Summary
Burada, ticari olarak temin edilebilen gerçek zamanlı ATP bazlı lüminesan mikrobiyal canlılık testi kullanarak profilaktik klinik uygulamayı simüle etmek için antibiyotik salınımlı bir polimerin antibakteriyel etkinliğini değerlendirmek için bir protokol sunuyoruz. Bu yöntem, ilaç salınımlı malzemelerin uzunlamasına aktivitesinin izlenmesini sağlar ve anti-mikrobiyal ilaç dağıtım platformlarını test etmek için yaygın olarak uyarlanabilir.
Abstract
Ultra yüksek molekül ağırlıklı polietilen (UHMWPE), toplam eklem artroplastilerinde yük taşıyıcı bir yüzey olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Çoğunluğu eklem replasmanından kısa bir süre sonra ortaya çıkan periprotez eklem enfeksiyonları, total diz revizyon ameliyatlarının yaklaşık %25'ini oluşturur ve bakteriyel enfeksiyonun tamamen ortadan kaldırılması büyük bir zorluk teşkil eder. Bu sorunun üstesinden gelmenin umut verici bir yolu, rutin sistemik antibiyotik profilaksisini desteklemek için bakterileri inhibe etmek için yeterli antibiyotik konsantrasyonlarının lokal olarak sürekli verilmesini sağlamaktır. Etkili yerel ilaç dağıtım cihazlarının geliştirilmesine yönelik araştırmalar artmaktadır. İlaç salınımlı materyallerin antibakteriyel etkinliğini test etmek için ilaçlar için belirlenmiş antibakteriyel test yöntemleri kullanılabilse de, bu cihazlardan antibiyotiklerin elüsyon profilleri ile ilişkilendirilebilecek gerçek zamanlı ve uzunlamasına antibakteriyel etkinlik verilerinin sağlanması açısından eksiktir. Burada, antibiyotik salınımlı UHMWPE implantlarının antibakteriyel etkinliğini belirlemek için doğrudan ve çok yönlü bir metodoloji sunuyoruz. Bu metodoloji, uzun bir deneyin her zaman noktasında bakteri kültüründen kaçınmak için bir platform olarak kullanılabilir ve ayrıca diğer yerel ilaç dağıtım cihazlarına uyarlanabilir.
Introduction
Osteoartrit, dünya çapında 500 milyon yetişkini etkileyen önemli bir dejeneratif durumdur1. Son dönem artrit tedavisinde altın standart, 2030 yılına kadar yalnızca Amerika Birleşik Devletleri'nde yılda 2 milyondan fazla hastada gerçekleştirilmesi öngörülen total eklem replasmanıdır2, küresel talep de muazzam bir şekilde artmaktadır 3,4. Prosedür, derzlerin eklemli kıkırdaklı yüzeylerinin metal/seramikten ve yüksek oranda çapraz bağlı ultra yüksek moleküler ağırlıklı polietilenden (UHMWPE) yapılmış yük taşıyıcı sentetik malzemelerle değiştirilmesini içerir. Total eklem replasmanları, artrit5'ten muzdarip hastalar için yaşam kalitesini önemli ölçüde artırır, ancak implantların performansını ve hastaların memnuniyetini tehlikeye atan önemli bir komplikasyon, revizyon ameliyatlarının% 15-25'ini oluşturan periprotez eklem enfeksiyonudur (PJI)6. Çoğu durumda enfeksiyonun nedeninin, ameliyat sırasında implant bölgesinin mikrobiyal kontaminasyonu olduğuna inanılmaktadır7. Kirletici popülasyon daha sonra implant ve doku yüzeylerinde genişler8. Konakçı bağışıklık sistemi yanıt olarak tetiklenir, ancak kirletici organizmaların büyüme hızı ve biyofilm oluşumu, bağışıklık hücrelerinden kaçmalarını sağlayabilir, bu da bakterilerin yok edilmesi olmadan artmış bir sitokin ve kemokin fırtınasına yol açabilir9,10,11. Ortaya çıkan kemiğin derin enfeksiyonu, implantın fiksasyonunu ve performansını ve hastanın sağlığını tehlikeye atar12.
Staphylococcus aureus ve koagülaz negatif stafilokoklar PJI13'ün baskın nedensel organizmalarıdır. Stafilokok enfeksiyonlarının şiddeti, antibiyotiklere karşı artan dirençleri, biyofilm oluşumu ve küçük koloni varyantları olarak devam edebilme yetenekleri nedeniyle yüksektir14,15,16. İmplant ile ilişkili enfeksiyonlar, mikroorganizmaların implant yüzeyine yapışması ve bakterilerin zararlı konakçı immün faktörlerinden ve etkili antibiyotik konsantrasyonlarından kaçmasını sağlayan karmaşık bir biyofilm matriksinin kurulması nedeniyle oluşur14,15,16. Konvansiyonel tedavi yöntemleri uzun süre intravenöz ve oral antibiyotik kombinasyonlarını içerir17. Bu yaklaşımın en büyük dezavantajı, ilacın enfeksiyon bölgesinde düşük biyoyararlanımı ve tedavi süresi boyunca bakterileri tutarlı bir şekilde yok etmek için yeterli antibiyotik konsantrasyonlarına ulaşmanın zorluğudur ve bu da genellikle kötü sonuçlara neden olur18. Bu eksiklikleri gidermek için, tamamen işlevsel lokalize ilaç salınımlı UHMWPE implantı, etkili antibiyotik konsantrasyonlarının eklem boşluğuna sürekli olarak salınmasını sağlamak için tasarlanmıştır19. İlaç salınımlı implanttan lokal elüsyon, implantın çıkarılmasından ve dokunun debridmanından sonra kalan bakterilerin büyümesini ve kolonizasyonunu önlemek için tamamlayıcı bir araç olarak kullanılır. Bu antibiyotik salınımlı UHMWPE'nin in vitro antibakteriyel testi, materyalin doğrudan bakterilerle inkübe edilmesi ve bakterilerin yayılma plakası yöntemi20,21 ile ölçülmesiyle gerçekleştirilebilir. Alternatif olarak, elüent ortamın alikotları, agar disk difüzyon yöntemi, et suyu seyreltme yöntemleri ve zaman öldürme testi22 gibi yöntemler kullanılarak bakterilere karşı test edilebilir. Tüm bu yöntemler, alikotların toplanmasından yaklaşık 16-18 saat sonra koloni sayımı ve bulanıklık ölçümleri yoluyla büyüme gözlemine dayanır. Bu tür cihazlardan antibiyotiklerin elüsyonu, bu in vitro yöntemler kullanılarak uzunlamasına ölçülebilir; Bununla birlikte, bu konsantrasyon profillerinin translasyonel değerini belirlemek için, antibakteriyel aktiviteyi değerlendirmek için sağlam bir gerçek zamanlı in vitro yönteme ihtiyaç vardır.
