1020 PEは実験のコントロールとして機能しました。プロット中の黄色の線は、それぞれの 黄色ブドウ球菌 株の検出限界を示す。データは、平均値±標準偏差(n = 3)として示されます。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図5:すべての 黄色ブドウ 球菌株に対する7%w / wゲンタマイシン溶出および7%w / wバンコマイシン溶出UHMWPEの発光アッセイGloアッセイを使用して測定された付着細菌の生存率。 棒グラフは、試験したすべての菌株について、研究期間の終わりに7%ゲンタマイシン負荷および7%バンコマイシン負荷UHMWPEのセンチメートル平方(cm2)あたりに回収された付着細菌(CFU)を示しています。バーは、データを平均±標準偏差(n = 3)として示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
| 時点 | バンコマイシン | ゲンタマイシン |
| ピーク濃度 (μg/mL) | ピーク濃度 (μg/mL) | |
| 0 - 6 時 | 336 ± 72 | 263 ± 24 |
| 6時間-1日 | 57 ± 18 | 16 ± 2 |
| 1日 - 2日 | 60 ± 18 | 7 ± 1 |
| 2日 - 3日 | 23 ± 6 | 5 ± 0.4 |
| 3日間 - 7日間 | 49 ± 20 | 15 ± 1 |
表2:異なる時点でのピーク薬物濃度(μg / mL)。 データは平均値±標準偏差(n=6)として示す。
補足図2:サンプルへのアッセイ試薬の添加から10分間にわたる発光シグナル減衰。信号の±5%の差が点線で示されています このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
抗生物質の局所的な持続送達は、人工関節周囲感染症の管理に必要なツールです。全身性抗生物質は細菌感染を根絶するための主要な戦略であり、局所溶出は、インプラントの除去および組織の創面切除後に残っている細菌の増殖およびコロニー形成を防ぐための補完的なツールとして使用されます。局所投与による抗生物質の曲線下有効面積(一定期間にわたる濃度)の目標はよく理解されていません。そのような装置からの抗生物質の溶出は、 in vitroで縦断的に定量することができる。ただし、これらの濃度プロファイルの翻訳値を決定するには、抗菌活性を評価するための堅牢な in vitro 法が必要です。この論文では、関節置換術における持続送達デバイスとして使用される薬物溶出UHMWPEの抗菌活性を決定するためのそのようなリアルタイム方法の1つについて説明します。
細菌の生存率のリアルタイムモニタリングは重要なパラメータであり、従来の微生物学的方法では、研究のこの特定の側面に対応するためのフレームワークが欠けています。本研究で用いた微生物生存率アッセイは、アデノシン三リン酸(ATP)に対応する発光を測定することにより、生菌を定量するために開発されました。インプラント材料から溶出した抗生物質の時間依存活性を直接調査するために、異なる抗生物質感受性プロファイルを持つ3つの異なる株をそれらと一緒にインキュベートしました。ゲンタマイシンおよびバンコマイシンに対する耐性が異なる実験室および臨床株を使用する理論的根拠は、所与のインプラント製剤の活性の範囲を理解することであった。さらに、これらの別個の集団に対する抗菌活性および有効性は、投与のタイミングに依存する。この方法は、手術時の創傷の汚染によって引き起こされる人工関節周囲感染の>70%に基づいて、これらの株に対する予防の実現可能性に焦点を当てています24。
この方法を開発するための出発接種材料として、1 x 105 CFU/mLを使用しました。動物モデルにはさまざまな汚染濃度が使用されていますが、PJIの臨床的に関連する感染量についてはあまり知られていません。PJIの動物感染モデルは、1 x 105 CFUを使用して日常的に確立されており、抗菌活性を決定するための標準化された方法(CLSI)でも同様の範囲が広く使用されています25、26、27。初期汚染濃度として1 x 105 CFU/mLを使用することで、増殖パラメータと根絶パラメータの両方を同時に評価することができました。
従来、MIC値は、特定の数の細菌に対して一定の抗生物質濃度に対して決定され、抗菌作用の速度を実証することはできませんでした。この態様のために、MIC値は、抗菌活性プロファイル28を記述するための定量的差別化を提供しない。現在の方法のデータは、MICを使用して投与量を決定するよりも、抗生物質の菌株依存的な殺傷動態を評価することの利点を強調しています。この方法を使用すると、インプラント材料が異なる菌株に影響を与える程度と速度の両方を区別することができました。インプラント材料ストリップから溶出したゲンタマイシンは、L1163を1日で根絶し、ATCC 12600を2〜3日で根絶するのに有効でしたが、L1101の根絶には効果がありませんでした(図4)。L1101(MIC >32 μg/mL)に対するゲンタマイシン溶出の活性は、その固有のゲンタマイシン耐性(図4C)のために予想される欠如に加えて、L1101が中間耐性を示すバンコマイシンに曝露された場合、亜集団の持続が観察された。対照的に、L1163は、L1101と同様のバンコマイシンに対する中間耐性を示すにもかかわらず、バンコマイシン溶出UHMWPEの存在下で決定的に根絶されました(両方の株で8μg/mLのMICが観察されています)。
