Mitophagie ist der primäre Mechanismus der mitochondrialen Qualitätskontrolle. Die Bewertung der Mitophagie in vivo wird jedoch durch das Fehlen zuverlässiger quantitativer Assays behindert. Hier wird ein Protokoll zur Beobachtung der Mitophagie in lebenden Zellen unter Verwendung eines zellpermierten grün-fluoreszierenden Mitochondrienfarbstoffs und eines rot fluoreszierenden Lysosomenfarbstoffs vorgestellt.
Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.
Methodenartikel
Visualisierung der Mitophagie mit Fluoreszenzfarbstoffen für Mitochondrien und Lysosomen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Mitochondrien, die Kraftwerke der Zelle, spielen eine wichtige Rolle bei der Bioenergetik, der Erzeugung freier Radikale, der Kalziumhomöostase und der Apoptose. Mitophagie ist der primäre Mechanismus der mitochondrialen Qualitätskontrolle und wird im Allgemeinen durch mikroskopische Beobachtung untersucht, jedoch sind In-vivo-Mitophagie-Assays schwierig durchzuführen. Die Bewertung der Mitophagie durch Bildgebung lebender Organellen ist eine alternative und notwendige Methode für die mitochondriale Forschung. Dieses Protokoll beschreibt die Verfahren zur Verwendung des zellpermierten grün-fluoreszierenden Mitochondrienfarbstoffs MitoTracker Green und des rot fluoreszierenden Lysosomenfarbstoffs LysoTracker Red in lebenden Zellen, einschließlich der Beladung der Farbstoffe, der Visualisierung der Mitochondrien und des Lysosoms sowie der erwarteten Ergebnisse. Detaillierte Schritte zur Bewertung der Mitophagie in lebenden Zellen sowie technische Hinweise zu den Einstellungen der Mikroskopsoftware werden ebenfalls bereitgestellt. Diese Methode kann Forschern helfen, Mitophagie mit lebender Zellfluoreszenzmikroskopie zu beobachten. Darüber hinaus kann es verwendet werden, um Mitochondrien und Lysosomen zu quantifizieren und die mitochondriale Morphologie zu beurteilen.
Einleitung
Mitochondrien sind die Kraftwerke fast aller eukaryotischen Zellen 1,2. Neben der ATP-Produktion durch oxidative Phosphorylierung spielen Mitochondrien eine wichtige Rolle in anderen Prozessen wie Bioenergetik, Kalziumhomöostase, Erzeugung freier Radikale, Apoptose und zellulärer Homöostase 3,4,5. Da Mitochondrien reaktive Sauerstoffspezies (ROS) aus mehreren Komplexen in der Elektronentransportkette erzeugen, werden sie ständig durch potenziellen oxidativen Stress stimuliert, der schließlich zu strukturellen Schäden ....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Protokoll
1. Zellkultur und Passaging
HINWEIS: Das Protokoll wird am Beispiel routinemäßig kultivierter embryonaler Fibroblasten (MEFs) der Maus beschrieben.
- Kultur von MEF-Zellen in 10 cm Zellkulturschalen mit 10 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM). Inkubieren Sie bei 37 °C und 5% CO2 und überwachen Sie die Zellen unter dem Mikroskop bei 100-facher Vergrößerung.
- Führen Sie routinemäßiges Zell-Passaging durch.
- Wenn die Zellen 80% -90% Konfluenz erreichen (alle 3 Tage), waschen Sie die Zellen mit 2 ml Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS). Dann fügen Sie 2 ml 0,05% Trypsin-EDT....
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Ergebnisse
MitoTracker Green ist eine grün fluoreszierende mitochondriale Färbung, die in der Lage ist, Mitochondrien genau zu lokalisieren. Der Farbstoff kann lebende Zellen leicht färben und ist weniger wirksam bei der Färbung aldehydfixierter oder toter Zellen (Abbildung 2). Der rot fluoreszierende Lysosomenfarbstoff LysoTracker Red ist in der Lage, saure lysosomale Organellen zu markieren und zu verfolgen und kann nur lebende Zellen färben (Abbildung 2). Die konfokale .......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Diskussion
Das hier beschriebene Protokoll bietet eine Methode zur Bewertung und Überwachung des dynamischen Prozesses der Mitophagie in lebenden Zellen, an dem Autophagosomen, Lysosomen und mitochondriale Spaltung beteiligt sind, durch Co-Färbung mit zellpermeierten Mitochondrien und Lysosomenfarbstoffen. Die Methode kann auch verwendet werden, um Mitochondrien zu identifizieren und die mitochondriale Morphologie zu beurteilen. Beide in dieser Studie verwendeten Farbstoffe sollten vor Licht geschützt werden, mehrere Gefrier-Tau-Zy.......
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde teilweise durch das National Key Research and Development Program of China (2017YFA0105601, 2018YFA0107102), die National Natural Science Foundation of China (81970333,31901044,) und das Program for Professor of Special Appointment an Shanghai Institutions of Higher Learning (GZ2020008) finanziert.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Automatisierter Zellzähler | Countstar | IC1000 | |
| Objektträger für Zellzählkammern | Countstar | 12-0005-50 | |
| Dulbeccos modifiziertes Eagle-Medium (DMEM) | Corning | 10-013-CV | |
| Dulbeccos phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS) | Corning | 21-031-CVC | |
| Zellkulturschale mit Glasboden (Konfokalschale) | NEST | 801002 | |
| Image J (Rasband, NIH) | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/download.html | |
| Krebs– Henseleit (KHB) Puffer | Selbst vorbereitet | ||
| LysoTracker Rot | Invitrogen | 1818430 | 100 µ mol/L, rot fluoreszierender Lysosomenfarbstoff |
| MitoTracker Green | Invitrogen | 1842298 | 200 µ mol/L Schaft, grün-fluoreszierender Mitochondrien-Farbstoff |
| Maus Embryonale Fibroblasten | Selbst präpariertes | ||
| Objektiv (63x Öllinse) | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| Trypsin-EDTA 0,25% | Gibico | Cat# 25200056 | |
| ZEISS LSM 880 Konfokales Laser-Scanning-Mikroskop | ZEISS | ZEISS LSM 880 | |
| ZEN Microscopy Software 2.1 (konfokal) Software für die Bildgebung von Mikroskopen) | ZEISS | ZEN 2.1 |
Referenzen
- Tao, M., et al. Animal mitochondria: evolution, function, and disease. Current Molecular Medicine. 14 (1), 115-124 (2014).
- Henze, K., Martin, W. Evolutionary biology: essence of mitochondria. Nature. 426 (6963), 127-128 (2003).
- Kiriyama, Y., Nochi, H.
Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Nachdrucke und Genehmigungen