Bu çalışmada kullanılan mikrobiyal canlılık testi, lusiferin-lusiferaz bazlı algılama teknolojisi kullanılarak canlı bir bakteri hücresinden salınan adenosin trifosfata (ATP) karşılık gelen lüminesansı ölçerek canlı bakterilerin nicelleştirilmesi için geliştirilmiştir. ATP, canlı hücrelerin enerji para birimi olarak, fizyolojik olarak canlı hücrelerin doğrudan bir göstergesi olarak hizmet eder. Reaktif, ATP moleküllerini canlı hücrelerden serbest bırakan ve daha sonra lüminesans şeklinde tespit edilen hücre lizisi gerçekleştirir. Bu lüminesans, numune23 içindeki canlı bakteri hücrelerinin oranı ile doğrudan bir korelasyona sahiptir. Bu, hem gram-pozitif hem de gram-negatif mikroorganizmalarla çeşitli tahlil tasarımlarına ve koşullarına uyarlanabilen gerçek zamanlı, basit, çok yönlü, hızlı, tek reaktif bazlı bir tahlildir. Burada, mikrobiyal canlılık testine (örneğin, BacTiter Glo) dayanan modifiye edilmiş bir zaman öldürme testi kullanarak, S. aureus'un laboratuvar ve klinik suşları ile inkübe edilen antibiyotik salınımlı UHMWPE'nin gerçek zamanlı antibakteriyel aktivitesini belirlemek için bir yöntem sunuyoruz. Metodoloji belirli bir implant malzemesi ve spesifik bir ortopedik uygulama ile tanımlanırken, yöntem diğer antibiyotik salınımlı dağıtım cihazlarını klinik uygulamalarla test etmek için bir platform sağlayabilir.
Protocol
1. Reaktiflerin hazırlanması
- Mueller-Hinton suyu (MHB) preparatı: 22 g katyon ayarlı MHB'yi 1 L deiyonize suda çözün. Ortamı 20 dakika boyunca 121 ° C ve 15 lb basınçta otoklavlayın ve şişenin gevşek bir şekilde kapatıldığından emin olun. Hazırlanan steril suyu kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
- Triptik soya agar (TSA) preparatı: 20 g TSA tozunu 500 mL deiyonize suda çözün. Agar karışımını 121 ° C'de ve 15 lb'de 20 dakika boyunca otoklavlayın. Erimiş agarın sıcaklığını düşürmek için steril ortamı 55 ° C'lik bir su banyosuna aktarın. Soğutulmuş hazırlanmış agar'ı steril Petri kaplarına (~ 15 mL) dökün ve katılaşmasını sağlayın. Yoğuşmayı önlemek için katılaşmış agar plakalarını ters çevrilmiş olarak saklayın.
- Triptik soya suyu (TSB) preparatı: 15 g TSB tozunu 500 mL deiyonize suda çözün. Et suyu karışımını 121 ° C'de ve 15 lb'de 20 dakika boyunca otoklavlayın. Hazırlanan steril suyu kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
- Fosfat tamponlu salin (PBS): Otoklav, steril kullanımdan önce 121 ° C'de 1x PBS ve 20 dakika boyunca 15 lb ticari olarak satın alındı.
- Mikrobiyal canlılık testi reaktif preparatı: Tahlilin içeriğini oda sıcaklığına dengeleyin. 10 mL tamponu liyofilize ışıldayan reaktif tozu ile karıştırın ve hazırlanan reaktifi -20 ° C'de 1 mL alikot olarak saklayın. Her zaman noktasından önce, ışığa duyarlı reaktifi çözün ve oda sıcaklığına getirin.
- Gentamisin sülfat stok çözeltisi: 80 mg gentamisin sülfat (GS) 10 mL 1x PBS içinde çözülür. 8 mg/mL GS stok çözeltisi elde etmek için ilaç çözeltisini iyice vorteksleyin.
- Vankomisin hidroklorür stok çözeltisi: 1 mg / mL stok çözeltisi elde etmek için 10 mg vankomisin hidroklorür tozunu 10 mL deiyonize su içinde iyice çözün.
- Borik asit tampon çözeltisi: 24.7 g (0.4 M) borik asidi 900 mL deiyonize su içinde çözün. Çözeltinin pH'ını% 50 (w / v) sodyum hidroksit çözeltisi ile 10.4'e ayarlayın. Bu adıma ek olarak, 1 L'ye çıkarmak için deiyonize su ekleyin.
- O-ftaldialdehit reaktifi (OPA): 0.2 g OPA'yı 1 mL metanol içinde çözün. OPA çözeltisine 19 mL 0.4 M borik asit tamponu (pH 10.4) ekleyin. OPA-borik asit karışımına 0.4 mL 2-merkaptoetanol ekleyin. Reaktif şişesini alüminyum folyo ile örtün ve hazırlıktan sonra 2-3 güne kadar kullanmak üzere 4 ° C'de saklayın.
DİKKAT: Cilt, göz ve giysilerle temastan kaçının. OPA ve 2 merkaptoetanol reaktiflerinin taşınması, uygun kişisel koruyucu ekipman giyilirken yalnızca uygun egzoz havalandırmasına sahip bir duman davlumbazının altında yapılmalıdır. Buharları, tozu veya aerosolleri solumaktan kaçının.
2. Bakire ve ilaç yüklü UHMWPE hazırlanması
- Gentamisin sülfat ve vankomisin hidroklorür tozlarının her birini bir elek (75 μm gözenek boyutu) ile 2 g eleyin ve 18-24 saat boyunca vakumlu fırında (<0.1 atm) 45 ° C'de dehidrat edin.
- Susuz bırakılmış ilacı, 5 dakika boyunca mekanik bir karıştırıcı kullanarak bir kapta% 7 w / w (1.12 g antibiyotik + 14.88 g UHMWPE) UHMWPE tozu ile karıştırın.
- Paslanmaz çelik kesici uç plakalı alüminyum bronz özel bir kalıbı (85 mm x 50 mm) konveksiyonlu fırında 1 saat boyunca 180 ° C'ye ısıtın. Presin plakalarını önceden 170 ° C'ye ısıtın.
- Harmanlanmış tozu kalıba ekleyin ve 10 MPa, 170 ° C'de 10 dakika sıkıştırın, ardından 10 MPa'da 45 dakikalık bir su soğutma döngüsü izleyin.
- Kalıplanmış UHMWPE bloğunu (~3,5 mm) bir hidrolik pres kullanarak presten çıkarın.
- Yüzey düzensizliklerini ve kirleticileri gidermek için bilgisayarlı bir sayısal kontrol (CNC) kullanarak bloğun üst ve alt yüzeylerini frezeleleyin.
- CNC kullanarak bloğu 3 mm x 5 mm x 20 mm şeritler halinde kesin.
- Bakire UHMWPE (antibiyotik ilavesi olmadan), çalışma için bir kontrol olarak tanımlandığı gibi aynı metodolojiyi kullanarak hazırlayın.
Ek Şekil 1: UHMWPE numunelerinin kalıplanmasında kullanılan kalıbın parçaları. (A) Paslanmaz çelik kesici uç plakası; (B) kalıp boşluğu; (C) piston; (D) arka plaka Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
3. İlaç salınımlı UHMWPE'nin elüsyon kinetiğinin belirlenmesi
- 3 mm x 5 mm x 20 mm'lik bir şeridi, Luer kilidi ve 25 G iğnesi olan 3 mL'lik bir şırıngaya yerleştirin.
- Şırıngayı deiyonize suyla doldurarak ve şırıngayı birkaç kez ters çevirerek şeridi yıkayın.
- Şırıngayı 2 mL mezuniyete kadar deiyonize suyla doldurun.
- Şırınga düzeneğini oda sıcaklığında 100 rpm'de bir çalkalayıcıya yerleştirin.
- Her zaman noktasında (6 saat, 1 gün, 2 gün, 3 gün, 1 hafta), elüenti 2 mL'lik bir şişede toplayın.
- Her zaman noktasında, şırıngayı deiyonize suyla doldurarak ve şırıngayı ters çevirerek şeridi yıkayın. Çözeltiyi atın ve bir sonraki zaman noktasına kadar deneye devam etmek için şırıngayı 2 mL mezuniyete kadar deiyonize suyla doldurun.