同様のMIC値(両方の株で1μg/mLのMICが観察されている)でゲンタマイシン感受性である12600およびL1163に対するゲンタマイシンの活性速度が異なり、中間耐性L1101およびL1163に対するバンコマイシンの活性の程度が異なるという観察(図4A、B)、溶出物質の存在下でのこのリアルタイム法が活性の縦方向の違いを区別できるという仮説を支持した。
所与の溶出濃度がこれらの細菌に対してどれほど効果的であるかを解釈する結果の翻訳値に加えて、いくつかの実験方法論的利点があります。(1)細菌濃度は、細菌をブロス中または寒天上で18〜24時間インキュベートして生存率を決定する従来の方法とは対照的に、所定の時間に瞬時に決定される。この成長期間は、細菌が抗生物質ストレスから回復するための追加の時間を提供し、エラー/変動の可能性のある追加の原因を導入する可能性があります。(2)培地は細菌を保持したまま継続的に交換され、静的条件よりも 生体内 条件によく似ています。(3)このアッセイは、インプラントからの薬物放出動態を本質的に含み、より良い性能予測を可能にする。(4)この方法は、特定の機械や高価な機械を必要とせずに、一般的に入手可能な消耗品を使用して開発されました。
薬物送達アプリケーションを評価するための堅牢なin vitro 試験方法は、 in vivo 動物試験および臨床試験に進む前に必要です。このアッセイは、粒子、ゲル、フィルム、その他の薬物溶出物質などのさまざまなアプローチや薬物送達プラットフォームに対応するように変更および適合させて、シミュレートされた in vitro セットアップでの細菌根絶の効率を決定することができます。改変は、いくつかの抗生物質の活性に影響を及ぼすことが示されている適切な インビトロ 培地環境に変更することによってサンプルセットアップのために行うことができる29、30。
この方法はまた、最小バイオフィルム除菌濃度を決定する従来の方法は時間がかかり、一貫性のない結果をもたらすため、生存可能な付着細菌の測定を容易にし、これは有望です。ただし、この方法は、バイオフィルムで厳密にテストして、その感度を決定するための信頼性が高く堅牢な方法論を開発することです。ATPベースの発光法は、可視コロニーとして寒天プレート上で検出される場合と検出されない場合がある、持続性物質を含むバイオフィルム中の生存形態の細菌を検出するのに十分な感度を有する可能性がある。まとめると、この汎用性の高いプラットフォームは、関連するパラメータを組み込んで、関心のある薬物の抗菌および抗バイオフィルム活性に関するリアルタイムの観察を記録する可能性があります。
この方法の有効性は、次の側面によって支配されます。
事前に決定された溶出特性とサンプルサイズ
抗生物質溶出物質の溶出プロファイルは、この抗菌活性測定の前に別の実験で特定することができ、規定時間内に実験を積極的に実施するために必要な材料の量を決定できます。
コンテナと容量の決定
実験の培地体積が同じ材料の表面積全体を収容できるセットアップを考案し、薬物装填表面からの薬物の妨げられない放出に十分な体積を確保することが重要です。使用したセットアップは以前の実験に基づいており、これらの親水性薬物の「完璧なシンク」条件を確保し、溶解性の制限によって拡散が妨げられないようにしました。
成長培地の特性
選択した薬剤の安定性と最適な性能を確保するために、増殖培地の選択を検討する必要があります29。ブロス希釈法で広く使用されている陽イオン調整ミューラーヒントンブロス(CAMHB)を使用して、既知の抗生物質のMICを測定しました。培地は、毒性二次代謝産物蓄積の干渉なしに最適な薬物活性を可能にする31。アッセイ試薬は、血清成分23,28を含むものを含むさまざまなタイプの培地で安定していることが試験され、報告されています。相対発光単位値は異なる媒体間で変化し得るが、媒体の成分はアッセイ32、33を妨げないことが実証されている。実験容積はさらに1.5mLに最適化され、これは成人膝関節腔34に存在する滑液量に近い。
アッセイの温度安定性
アッセイへの発光試薬の取り扱いおよび添加は、実験全体にわたって一貫した方法で実施されるべきである。温度変化はアッセイの感度を変化させるので、細菌23に添加する前に試薬を室温で2時間インキュベートすることが重要です。
試薬インキュベーション時間
試薬からの発光は時間とともに減衰します。発光シグナルは30分以上の半減期を有し、これは実験23で用いた培地および細菌の種類に大きく依存する。さらに、インキュベーション時間(すなわち、試薬を細菌に添加してから発光を読み取るまでの時間)に違いがあると、同じ濃度の細菌に対して一貫性のない測定値が得られます。製造元の指示に従って、5分間のインキュベーション時間から1分以内に摂取した場合、発光シグナルに5%の差が観察されました(補足図 2)。このデータを考慮に入れて、信号損失が5%を超えないように、研究を通して1分以内に発光測定値が記録されました。さらに、最初のウェルから最後のウェルへの発光減衰によって生じる誤差を減らすために、プレートあたりのサンプル数を制限することが重要です。
