Summary
تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا مفصلا لتصوير ديناميكيات جدار الخلية 3-D لأنسجة الطحالب الحية ، مما يسمح بتصور انفصال جدران الخلايا في طفرات ggb وأنماط جدار الخلية السميكة في النوع البري أثناء التطور على مدى فترة طويلة.
Abstract
يسمح التصوير بفاصل زمني باستخدام الفحص المجهري الفلوري بمراقبة التغيرات الديناميكية للنمو والتطور على المستويين الخلوي ودون الخلوي. بشكل عام ، بالنسبة للملاحظات على مدى فترة طويلة ، تتطلب التقنية تحويل بروتين الفلورسنت. ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم الأنظمة ، يكون التحول الجيني إما مستهلكا للوقت أو غير متاح تقنيا. تقدم هذه المخطوطة بروتوكولا للتصوير ثلاثي الأبعاد بفاصل زمني لديناميكيات جدار الخلية على مدار 3 أيام باستخدام صبغة كالكوفلور (التي تلطخ السليلوز في جدار الخلية النباتية) ، والتي تم تطويرها في الطحالب Physcomitrium patens. إشارة صبغة calcofluor من جدار الخلية مستقرة ويمكن أن تستمر لمدة 1 أسبوع دون تسوس واضح. باستخدام هذه الطريقة ، فقد ثبت أن انفصال الخلايا في طفرات ggb (حيث يتم التخلص من الوحدة الفرعية بيتا للبروتين geranylgeranyltransferase-I) ناتج عن توسع الخلية غير المنظم وعيوب سلامة جدار الخلية. علاوة على ذلك ، تتغير أنماط تلطيخ الكلكوفلور بمرور الوقت. ترتبط المناطق الأقل تلطيخا بشكل مكثف بمواقع توسع / تفرع الخلايا المستقبلية في النوع البري. يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الأنظمة الأخرى التي تحتوي على جدران خلوية والتي يمكن تلطيخها بواسطة الكلكوفلور.
Introduction
تخضع جدران الخلايا النباتية لتغيرات ديناميكية أثناء تمدد الخلايا وتطورها1،2،3. يعد الحفاظ على سلامة جدار الخلية أمرا بالغ الأهمية للالتصاق الخلايا النباتية أثناء النمو والتطور ، وكذلك للاستجابة للإشارات البيئية. على الرغم من أن تصور ديناميكيات جدار الخلية للخلايا الحية على مدى فترة طويلة من الزمن أمر بالغ الأهمية لفهم كيفية الحفاظ على التصاق الخلايا أثناء التطور والتكيف مع التغيرات البيئية ، إلا أن الطرق الحالية لمراقبة ديناميكيات جدار الخلية مباشرة لا تزال صعبة.
يمكن أن يوفر التصوير بفاصل زمني للتغيرات الخلوية ديناميكيات تنموية مفيدة للكائن الحي باستخدام مجهر مضان عالي الدقة4،5،6،7. في حين أن التصوير ثلاثي الأبعاد بفاصل زمني لديه قدر كبير من الإمكانات لدراسة التغيرات الديناميكية لشكل الخلية أثناء النمو والتطور ، فإن التقنية تتطلب عادة تحويل بروتين الفلورسنت4،5،6،7. ومع ذلك ، بالنسبة لمعظم الأنظمة ، فإن التحولات الجينية إما تستغرق وقتا طويلا أو تمثل تحديا تقنيا. كبديل ، كانت الأصباغ الفلورية التي ترتبط بالمكونات الخلوية متاحة منذ فترة طويلة. يمكن أن تنبعث الأصباغ الفلورية من ضوء الفلورسنت بعد التشعيع بضوء بطول موجي معين. الأمثلة الشائعة هي Edu و DAPI و PI و FM4-64 و calcofluor white8،9،10. ومع ذلك ، فإن أحد العيوب الرئيسية هو أن هذه الأصباغ لا يمكن استخدامها عادة إلا في الأنسجة الثابتة أو للتجارب القصيرة ، ويرجع ذلك جزئيا إلى الضرر الذي تسببه للخلية8،9،10.