4. Vankomisin konsantrasyonunun belirlenmesi
- Vankomisin konsantrasyonunu deiyonize suda spektrofotometrik olarak 280 nm'lik bir tepe absorpsiyon dalga boyunda tespit edin.
- UV 96 kuyucuklu plakaya 100 μL 1 mg/mL stok çözeltisi ekleyerek ve altı seviye bilinen konsantrasyon (1 mg/mL ila 0,03125 mg/mL) elde etmek için 100 μL deiyonize su kullanarak seri olarak seyrelterek bilinen konsantrasyon aralığı standartlarını hazırlayın.
- Elüentlerin 100 μL'sini UV berraklığında 96 delikli plakalara aktarın ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak konsantrasyonu 280 nm'de belirleyin.
- Bilinen ilaç konsantrasyonlarını karşılık gelen absorbans değerlerine göre çizerek bir kalibrasyon eğrisi oluşturun. Kalibrasyon eğrisi tarafından oluşturulan doğrusal denklemi kullanarak elüentteki bilinmeyen ilaç konsantrasyonunu hesaplayın.
- Konsantrasyonu elüent hacmi (~ 1.7 mL) ile çarparak ilaç kütlesini belirleyin.
- İlaç salınımını önceki tüm zaman noktalarından toplayarak bir zaman noktasında kümülatif ilaç salınımını (mg) hesaplayın.
- İmplantın santimetre karesi (cm2) başına kümülatif ilaç salınımını belirlemek için ilaç salınımını şeridin yüzey alanına (3,5cm2) normalleştirin.
5. OPA etiketleme yöntemi ile gentamisin konsantrasyonunun belirlenmesi 27
- OPA testini gerçekleştirmek için GS standart çözümleri hazırlayın.
- 80 μg/mL GS çözeltisinin 1 mL'sini bir santrifüj tüpüne aktarın.
- Beş santrifüj tüpüne daha 500 μL PBS ekleyin.
- 80 μg/mL, 40 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL ve 2,5 μg/mL GS konsantrasyonları elde etmek için bu tüplerle seri seyreltme gerçekleştirin. Bunlar tahlil için kalibrasyon çözeltileri olarak hizmet eder.
- Net bir 96 delikli plakada, artan konsantrasyonda A-1 kuyusuna 80 μL PBS ve A-2 ila A-7 kuyularına 80 μL kalibrasyon çözeltisi ekleyin. Bu, tahlil için dahili bir kalibrasyon görevi görür.
- Aynı 96 delikli plakada analiz edilmek üzere üçlü olarak boş kuyucuklara her numuneden 80 μL ekleyin. Kuyu plakası başına numune sayısını <50 ile sınırlandırın, böylece numunelere OPA çözeltisinin eklenmesinin zamanlaması tüm numuneler için yaklaşık olarak aynıdır ve buharlaşmayı önler.
- OPA reaktifini tüm standartlara ve numune çözeltilerine ekleyin.
- Bir duman davlumbazında, 25 mL'lik bir reaktif haznesini metanol ile doldurun.
- İkinci bir reaktif rezervuarına 8 mL metanol ve hazırlanan OPA çözeltisinden 1 mL ekleyin (bölüm 1.8). Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
- Çok kanallı 100 μL mikropipet ile, 96 delikli plakadaki numune içeren tüm kuyucuklara ilk hazneden 48 μL metanol ekleyin.
- Bu adıma ek olarak, ikinci rezervuardan 96 delikli plakadaki tüm numune içeren kuyucuklara 72 μL seyreltilmiş OPA çözeltisi ekleyin. Kuyu plakasını oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
- 10 dakikalık inkübasyondan hemen sonra bir mikroplaka okuyucu kullanarak floresan yoğunluğunu (340 nm uyarım, 455 nm emisyon) ölçün.
- Bilinen GS konsantrasyonlarına sahip çözeltiler için yoğunluk okumalarını kullanarak kalibrasyon eğrisini çizin. En uygun olanı belirlemek ve karşılık gelen denklemi oluşturmak için doğrusal bir çizgi ekleyin.
- Elüentteki ilaç konsantrasyonunu, bilinen ilaç konsantrasyonlarını karşılık gelen absorbans değerlerine göre çizerek oluşturulan kalibrasyon eğrilerinden hesaplayın.
- Konsantrasyonu elüent hacmi (~ 1.7 mL) ile çarparak ilaç kütlesini hesaplayın.
- İlaç salınımını önceki tüm zaman noktalarından toplayarak bir zaman noktasında kümülatif ilaç salınımını (mg) belirleyin.
- İmplantın santimetre karesi (cm2) başına kümülatif ilaç salınımını belirlemek için ilaç salınımını şeridin yüzey alanına (3,5cm2) normalleştirin.
6. Bakteri preparatı
NOT: Bu çalışmada aşağıdaki S. aureus suşları kullanılmıştır: tip suşu 12600, klinik suşlar L1101 ve L1163 (Rhode Island Üniversitesi'nden Dr. Kerry LaPlante'den alınmıştır). Bu suşların duyarlılık profilleri Tablo 1'de sunulmuştur.
| Bakteri suşları | Gentamisin MIC | Vankomisin MIC | |
| ATCC 12600 · | ≤1 μg/mL (Hassas) | ≤0,5 μg/mL (Hassas) | |
| L1101 (Klinik suş) | ≥16 μg/mL (Dirençli) | 8 μg/mL (Orta) | |
| L1163 (Klinik suş) | ≤1 μg/mL (Hassas) | 8 μg/mL (Orta) | |
Tablo 1: Kontrol ve klinik S. aureus suşlarının antibiyotik duyarlılık profilleri.
DİKKAT: Bakteri kültürlerinin ve süspansiyonlarının elleçlenmesini içeren tüm adımlar, Sınıf II, Tip A2 Biyogüvenlik Kabini içindeki bir BSL-2 laboratuvar alanında gerçekleştirilmiştir.
- S. aureus'un büyümesini kolaylaştırmak için bakteri stoklarını -80 ° C'den TSA plakalarına çözün. Plakaları gece boyunca 35 ° C'de statik olarak inkübe edin.
- Gece boyunca yetiştirilen agar plakası kültürlerinden iki ila üç koloniyi 1 mL steril TSB'ye aktarın ve 35 ° C'de gece boyunca statik olarak inkübe edin.
- 600 nm'de absorbansı belirleyerek bulanıklığı spektrofotometrik olarak ölçmek için 100 μL bakteriyi berrak bir 96 delikli plakaya aktarın.
- Lüminesan tahlili kullanarak canlı bakteri sayısını belirlemeden önce steril MHB kullanarak bakterileri 10.000 kat seyreltin.
7. Gerçek zamanlı mikrobiyal canlılık testinin yapılması
- Lüminesans bazlı tahlili beyaz opak tabanlı 96 delikli plakalar kullanarak gerçekleştirin.
- 100 μL seyreltilmiş bakteri süspansiyonlarını, bölüm 1.5'te hazırlanan 100 μL tahlil reaktifi ile karıştırın.
- Hazırlanan 96 delikli plakanın üzerine alüminyum folyo ile kaplı bir kapak yerleştirin ve 100 rpm çalkalayarak 5 dakika boyunca inkübe edin.
- Gen5 3.11 yazılımında aşağıdaki ayarları kullanarak bir mikro plaka okuyucu ile lüminesansı hemen ölçün.
- Görev Yöneticisi penceresinde bir protokol ayarlamak için Yeni'yi tıklatın.