研究全体の細菌集団の維持
この方法は、10,000 x g で10分間の高速遠心分離を使用して、各時点で使用済み培地を細菌集団から継続的に分離することにより、薬物クリアランスと滑膜体積代謝回転をモデル化しようとしました35。この重要なステップは、すべての生存および非生存細菌細胞の沈降を確実にします。これに加えて、沈降した細菌は新鮮なMHBで均一に再構成され、シリンジセットアップに移され、影響を受けた微生物集団の実験セットアップへの完全なキャリーオーバーが容易になります。この方法の再現性と信頼性は、最初の接種材料に由来する微生物集団への抗生物質の持続的な曝露をシミュレートすることに大きく依存しています。
この方法の主な制限は、薬物の半減期と継続的な滑膜代謝回転を正確にシミュレートしない半静的アッセイであることです。ただし、継続的な培地交換により、この制限を部分的に補うことができます。微生物生存率アッセイの感度は株に依存し、1 x 102-1 x 10 4 CFU/mLの範囲であり、検出能力が制限されていました。さらに、菌株の種類が発光試薬の感度と性能に寄与するため、生物ごとに標準曲線をプロットする必要があります。細菌の増殖動態と使用される薬物化合物の活性の両方が培地成分によって影響を受ける可能性があり、さらに調査する必要があります。
Disclosures
シニア著者(E.O.)は、Corin、Iconacy、Renovis、Arthrex、ConforMIS、Meril Healthcare、Exactechの企業への知的財産のライセンスから生じるロイヤルティを受け取ります。ここに提示されたどの研究とも利益相反はありません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所助成金番号AR077023(R01)およびハリス整形外科研究所によって部分的に資金提供されました。著者らは、臨床株L1101およびL1163を提供してくれたロードアイランド大学のKerry Laplante博士と彼女のチームに感謝しています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates - polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
| ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
| BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
| BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
| BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
| Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
| Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
| Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
| Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
| Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
| Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
| Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
| Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
| Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
| press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
| ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
| Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
| UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
| Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
| WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |
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