مع البروتوكول المقدم هنا ، تكون إشارات calcofluor مستقرة عندما يتم خلط كالكوفلور الأبيض داخل الوسط أثناء تجارب الفاصل الزمني في الطحالب P. patens. باستخدام هذه الطريقة ، لوحظ انفصال الخلايا في طفرات ggb باستخدام التصوير بفاصل زمني ثلاثي الأبعاد على مدى فترة 3 أيام3 (الشكل 1). يمكن تطبيق هذه الطريقة على العديد من الأنظمة الأخرى التي تحتوي على جدران خلوية والتي يمكن تلطيخها بواسطة الكلكوفلور.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: انظر جدول المواد للحصول على قائمة المواد والمعدات والجدول 1 للحصول على قائمة الحلول التي سيتم استخدامها في هذا البروتوكول.
1. تحضير النباتات لأطباق القاع الزجاجي
- قم بزراعة الأنسجة البدائية الطحلبية في وسط أجار BCDAT في طبق بتري 13 سم تحت ضوء أبيض ثابت (~ 50 ميكرومول m-2 s-1) لمدة 7 أيام عند 25 درجة مئوية في غرفة النمو.
- قم بتصفية وتعقيم الكالكوفلور الأبيض وخزنه في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام. الكاشف مستقر لعدة أشهر.
- قم بتفريق أنسجة الطحالب البالغة من العمر 7 أيام في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل يحتوي على 20 ميكرولتر من الماء المعقم. تأكد من تشتيت الأنسجة البدائية الطحلبية بشكل كاف كقطع صغيرة في الماء. بالنسبة للنوع البري (WT) ، استخدم الملقط لفصل البروتونيماتا ؛ بالنسبة لمتحولة GGB ، استخدم ماصة P-1000.
- أضف 10 ميكرولتر من الكالكوفلور الأبيض المعقم إلى الأنبوب الصغير سعة 1.5 مل واترك الأنبوب الصغير في وضع مستقيم في غطاء المحرك لمدة دقيقتين للتلطيخ.
- مباشرة بعد التلوين ، امزج النباتات مع 200 ميكرولتر من BCDATG المبرد ، الذي يحتوي على وسط BCDAT المكمل ب 0.5٪ (وزن / حجم) جلوكوز و 0.4٪ (وزن / حجم) صمغ جيلان ، عن طريق السحب خمس مرات باستخدام ماصة P-1000.
ملاحظة: تأكد من تبريد وسط BCDATG بدرجة كافية (قبل أن يصلب الوسط مباشرة) لتجنب إجهاد النباتات. - انقل الخليط الذي يحتوي على النباتات ووسط BCDATG إلى طبق قاعدة زجاجي بقطر 27 مم. تأكد من أن حجم BCDATG لخلط الخلايا لا يزيد عن 200 ميكرولتر وأن 200 ميكرولتر من BCDATG مع العينات موزعة بالتساوي على سطح الطبق السفلي الزجاجي 7 مم لإنتاج طبقة رقيقة من الفيلم ، بحيث تكون العينات ضمن مسافة العمل الموضوعية أثناء التصوير.
- بعد التصلب لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، قم بتغطية الطبقة الرقيقة ب 3 مل من BCDATG المبرد واتركها لمدة 10 دقائق لتتصلب مرة أخرى.