- Plaka Tipi için açılır menüden Costar 96 beyaz opak'ı seçin.
- Adımları Seç > Eylemler menüsünün altındaki Oku'ya tıklayın.
- Read Method (Okuma Yöntemi) penceresinde Luminescence (Lüminesans) öğesine tıklayın. Okuma türü ve optik türü altında Uç nokta/kinetik ve Lüminesans fiber seçeneklerini seçili tutun. Tamam'a tıklayın.
- Okuma Adımı penceresinde
ayarları koruyun (kazanç = 135; entegrasyon süresi = 1 sn; okuma yüksekliği = 4,5 mm). Tamam'a tıklayın. - Plaka düzeni penceresi çalışmaya hazır görünür. Yükleme plakası penceresindeki Kapağı Kullan kutusunu işaretleyin ve Tamam'a tıklayın.
- Lüminesans değerlerini okumak için 96 delikli plakayı makineye yerleştirin.
8. Her bakteri suşu için canlı sayım standart eğrisine karşı bir lüminesans oluşturma
NOT: Tüm S. aureus suşlarını bölüm 6'da açıklanan metodolojiye göre kültürleyin ve numaralandırın.
- Standart olarak kullanılmak üzere seri olarak seyreltilmiş bakteriyel süspansiyonlar hazırlayın.
- Bulanıklığı spektrofotometrik olarak ölçerek gece boyunca yetiştirilen bakteriyel süspansiyonu numaralandırın.
- Bakterileri pelet etmek için 5 dakika boyunca 6.000 × g'da santrifüj yapın ve konsantrasyonu 1 x 109 CFU / mL'ye ayarlamak için peleti steril MHB'de yeniden askıya alın.
- 900 μL MHB kullanarak 100 μL temiz süspansiyonu seyreltin ve 1 x 101 CFU /mL'ye ulaşmak için 10 kat seri seyreltme gerçekleştirin.
- Hazırlanan bakteriyel süspansiyonlar üzerinde lüminesans testini bölüm 7'de açıklandığı gibi gerçekleştirin.
- Steril MHB'yi deney için boş bir kontrol olarak kullanın ve boş lüminesans değerini test numunesi lüminesans değerlerinden çıkarın.
- Standart bir eğri oluşturmak için günlüğü (CFU) kütüğe (lüminesans) karşı çizin. Denklemi ve R2 değerini kaydedin.
- Etüt boyunca gerinim spesifik denklemi kullanarak lüminesans değerlerine karşılık gelen CFU/mL'yi belirleyin.
9. Zamana bağlı antibakteriyel aktivite çalışması kurulumu
Şekil 1: Deney düzeneğinin şematik bir gösterimi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
- Bakterileri 1 mL TSB suyunda bir gecede kültürleyin.
- Gece boyunca yetiştirilen bakteri süspansiyonunu steril MHB'de 105 CFU / mL'ye seyreltin (bölüm 6) ve deneyin başlamasından önce lüminesans birimlerini kullanarak canlı bakteri sayısını doğrulayın (bölüm 7).
- Bakire UHMWPE ve ilaç yüklü UHMWPE şeritlerini (3 mm x 5 mm x 10 mm, bölüm 2'deki elüsyon çalışmaları için hazırlanan şeritlerin yarısı kadar) 3 mL'lik bir şırınga içine yerleştirin.
- 105 CFU/mL içeren MHB'yi, 1,35 mL MHB'ye eşdeğer olan 1,5 mL işaretine kadar bağlı iğneden şırıngaya çekin (Şekil 1: Adım 1).
- Şırınga kurulumunu, 6 saat, Gün 1, Gün 2, Gün 3, Gün 4, Gün 5, Gün 6 ve Gün 7'nin belirtilen zaman noktalarına kadar 37 ° C'de bir sallama inkübatörüne (100 rpm) yerleştirin (Şekil 1: Adım 2).
- Belirtilen her zaman noktasında, şırınga kurulumunu çıkarın ve 100 μL bakteriyel süspansiyon üzerinde bölüm 7'ye göre gerçek zamanlı bir mikrobiyal canlılık testi yapın (Şekil 1: Adım 3-4).
- 6 saat, Gün 1, Gün 2, Gün 3 ve Gün 7 zaman noktaları için canlı bakteri sayısını belirleyin. İlgili standart eğriyi kullanarak lüminesans birimlerinden CFU/mL'yi belirleyin.
- TSA plakaları üzerinde yayılma plakası yöntemini uygulayarak ve gece boyunca 35 ° C'de inkübe ederek tespit sınırının altında lüminesans değerleri gösteren numunelerde canlı bakteri bulunmadığını doğrulayın. Ertesi gün kolonilerin varlığını kontrol edin.
- Kalan bakteriyel süspansiyonu 10 dakika boyunca 10.000 × g'da santrifüj edin ve harcanan ortamı nazikçe aspire edin. İlaçların antibakteriyel aktivitesi nedeniyle peletlerin görsel olarak gözlenmediği tüplerde, görünmeyen peletin rahatsız edilmemesini sağlamak için tüpün içinde 100 μL bırakın (Şekil 1: Adım 5).
- Peletlenmiş bakterileri taze MHB'de yeniden askıya alın ve bakteriyel süspansiyonu ekli iğne aracılığıyla aynı şırınga kurulumuna geri çekin (Şekil 1: Adım 6).
10. UHMWPE yüzeyindeki yapışkan bakterilerin miktarının belirlenmesi
- 7. Günde çalışmanın tamamlanmasından sonra şırınga kurulumundan bakire UHMWPE ve ilaç yüklü UHMWPE yüzeylerini alın.
- Yüzeyleri 1,5 mL tüplere aktarın ve 1 mL steril PBS ile durulayın (üç kez).
- Yüzeyi 40 mL steril PBS'de 1 dakika boyunca sonikleştirin. Bölüm 7'de açıklandığı gibi, sonikasyonlu numunenin 100 μL'si üzerinde bir lüminesans testi yaparak yapışkan bakteri canlılığını belirleyin.
Representative Results
Protokolü takiben, UHMWPE gentamisin ve vankomisin ile% 7 w / w oranında kalıplandı ve deiyonize suya salındı. Materyalden elde edilen elüentteki ilaç konsantrasyonu 6 saat, 1 gün, 2 gün, 3 gün ve 1 haftada belirlendi. Vankomisin ve gentamisin yüklü UHMWPE'den ilaç salınımı 6 saatte bir patlama salınımı ve ardından 7 güne kadar minimum inhibitör konsantrasyonundan (MIC) daha yüksek bir salınım konsantrasyonu ile sabit bir salınım oranı göstermiştir (Şekil 2, Tablo 2).
Antibakteriyel çalışmadan önce, lüminesans birimlerini her bir S. aureus suşu (ATCC 12600, L1101 ve L1163) için bakterilerin CFU / mL'si ile ilişkilendirmek için standart bir eğri oluşturulmuştur. Karşılık gelen log (lüminesans) değerleri, standart bir eğri oluşturmak için kütüğe (CFU/mL) göre çizilmiştir (Şekil 3). Hesaplanan R2 değerleri, ATCC 12600, L1101 ve L1163 için sırasıyla 0.997, 0.996 ve 0.994 idi ve konsantrasyon aralığına güçlü bir uyum gösterdi. Elde edilen denklem daha sonra tüm deneylerde bakteri canlılığını hesaplamak için kullanıldı. ATCC 12600 ve L1101, 1 x 102-1 x 103 CFU/mL aralığında bir algılama sınırı göstermiştir. Öte yandan, L1163 suşu için algılama sınırının 1 x 104 CFU / mL olduğu gösterilmiştir.