ملاحظة: تأكد من إجراء الخطوات 1.2-1.5 في غطاء معقم لتجنب التلوث. - في الجزء السفلي من الطبق ، ارسم تسعة خطوط في اتجاهات متوازية ومتعامدة (الشكل 2). ضع علامة على الصفوف بأحرف من a إلى h ، وقم بتمييز الأعمدة بأرقام من 1 إلى 8. استخدم العلوي والسفلي والأيمن والأوسط والأيسر لتمييز المواضع داخل كل مربع. على سبيل المثال ، إذا كان النبات في مربع في الصف الثاني والعمود السادس وتم وضعه في الجزء الأيسر العلوي من المربع ، إعطاء هذا النبات اسم "b6_upper_left".
- قبل زراعة طبق القاع الزجاجي الذي يحتوي على النباتات تحت الضوء الأحمر لمدة 5 أيام عند 25 درجة مئوية في غرفة النمو ، ثم تحت الضوء الأبيض لمدة 1-2 أيام قبل الخضوع لتصوير الفاصل الزمني كل يوم لمدة تصل إلى 3 أيام. بالنسبة ل WT ، قم بزراعة النباتات في ضوء أحمر ضعيف (0.5 μmol m-2 s-1) مما سبق لمدة 5 أيام للحث على الاستجابة الضوئية للبروتونيماتا ، بحيث يمكن للنباتات أن تلتصق بقاع الأطباق11.
ملاحظة: يتم توفير الضوء الأحمر الضعيف عن طريق تمرير ضوء أبيض من خلال مرشح بلاستيكي أكريليك أحمر بسمك 3 مم إلى صناديق مقاومة للضوء. بالنسبة لمتحولات ggb ، يكون الاستزراع المسبق في الضوء الأحمر اختياريا ، حيث لا تحتوي طفرات ggb على استجابة انتحاء ضوئي 3.
2. التصوير وإعادة الإعمار 3-D
- ضع طبق القاع الزجاجي الذي يحتوي على نباتات على مرحلة مجهر متحد البؤر مقلوب ، بحيث يكون القاع الزجاجي مواجها للهدف. استخدم مجهرا متحد البؤر لتصور الكالكوفلور بعدسة موضوعية 20x. التقط صورا باستخدام ليزر 405 نانومتر ، والثقب عند 1.0 ، وكسب HV عند 100 ، وضبط خلفية الإزاحة عند 0 ، وطاقة الليزر عند 5٪ -7٪ ، وحجم مسح ضوئي يبلغ 1024 × 1024 ، وسرعة مسح ضوئي تبلغ 1/2 إطار / ثانية. اجمع 17-30 قسما بصريا من سلسلة z بحجم خطوة 1.0 ميكرومتر. قم بتسمية الصور باستخدام التعليمات البرمجية في الخطوة 1.6، مثل "b6_upper_left-day0"، واحفظها.
- حدد قناة DAPI في الاستحواذ وحدد مربع Z في اكتساب ND. لتعيين الحدود الدنيا والعليا لمكدس Z، انقر فوق الزرين العلوي والسفلي.
- لإعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد ، افتح ملف .nd2 (الشكل 3 أ ؛ انظر جدول المواد) وانقر فوق المجلد (الشكل 3 ب).
3. تصوير نفس النباتات في نقاط زمنية مختلفة
- بعد كل تصوير ، ضع طبق القاعدة الزجاجية مرة أخرى في غرفة النمو.
- كرر من الخطوة 2.1 للتصوير وإعادة البناء ثلاثي الأبعاد.
ملاحظة: للعثور على نفس النباتات ، استخدم الرمز المذكور في الخطوة 1.6 وقم بإعطاء الاسم "b6_upper_left-day1" أو "b6_upper_left-day2" ، وفقا لعمر النباتات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تسمح هذه الطريقة بمراقبة ديناميكيات جدار الخلية أثناء التطور في النوع البري وطفرات ggb (الشكل 1). أظهرت النتائج أن المناطق ذات السماكة الأقل لجدار الخلية ترتبط بمواقع تمدد / تفرع الخلية ، مما يسمح بالتنبؤ بمواقع التوسع / التفرع في النوع البري (الشكل 1 أ). تمزق سطح جدران الخلايا في طفرات ggb أثناء التطور بسبب توسع الخلايا غير المنضبط3 (الشكل 1 ب). علاوة على ذلك ، فإن إشارة تلطيخ السطح المكسور لمتحولات ggb (وهو السليلوز الأقدم) أقوى من سطح الخلية (وهو السليلوز الأصغر) أسفل سطح جدار الخلية المكسور.