Zamana bağlı antibakteriyel aktivite testi, 1 haftalık bir süre boyunca% 7 w / w ilaç salınımlı materyallere maruz kalan 12600, L1163 ve L1101 için başlangıç inokulum olarak 1 x 105 CFU / mL kullanılarak gerçekleştirildi. Her zaman noktasında (6 saat, 1 gün, 2 gün, 3 gün, 1 hafta), ortam yenilendi ve bakteri popülasyonu yeniden askıya alındı. Bakterilerin materyalden daha sonra ilaç salınımına maruz kalması, bir sonraki zaman noktasına kadar devam etti. %7 w/w vankomisin içeren UHMWPE ve %7/w gentamisin ile UHMWPE 6 saatten başlayarak duyarlı ATCC 12600 için >3log azalma gösterdi ve 3 günün sonunda tam eradikasyon (koloni büyümesi yok) gözlendi (Şekil 4A). Gentamisin-duyarlı ve vankomisin ara suşu L1163 için, her iki ilaç salınımlı materyal de 6 saatte >3log azalmaya neden oldu ve deneyin 1. gününde tam eradikasyon (koloni büyümesi yok) gözlendi (Şekil 4B). Gentamisin dirençli ve vankomisin ara suşu L1101 için, UHMWPE'den gentamisin elüsyonu L1101'in bakteriyel canlılığını etkilememiştir (Şekil 4C). Bakteriler çoğaldı ve popülasyon, antibiyotik elüsyonu olmadan bakire UHMWPE varlığında 6 saat içinde stabilize oldu. Gentamisin salınımlı UHMWPE'nin varlığında, nüfus 2. günde benzer bir büyüme seviyesine ulaştı. Aksine, UHMWPE'den vankomisin elüsyonu, 6 saatte bakteriyel canlılığı (>3log) önemli ölçüde azalttı ve 4. günde tam canlılık kaybı (koloni büyümesi yok) gösterildi.
Hem gentamisin salınımlı hem de vankomisin salınımlı UHMWPE'nin yüzeyleri, 7. günden sonra duyarlı ve orta dirençli suşlara maruz kaldığında veya hangisi önce gelirse gelsin tam eradikasyonda canlı yapışkan bakteri göstermedi. Gentamisin dirençli L1101'e maruz kalan gentamisin salınımlı UHMWPE üzerinde bazı canlı bakteriler (1 x 105 CFU / mL) mevcuttu. Benzer şekilde, kontrol bakire PE'den yaklaşık 1 x 10 5 CFU / mL canlı yapışkan bakteri geri kazanıldı (Şekil 5).
Şekil 2: Antibiyotik yüklü UHMWPE şeridi ile %7'den zamana bağlı ortalama antibiyotik salınımı. Bir %7 gentamisin ve vankomisin yüklü UHMWPE şeridinden (3 mm 3 x 5 mm 3 x 10 mm 3 ~ 2cm2 yüzey alanı) bir tanesinden zaman noktaları arasındaki ortalama antibiyotik salınımı. ATCC 12600 kontrol suşu karşısında MIC, gentamisin için noktalı bir çizgi ve vankomisin için katı bir çizgi olarak gösterilmiştir. Hata çubukları, ortalamanın altı kopyadan standart sapmasını temsil eder (n = 6). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Tüm S. aureus suşları için gerçek zamanlı ışıldayan tahlil standart eğrisi. Log (lüminesans), kontrol için standart eğriler, (A) ATCC 12600 ve klinik suşlar, (B) L1101 ve (C) L1163 oluşturmak için log'a (CFU / mL) karşı çizildi. En uygun çizgiyi ve karşılık gelen R2 değerlerini tanımlayan denklemler grafikler üzerinde belirtilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Bakteriyel canlılık, gentamisin salınımlı %7 ve vankomisin salınımlı UHMWPE ile %7 için ışıldayan bir tahlil kullanılarak belirlenmiştir. UHMWPE'den salınan gentamisin ve vankomisinin kontrol suşlarına, (A) ATCC 12600'e ve klinik suşlara, (B) L1163 ve (C) L1101'e karşı zamana bağlı antibakteriyel aktivitesi gösterilmiştir. Virgin 1020 PE, deney için bir kontrol görevi gördü. Grafiklerdeki sarı çizgi, ilgili S. aureus suşu için algılama sınırını gösterir. Veriler ortalama ± standart sapma (n=3) olarak gösterilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Tüm S. aureus suşlarına karşı %7/w gentamisin salınımlı ve %7/w vankomisin salınımlı UHMWPE için ışıldayan tahlil Glo testi kullanılarak yapışkan bakteri canlılığı belirlenmiştir. Çubuk grafik, test edilen tüm suşlar için çalışma süresinin sonunda% 7 gentamisin yüklü ve% 7 vankomisin yüklü UHMWPE'nin santimetre karesi (cm2) başına geri kazanılan yapışkan bakterileri (CFU) gösterir. Çubuklar verileri ortalama ± standart sapma olarak gösterir (n = 3). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.
| Zaman noktaları | Vankomisin | Gentamisin |
| Pik konsantrasyon (μg/mL) | Pik konsantrasyon (μg/mL) | |
| 0 - 6 saat | 336 ± 72 | 263 ± 24 |
| 6 saat -1 gün | 57 ± 18 | 16 ± 2 |
| 1 gün - 2 gün | 60 ± 18 | 7 ± 1 |
| 2 gün - 3 gün | 23 ± 6 | 5 ± 0.4 |
| 3 gün - 7 gün | 49 ± 20 | 15 ± 1 |
Tablo 2: Farklı zaman noktalarında pik ilaç konsantrasyonu (μg / mL). Veriler ortalama ± standart sapma olarak gösterilir (n=6).
Ek Şekil 2: Numuneye tahlil reaktifinin eklenmesinden itibaren 10 dakikalık bir süre boyunca lüminesans sinyali bozunması. Sinyaldeki %±5'lik bir fark noktalı çizgi olarak gösterilir Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız.
Discussion
Lokalize sürekli antibiyotik verilmesi, periprotez eklem enfeksiyonlarının yönetiminde gerekli bir araçtır. Sistemik antibiyotikler bakteriyel enfeksiyonun eradikasyonunda birincil stratejidir ve lokal elüzyon implantın çıkarılması ve dokunun debridmanından sonra kalan bakterilerin büyümesini ve kolonizasyonunu önlemek için tamamlayıcı bir araç olarak kullanılır. Yerel yönetimli antibiyotikler için eğri altındaki etkili alanın (bir süre boyunca konsantrasyon) amacı iyi anlaşılmamıştır. Bu tür cihazlardan antibiyotiklerin elüsyonu in vitro olarak uzunlamasına ölçülebilir; Bununla birlikte, bu konsantrasyon profillerinin translasyonel değerini belirlemek için, antibakteriyel aktiviteyi değerlendirmek için sağlam bir in vitro yönteme ihtiyaç vardır. Bu yazıda, eklem replasmanlarında sürekli bir dağıtım cihazı olarak kullanılacak ilaç salınımlı UHMWPE'nin antibakteriyel aktivitesini belirlemek için böyle bir gerçek zamanlı yöntem açıklanmaktadır.
Bakteriyel canlılığın gerçek zamanlı izlenmesi çok önemli bir ilgi parametresidir ve geleneksel mikrobiyolojik yöntemler, çalışmanın bu özel yönünü karşılayacak çerçeveden yoksundur. Bu çalışmada kullanılan mikrobiyal canlılık testi, adenozin trifosfata (ATP) karşılık gelen lüminesansı ölçerek canlı bakterilerin nicelleştirilmesi için geliştirilmiştir. İmplant materyallerinden salınan antibiyotiklerin zamana bağlı aktivitesini doğrudan araştırmak için, farklı antibiyotik duyarlılık profillerine sahip üç farklı suş inkübe edildi. Gentamisin ve vankomisine karşı değişen dirençlere sahip laboratuvar ve klinik suşların kullanılmasının mantığı, belirli bir implant formülasyonu için aktivite aralığını anlamaktı. Ayrıca, bu farklı popülasyonlara karşı antibakteriyel aktivite ve etkinlik, uygulamanın zamanlamasına bağlıdır. Yöntem, periprotez eklem enfeksiyonlarının %>70'inin ameliyat sırasında yaranın kontaminasyonundan kaynaklanmasına bağlı olarak bu suşlara karşı profilaksinin uygulanabilirliğine odaklanmaktadır24.
Bu yöntemi geliştirmek için başlangıç inokülumu olarak 1 x 105 CFU/mL kullanıldı. Hayvan modelleri için farklı kirletici konsantrasyonlar kullanılmıştır, ancak PJI için klinik olarak ilgili enfeksiyon yükü hakkında fazla bir şey bilinmemektedir. PJI için hayvan enfeksiyonu modelleri rutin olarak 1 x 105 CFU kullanılarak oluşturulmuştur ve benzer bir aralık antibakteriyel aktiviteyi belirlemek için standartlaştırılmış yöntemlerde (CLSI) yaygın olarak kullanılmaktadır25,26,27. İlk kirletici konsantrasyon olarak 1 x 105 CFU / mL'yi kullanmak, hem büyüme hem de eradikasyon parametrelerini aynı anda değerlendirmemizi sağladı.
Geleneksel olarak, MIC değerleri belirli sayıda bakteri için sabit bir antibiyotik konsantrasyonu için belirlenir ve antibakteriyel etki oranını gösteremezler. Bu yönüyle MIC değerleri, antimikrobiyal aktivite profilini tanımlamak için nicel bir farklılaşma sağlamaz28. Mevcut yöntemden elde edilen veriler, dozlama kararları vermek için MIC'yi kullanmak yerine, antibiyotiklerin suşa bağımlı öldürme kinetiğini değerlendirmenin avantajını vurgulamaktadır. Bu yöntemi kullanarak, implant materyallerinin farklı suşları hem ne ölçüde hem de ne oranda etkilediğini ayırt etmek mümkün olmuştur. İmplant materyal şeritlerinden salınan gentamisin, L1163'ün 1 günde eradikasyonunda ve ATCC 12600'ün 2-3 günde eradike edilmesinde etkiliydi, ancak L1101'in eradikasyonunda etkisizdi (Şekil 4). Doğal gentamisin direnci nedeniyle L1101'e (MIC >32 μg / mL) karşı gentamisin elüsyonunun beklenen aktivite eksikliğine ek olarak (Şekil 4C), L1101'in ara direnç gösterdiği vankomisine maruz kaldığında alt popülasyonların kalıcılığı gözlenmiştir. Buna karşılık, L1163, vankomisine karşı L1101 ile benzer ara direnç göstermesine rağmen, vankomisin salınımlı UHMWPE varlığında kesin olarak ortadan kaldırılmıştır (her iki suş için de 8 μg / mL'lik bir MIC gözlenmiştir).
Benzer MIC değerleriyle gentamisine duyarlı olan gentamisinin 12600 ve L1163'e karşı aktivite oranının farklı olduğu (her iki suş için de 1μg / mL'lik bir MIC gözlenmiştir) ve vankominin orta dirençli L1101 ve L1163'e karşı aktivite derecesinin farklı olduğu gözlemleri (Şekil 4A, B), salınım materyalinin varlığında bu gerçek zamanlı yöntemin aktivitedeki uzunlamasına farklılıkları ayırt edebileceği hipotezini destekledi.
Belirli bir salınımlı konsantrasyonun bu bakterilere karşı ne kadar etkili olabileceğini yorumlamada sonuçların translasyonel değerine ek olarak, birkaç deneysel metodolojik avantaj vardır. (1) Bakteri konsantrasyonu, canlılığı belirlemek için bakterilerin et suyunda veya agar üzerinde 18-24 saat boyunca inkübe edildiği geleneksel yöntemlerin aksine, belirli bir zamanda anında belirlenir. Bu büyüme periyodu, bakterilerin antibiyotik stresinden kurtulması için ek zaman sağlayabilir ve bu da ek bir olası hata / değişkenlik kaynağı oluşturabilir. (2) Ortam, statik koşullardan ziyade in vivo koşullara daha çok benzeyen bakterileri korurken sürekli olarak değiştirilir. (3) Bu tahlil doğal olarak implanttan ilaç salınım kinetiğini içerir ve bu da daha iyi performans tahmini sağlar. (4) Yöntem, herhangi bir özel veya pahalı makineye ihtiyaç duymadan yaygın olarak bulunan sarf malzemeleri kullanılarak geliştirilmiştir.
İlaç dağıtım uygulamalarını değerlendirmek için sağlam in vitro test yöntemleri, in vivo hayvan çalışmalarına ve klinik çalışmalara geçmeden önce gereklidir. Bu tahlil, simüle edilmiş bir in vitro kurulumda bakteriyel eradikasyonun etkinliğini belirlemek için parçacıklar, jeller, filmler ve diğer ilaç salınımlı malzemeler gibi çeşitli yaklaşımlara ve ilaç dağıtım platformlarına uyacak şekilde değiştirilebilir ve uyarlanabilir. Numune kurulumu için modifikasyonlar, birkaç antibiyotiğin aktivitesini etkilediği gösterilen uygun bir in vitro ortam ortamına değiştirilerek gerçekleştirilebilir29,30.
Yöntem ayrıca, minimum biyofilm eradikasyon konsantrasyonunu belirlemek için geleneksel yöntemler zaman alıcı olduğundan ve tutarsız sonuçlar verdiğinden, umut verici olan uygulanabilir yapışkan bakteri tayinini kolaylaştırır. Bununla birlikte, yöntem, duyarlılığını belirlemek için güvenilir ve sağlam bir metodoloji geliştirmek için biyofilmler üzerinde titizlikle test edilmelidir. ATP bazlı ışıldayan yöntem, bir agar plakasında görünür koloniler olarak tespit edilebilen veya tespit edilemeyen kalıcılar da dahil olmak üzere biyofilmlerdeki canlı bakteri formlarını tespit etmek için yeterince hassas olabilir. Birlikte ele alındığında, bu çok yönlü platform, ilgili ilaçların anti-bakteriyel ve anti-biyofilm aktivitesi hakkında gerçek zamanlı gözlemleri kaydetmek için ilgili parametreleri dahil etme potansiyeline sahiptir.
Bu yöntemin etkinliği aşağıdaki yönlere tabidir:
Önceden belirlenmiş elüsyon özellikleri ve numune büyüklüğü
Antibiyotik salınımlı materyalin elüsyon profili, bu antibakteriyel aktivite ölçümünden önce ayrı bir deneyde tanımlanabilir, böylece deneyi öngörülen bir süre içinde aktif olarak yürütmek için gereken malzeme miktarı belirlenebilir.