الشكل 1: سلسلة زمنية 3-D لتطور الطحلب. (أ ، ب) تم عرض التغيرات الديناميكية في الجدران المتقاطعة من خلال تلطيخ الكالكوفلور الأبيض (الذي يلطخ السليلوز) في WT (A) وطفرات ggb (B). بالنسبة إلى طفرات ggb (B) ، تشير خطوط الشرطة البيضاء أسفل كل صورة إلى جدران الخلايا السطحية المكسورة على الخلايا المتمددة ، وتشير الخطوط البرتقالية إلى الخلايا الموجودة أسفل سطح جدار الخلية في ggb. تتم إعادة طباعة اللوحة B بإذن من3. لاحظ أنه يمكن اكتشاف الاختلافات في إشارة الكلكوفلور البيضاء على المواضع السطحية للخلايا ، وترتبط مناطق التلوين الأقل كثافة (رؤوس الأسهم) بمواقع تمدد / تفرع الخلية. قضبان المقياس = 20 ميكرومتر. الاختصارات: د = أيام ؛ WT = النوع البري ؛ ggb = جيرانيلجيرانيل ترانسفيراز-I بيتا. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: تحديد موقع النباتات. في الجزء السفلي من الطبق ، تم رسم تسعة خطوط في اتجاهات متوازية ومتعامدة لتحديد موقع المربعات. تم استخدام الأحرف من a إلى h لوضع علامات على الصفوف ، وتم استخدام الأرقام من 1 إلى 8 لوضع علامات على الأعمدة. تم استخدام العلوي والسفلي والأيمن والأوسط والأيسر لوضع علامات على المواضع داخل كل مربع. على سبيل المثال ، إذا كان النبات (المشار إليه بنقطة خضراء) موجودا في مربع في الصف الثاني والعمود السادس ، وتم وضعه في الجزء الأيسر العلوي ، تسمية المصنع باسم b6_upper_left. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 3: إعادة بناء الصور ثلاثية الأبعاد باستخدام ملف nd2 z-stack . (أ) افتح ملف nd2 في عارض عناصر NIS. انقر فوق جداول البحث (دائرة) لضبط تباين وسطوع الصور وانقر فوق مستوى الصوت (مربع) لإعادة بناء صورة 3-D. (ب) صورة 3-D معاد بناؤها من A. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الجدول 1: قائمة الحلول المستخدمة في هذا البروتوكول. الرجاء الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
إعادة بناء 3-D بفاصل زمني ، أو تصوير 4-D ، هي أداة قوية لمراقبة ديناميات التشكل الخلوي أثناء العمليات التنموية. في هذا البروتوكول ، عن طريق خلط الكلس الأبيض في الوسط ، يمكن ملاحظة ديناميات التشكل الخلوي 3-D في الطحلب P. patens. باستخدام هذه الطريقة ، لاحظنا أن سطح جدران الخلايا في طفرات ggb يتمزق أثناء التطور3. علاوة على ذلك ، يرتبط انخفاض سماكة جدران الخلايا بمواقع تمدد / تفرع الخلايا في النوع البري ، مما يسمح بالتنبؤ بمواقع التوسع / التفرع. علاوة على ذلك ، نظرا لأنه يمكن استخدام كالكوفلور الأبيض مع أصباغ أخرى ، مثل الكريات المجهرية ، يمكن ملاحظة معلومات إضافية حول توسع الخلايا3.