Konteyner ve hacim tayini
Deneyin ortam hacminin aynı malzemenin tüm yüzey alanını barındırabileceği bir kurulum tasarlamak ve ilacın ilaç yüklü yüzeyden engelsiz salınması için yeterli hacmi sağlamak önemlidir. Kullanılan kurulum, önceki deneylere dayanıyordu ve bu hidrofilik ilaçlar için "mükemmel lavabo" koşullarını sağlıyordu, böylece difüzyonları çözünürlük sınırlamaları tarafından engellenmiyordu.
Büyüme ortamı özellikleri
Seçilen ilaç(lar)ın stabilitesini ve optimal performansını sağlamak için büyüme ortamı seçimi araştırılmalıdır29. Et suyu seyreltme yönteminde yaygın olarak kullanılan katyon ayarlı Mueller Hinton suyu (CAMHB), bilinen antibiyotiklerin MIC'sini belirlemek için kullanılmıştır. Ortam, toksik sekonder metabolit birikiminin müdahalesi olmadan optimal ilaç aktivitesi sağlar31. Tahlil reaktifi, serum bileşenleri23,28 olanlar da dahil olmak üzere farklı ortam türlerinde test edilmiş ve stabil olarak bildirilmiştir. Bağıl lüminesans birimi değerleri farklı ortamlar arasında değişebilse de, ortamın bileşenlerinintahlil 32,33'e müdahale etmediği gösterilmiştir. Deneysel hacim, yetişkin bir diz eklemi boşluğunda bulunan sinovyal sıvı hacmine yakın olan 1.5 mL'ye daha da optimize edildi34.
Tahlil için sıcaklık kararlılığı
Işıldayan reaktifin tahlillere taşınması ve eklenmesi, deneyler arasında tutarlı bir şekilde gerçekleştirilmelidir. Sıcaklık değişiklikleri tahlilin hassasiyetini değiştirir, bu nedenle reaktifi bakteri23'e eklemeden önce oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübe etmek önemlidir.
Reaktif inkübasyon süresi
Reaktiften gelen lüminesans zamanla bozunur. Işıldayan sinyal, 30 dakikanın üzerinde bir yarı ömre sahiptir, bu da büyük ölçüde ortama ve deneyde kullanılan bakteri türüne bağlıdır23. Ek olarak, inkübasyon süresindeki herhangi bir farklılık (yani, reaktifi bakterilere ekleme ve lüminesansı okuma arasındaki süre), aynı bakteri konsantrasyonu için tutarsız okumalara neden olacaktır. Üreticinin talimatlarına göre 5 dakikalık inkübasyon süresini takip eden 1 dakika içinde alındığında ışıldayan sinyalde% 5'lik bir fark gözlenmiştir (Ek Şekil 2). Bu veriler dikkate alındığında, sinyal kaybının% 5'ten fazla olmamasını sağlamak için çalışma boyunca lüminesans okumaları 1 dakika içinde kaydedildi. Ayrıca, ilk kuyudan son kuyuya kadar lüminesans bozunması nedeniyle ortaya çıkan hatayı azaltmak için plaka başına numune sayısını sınırlamak önemlidir.
Çalışma boyunca bakteri popülasyonunun bakımı
Yöntem, 10 dakika35 boyunca 10.000 x g'de yüksek hızlı santrifüjleme kullanarak harcanan ortamı her zaman noktasında bakteri popülasyonundan sürekli olarak ayırarak ilaç klirensini ve sinovyal hacim cirosunu modellemeye çalıştı. Bu kritik adım, tüm canlı ve canlı olmayan bakteri hücrelerinin çökelmesini sağlar. Buna ek olarak, tortul bakteriler taze MHB'de düzgün bir şekilde yeniden oluşturulur ve şırınga kurulumuna aktarılır, böylece etkilenen mikrobiyal popülasyonun deney düzeneğine geri taşınması kolaylaştırılır. Bu yöntemin tekrarlanabilirliği ve güvenilirliği, antibiyotiklerin ilk inokulumdan türetilen mikrobiyal popülasyona sürekli maruz kalmasını simüle etmeye büyük ölçüde dayanmaktadır.
Bu yöntemin önemli bir sınırlaması, ilaç yarı ömürlerini ve sürekli sinovyal döngüyü doğru bir şekilde simüle etmeyen yarı statik bir tahlil olmasıdır. Bununla birlikte, sürekli ortam değişimi bu sınırlamayı kısmen telafi eder. Mikrobiyal canlılık testinin duyarlılığı gerinimlere bağımlıydı ve 1 x 102-1 x 104 CFU / mL arasında değişiyordu ve bu da tespit kabiliyetini sınırlıyordu. Ayrıca, gerinim tipi ışıldayan reaktifin hassasiyetine ve performansına katkıda bulunduğundan, her organizma için standart bir eğri çizilmelidir. Hem bakteri büyüme dinamikleri hem de kullanılan ilaç bileşiğinin aktivitesi, daha fazla araştırılması gereken ortam bileşenlerinden etkilenebilir.
Disclosures
Kıdemli yazar (E.O.), fikri mülkiyetin aşağıdaki şirketlere lisanslanmasından kaynaklanan telif hakları alır: Corin, Iconacy, Renovis, Arthrex, ConforMIS, Meril Healthcare, Exactech. Burada sunulan çalışmaların hiçbiriyle çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen Ulusal Sağlık Enstitüleri Hibe No. AR077023 (R01) ve Harris Ortopedi Laboratuvarı tarafından finanse edilmiştir. Yazarlar, Dr. Kerry Laplante ve Rhode Island Üniversitesi'ndeki ekibine L1101 ve L1163 klinik suşlarını sağladıkları için teşekkür eder.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well plates - polystyrene, High Bind, white flat bottom wells, non-sterile, white, 100/cs | Corning, NY, USA | CLS3922-100EA | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma Aldrich, Germany | ||
| ATCC 12600 | American Type culture Collection, VA, USA | ||
| BacTiter-Glo Microbial Cell Viability Assay | Promega Corporation, USA | G8231 | |
| BD Bacto Tryptic Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium) | Becton-Dickinson, USA | BD 211825 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Luer-Lok Syringe sterile, single use, 3 mL | BD, USA | 309657 | |
| BD Needle 5/8 in. single use, sterile, 25 G | BD, USA | 305122 | |
| BD BBL Dehydrated Culture Media: Mueller Hinton II Broth (Cation-Adjusted) | Becton-Dickinson, USA | B12322 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar) | Becton-Dickinson, USA | DF0369-17-6 | purchased from Fisher Scientific, USA |
| Boric Acid | Fisher Chemical, NJ, USA | ||
| Branson 1800 ultrasonic bath | Emerson, MO, USA | ||
| Corning Falcon Bacteriological Petri Dishes with Lid | Fisher Scientific, USA | 08-757-100D | |
| Gentamicin Sulfate | Fujian Fukang Pharmaceutical Co., Fuzhou, China | ||
| Greiner UV-Star 96 well plates | Sigma Aldrich, Germany | M3812-40EA | |
| Hydraulic press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| L1101 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| L1163 | Clinical strain from Dr Kerry Laplante, University of Rhode Island | ||
| LSE benchtop shaking incubator | Corning, NY, USA | ||
| Methanol, Optima for HPLC, Fisher Chemical | Fisher Scientific, NJ, USA | A454-1 | |
| Napco CO2 6000 | Thermo Scientific, MA, USA | ||
| PBS, Phosphate Buffered Saline, 1X Solution, pH 7.4, Fisher BioReagents | Fisher Scientific, USA | BP24384 | |
| Phthaldiadehyde ≥97% (HPLC) | Sigma Aldrich, Germany | P1378-5g | |
| Plate reader (Synergy H1 | Biotek, VT, USA | ||
| press | Carver, Inc. Wabash, IN, USA | ||
| shaker Innova 2100 | New Brunswick Scientific, NJ, USA | ||
| ShopBot D2418 | ShopBot Tools, Inc., NC, USA | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma Aldrich, Germany | ||
| Thermo Scientific Reagent Grade Deionized Water | Fisher Scientific, USA | 23-751628 | |
| UHMWPE | GUR1020, Celanese, TX, USA | ||
| Vancomycin Hydrochloride | Fagron, The Netherlands | 804148 | |
| WAB Turbula | WAB Turbula, Switzerland |
References
- Hunter, D. J., March, L., Chew, M. Osteoarthritis in 2020 and beyond: A Lancet Commission. Lancet. 396 (10264), 1711-1712 (2020).