هناك سببان يمكن أن يفسرا كيف يمكن لصبغة الكالكوفلور أن ترتبط لعدة أيام بالنباتات دون التأثير على الهدف الجزيئي / إتلافه. أولا ، قد يكون تركيز العمل المنخفض (10 ميكرولتر في 200 ميكرولتر من وسط BCDATG ، أو 5٪) منخفضا بدرجة كافية حتى لا يتأثر بروتونيماتا الطحلب. ثانيا ، قد يلطخ الكالكوفلور المرحلة الناضجة من السليلوز ، لأن إشارة التلوين أقوى بكثير في الجزء القاعدي من النوع البري (وهو نسيج أقدم) من المنطقة القمية للخلية القمية (وهي نسيج أصغر) ، وسطح جدار الخلية المكسور من طفرات ggb (وهو السليلوز الأقدم) أقوى من الخلايا (وهو السليلوز الأصغر) تحت سطح جدار الخلية المكسور.
تم استخدام هذا البروتوكول لأنسجة الطحالب ، وهو بسيط في الهيكل. يمكن أيضا تطبيق البروتوكول الحالي على أنظمة أخرى ذات هياكل بسيطة ، مثل شعر الجذر و trichomes في النباتات المزهرة. ومع ذلك ، يبقى أن نرى ما إذا كان تلطيخ الكالكوفلور الأبيض يعمل مع أنظمة أخرى بها طبقات خلايا أكثر ، مثل السيقان. علاوة على ذلك ، نظرا لخلط اللون الأبيض الكلسي مع الوسط ، يجب غمر الأنسجة المراد تلطيخها داخل الوسط. لذلك ، قد يكون التحسين مطلوبا لتطبيق هذا البروتوكول على أنظمة أخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون عن عدم وجود مصالح متنافسة أو مالية.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتورة سوسي باتريشيا وبيتي نان من جامعة لويزفيل للمساعدة في المجهر متحد البؤر. تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم (1456884 إلى MPR) ومن خلال اتفاقية تعاونية لمؤسسة العلوم الوطنية (1849213 إلى MPR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 | NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
References
- Anderson, C. T., Kieber, J. J. Dynamic construction, perception, and remodeling of plant cell walls. Annual Review of Plant Biology. 71, 39-69 (2020).
- Vaahtera, L., Schulz, J., Hamann, T. Cell wall integrity maintenance during plant development and interaction with the environment. Naure Plants. 5 (9), 924-932 (2019).
- Bao, L., et al. The cellular function of ROP GTPase prenylation important for multicellularity in the moss Physcomitrium patens. Development. 149 (12), (2022).
- Colin, L., et al. Imaging the living plant cell: From probes to quantification. The Plant Cell. 34 (1), 247-272 (2022).
- Fang, Y., Spector, D. L. Live cell imaging of plants. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (2), (2010).
- Goh, T. Long-term live-cell imaging approaches to study lateral root formation in Arabidopsis thaliana. Microscopy. 68 (1), 4-12 (2019).
- Hamant, O., Das, P., Burian, A. Time-lapse imaging of developing shoot meristems using a confocal laser scanning microscope. Methods in Molecular Biology. 1992, 257-268 (2019).
- Rigal, A., Doyle, S. M., Robert, S. Live cell imaging of FM4-64, a tool for tracing the endocytic pathways in Arabidopsis root cells. Methods in Molecular Biology. 1242, 93-103 (2015).
- Yagi, N., et al. Advances in synthetic fluorescent probe labeling for live-cell imaging in plants. Plant & Cell Physiology. 62 (8), 1259-1268 (2021).
- Whitewoods, C. D., et al. CLAVATA was a genetic novelty for the morphological innovation of 3D growth in land plants. Current Biology. 28 (15), 2365-2376 (2018).
- Bao, L., et al. A PSTAIRE-type cyclin-dependent kinase controls light responses in land plants. Science Advances. 8 (4), 2116 (2022).