- Sloan, M., Premkumar, A., Sheth, N. P. Projected volume of primary total joint arthroplasty in the U.S., 2014 to 2030. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 100 (17), 1455-1460 (2018).
- Gao, J., Xing, D., Dong, S., Lin, J. The primary total knee arthroplasty: A global analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 190 (2020).
- UpToDate. Prosthetic joint infection: Treatment. , Available from: https://www.uptodate.com/contents/prosthetic-joint-infection-treatment (2022).
- Dapunt, U., Radzuweit-Mihaljevic, S., Lehner, B., Haensch, G. M., Ewerbeck, V. Bacterial infection and implant loosening in hip and knee arthroplasty: Evaluation of 209 cases. Materials. 9 (11), 871 (2016).
- Kamath, A. F., et al. Quantifying the burden of revision total joint arthroplasty for periprosthetic infection. The Journal of Arthroplasty. 30 (9), 1492-1497 (2015).
- Tande, A. J., Patel, R.
- Davidson, D. J., Spratt, D., Liddle, A. D. Implant materials and prosthetic joint infection: The battle with the biofilm. EFORT Open Reviews. 4 (11), 633-639 (2019).
- de Vor, L., Rooijakkers, S. H. M., van Strijp, J. A. G. Staphylococci evade the innate immune response by disarming neutrophils and forming biofilms. FEBS Letters. 594 (16), 2556-2569 (2020).
- Dapunt, U., Giese, T., Stegmaier, S., Moghaddam, A., Hänsch, G. M. The osteoblast as an inflammatory cell: Production of cytokines in response to bacteria and components of bacterial biofilms. BMC Musculoskeletal Disorders. 17, 243 (2016).
- González, J. F., Hahn, M. M., Gunn, J. S. Chronic biofilm-based infections: Skewing of the immune response. Pathogens and Disease. 76 (3), 023 (2018).
- Dapunt, U., Giese, T., Prior, B., Gaida, M. M., Hänsch, G. M. Infectious versus non-infectious loosening of implants: activation of T lymphocytes differentiates between the two entities. International Orthopaedics. 38 (6), 1291-1296 (2014).
- Tai, D. B. G., Patel, R., Abdel, M. P., Berbari, E. F., Tande, A. J. Microbiology of hip and knee periprosthetic joint infections: A database study. Clinical Microbiology and Infection. 28 (2), 255-259 (2022).
- Foster, T. J. Antibiotic resistance in Staphylococcus aureus. Current status and future prospects. FEMS Microbiology Reviews. 41 (3), 430-449 (2017).
- Kranjec, C., et al. Staphylococcal biofilms: challenges and novel therapeutic perspectives. Antibiotics. 10 (2), 131 (2021).
- Kahl, B. C., Becker, K., Löffler, B. Clinical significance and pathogenesis of staphylococcal small colony variants in persistent infections. Clinical Microbiology Reviews. 29 (2), 401-427 (2016).
- Li, C., Renz, N., Trampuz, A.
- Davis, J. S., et al. Predictors of treatment success after periprosthetic joint infection: 24-month follow up from a multicenter prospective observational cohort study of 653 patients. Open Forum Infectious Diseases. 9 (3), (2022).
- Suhardi, V. J., et al. A fully functional drug-eluting joint implant. Nature Biomedical Engineering. 1, 0080 (2017).
- Gil, D., Grindy, S., Muratoglu, O., Bedair, H., Oral, E. Antimicrobial effect of anesthetic-eluting ultra-high molecular weight polyethylene for post-arthroplasty antibacterial prophylaxis. Journal of Orthopaedic Research. 37 (4), 981-990 (2019).
- Robu, A., et al. Additives imparting antimicrobial properties to acrylic bone cements. Materials. 14 (22), 7031 (2021).
- Balouiri, M., Sadiki, M., Ibnsouda, S. K. Methods for in vitro evaluating antimicrobial activity: A review. Journal of Pharmaceutical Analysis. 6 (2), 71-79 (2016).
- BacTiter-Glo microbial cell viability assay instructions for use of products G8230, G8231, G8232 and G8233. <101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol. Promega Corporation. , Available from: https://www.promega.com/resources/protocols/technical-bulletins/101/bactiter-glo-microbial-cell-viability-assay-protocol/ (2022).
- Izakovicova, P., Borens, O., Trampuz, A. Periprosthetic joint infection: Current concepts and outlook. EFORT Open Reviews. 4 (7), 482-494 (2019).
- López-Torres, I. I., Sanz-Ruíz, P., Navarro-García, F., León-Román, V. E., Vaquero-Martín, J. Experimental reproduction of periprosthetic joint infection: Developing a representative animal model. The Knee. 27 (3), 1106-1112 (2020).
- Carli, A. v, et al. Quantification of peri-implant bacterial load and in vivo biofilm formation in an innovative, clinically representative mouse model of periprosthetic joint infection. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 99 (6), 25 (2017).
- Humphries, R. M., et al. CLSI Methods Development and Standardization Working Group best practices for evaluation of antimicrobial susceptibility tests. Journal of Clinical Microbiology. 56 (4), 01934 (2018).
- Mueller, M., de la Peña, A., Derendorf, H. Issues in pharmacokinetics and pharmacodynamics of anti-infective agents: Kill curves versus MIC. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 48 (2), 369-377 (2004).
- Wijesinghe, G., et al. Influence of laboratory culture media on in vitro growth, adhesion, and biofilm formation of Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Medical Principles and Practice. 28 (1), 28-35 (2019).
- Steixner, S. J. M., et al. Influence of nutrient media compared to human synovial fluid on the antibiotic susceptibility and biofilm gene expression of coagulase-negative Staphylococci In vitro. Antibiotics. 10 (7), 790 (2021).
- Sigma Aldrich. Mueller Hinton Broth (M-H Broth). Sigma Aldrich. , 70192 (2018).
- Thiriard, A., Raze, D., Locht, C. Development and standardization of a high-throughput Bordetella pertussis growth-inhibition assay. Frontiers in Microbiology. 11, 777 (2020).
- Clow, F., O'Hanlon, C. J., Christodoulides, M., Radcliff, F. J. Feasibility of using a luminescence-based method to determine serum bactericidal activity against Neisseria gonorrhoeae. Vaccines. 7 (4), 191 (2019).
- Kraus, V. B., Stabler, T. v, Kong, S. Y., Varju, G., McDaniel, G. Measurement of synovial fluid volume using urea. Osteoarthritis and Cartilage. 15 (10), 1217-1220 (2007).
- Gonçalves, F. D. A., de Carvalho, C. C. C. R. Phenotypic modifications in Staphylococcus aureus cells exposed to high concentrations of vancomycin and teicoplanin. Frontiers in Microbiology. 7, 13 (2016).
