Summary
Questo protocollo descrive il modello di trasposizione del neuroma tibiale, che comporta una lesione del nervo tibiale con successiva trasposizione dell'estremità del nervo prossimale verso una posizione pretibiale o laterale sottocutanea. I test comportamentali del dolore neuromatico e dell'iperalgesia plantare sono quantificati utilizzando i monofilamenti di Von Frey.
Abstract
La trasposizione del neuroma tibiale (TNT) è un modello di ratto in cui l'allodinia nel sito del neuroma (nervo tibiale) può essere valutata indipendentemente dall'allodinia sulla superficie plantare della zampa posteriore innervata dal nervo surale intatto. Questo modello TNT è adatto per testare terapie per il dolore neuroma, come la potenziale superiorità di alcune terapie chirurgiche che sono già utilizzate in clinica, o per valutare nuovi farmaci e il loro effetto su entrambe le modalità di dolore nello stesso animale. In questo modello, una lesione distale (neurotmesi) viene prodotta nel nervo tibiale e l'estremità del nervo prossimale viene trasposta e fissata per via sottocutanea e pretibialmente per consentire valutazioni del sito neuromatico con un monofilamento di Von Frey da 15 g. Per valutare l'allodinia sopra il nervo surale, i monofilamenti di Von Frey possono essere utilizzati tramite il metodo up-down sulla regione laterale plantare della zampa posteriore. Dopo aver tagliato il nervo tibiale, l'ipersensibilità meccanica si sviluppa nel sito del neuroma entro 1 settimana dopo l'intervento chirurgico e persiste almeno fino a 12 settimane dopo l'intervento. L'allodinia sulla superficie plantare innervata surale si sviluppa entro 3 settimane dall'intervento chirurgico rispetto all'arto controlaterale. A 12 settimane, un neuroma si forma sull'estremità prossimale del nervo tibiale reciso, indicato dalla dispersione e dal vortice degli assoni. Per la chirurgia modello TNT, è necessario seguire più passaggi critici (micro) chirurgici e si consiglia una certa pratica chirurgica in anestesia terminale. Rispetto ad altri modelli di dolore neuropatico, come il modello di lesione nervosa risparmiata, l'allodinia sul sito del neuroma può essere testata indipendentemente dall'ipersensibilità del nervo surale nel modello TNT. Tuttavia, il sito del neuroma può essere testato solo nei ratti, non nei topi. I suggerimenti e le indicazioni fornite in questo protocollo possono aiutare i gruppi di ricerca che lavorano sul dolore a implementare con successo il modello TNT nella loro struttura.
Introduction
Ogni ferita, che varia da semplici lacerazioni all'amputazione dell'intero arto, è accompagnata da vari gradi di lesione del nervo periferico. Tale lesione nervosa può provocare la formazione di un neuroma, un intreccio disorganizzato di fibre nervose germoglianti. I neuromi diventano dolorosi nell'8%-30% dei pazienti, influenzando gravemente la loro qualità di vita 1,2,3,4,5. Dopo l'amputazione degli arti, il dolore neuromatico si sviluppa nel 50% dei pazienti 6,7,8. I sintomi riportati includono dolorabilità, dolore spontaneo, allodinia, iperalgesia e ipersensibilità meccanica o termica nell'area innervata9. Se non trattato adeguatamente entro 1 anno, il dolore neuroma può avanzare a uno stato di dolore cronico, con conseguente elevato carico sociale e costi medici associati 10,11,12,13,14. A causa della scarsa efficacia degli attuali interventi farmacologici, il dolore neuromatico è preferibilmente trattato mediante rimozione chirurgica del neuroma doloroso e il nervo trattato con varie tecniche chirurgiche, come descritto nella letteratura15. È importante notare che il completo sollievo dal dolore è raro, il dolore spesso peggiora nel tempo e il 40% dei pazienti non beneficia dell'intervento chirurgico, indicando che sono necessari nuovi trattamenti 1,16.
Un modello standardizzato di dolore neuroma aiuta a comprendere i meccanismi che guidano il dolore del neuroma e può aiutare a identificare nuovi trattamenti o valutare quelli esistenti utilizzati nella clinica. Il modello di trasposizione del neuroma tibiale (TNT) è stato descritto per la prima volta da Dorsi et al. nel 200817 ed è stato utilizzato da diversi gruppi di ricerca18,19,20. L'obiettivo generale di questo metodo è quello di essere in grado di testare diverse tecniche di trattamento per il dolore neuroma. Il vantaggio del modello rispetto, ad esempio, al modello21 di lesione nervosa risparmiata (SNI), è che consente di testare l'allodinia nel sito del neuroma. Questo perché il modello prevede la trasposizione della terminazione nervosa prossimale del nervo tibiale in una posizione pretibiale sottocutanea, dove può essere sondata con monofilamenti di von Frey. Inoltre, l'allodinia si sviluppa sulla superficie plantare della zampa posteriore innervata dal nervo surale intatto, che può essere valutato indipendentemente dal dolore del neuroma nello stesso animale. Questo è simile ai sintomi del dolore neuroma nei pazienti, dove il dolore neuropatico persistente dopo la rimozione di un neuroma doloroso è talvolta causato dai nervi vicini22. Inoltre, l'allodinia su un nervo reciso con un neuroma è una modalità di dolore diversa rispetto all'allodinia sul nervo vicino intatto. Pertanto, questo modello facilita la valutazione dell'effetto di nuove terapie sia sull'allodinia presente nel sito del neuroma sia sul dolore neuropatico più diffuso testato nella superficie plantare della zampa posteriore. Poiché l'intervento chirurgico eseguito per creare il modello TNT può essere impegnativo, questo documento elabora la procedura per supportare i ricercatori che implementano il modello nella loro struttura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Questa ricerca è stata condotta in conformità con l'IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) e le linee guida per la ricerca sugli animali, numero di progetto AVD1150020198824.
1. Misurazioni della linea di base di Von Frey
- Prima dell'intervento chirurgico, eseguire misurazioni basali secondo la procedura di test di Von Frey, descritta di seguito nei paragrafi 5 e 6.
2. Anestesia e preparazione
NOTA: Questo studio è stato condotto su 15 ratti maschi di Sprague Dawley di 12 settimane.
- Anestetizzare gli animali per induzione con isoflurano al 5% e mantenere l'anestesia con isoflurano al 2% -3%.
NOTA: Il mantenimento con isoflurano al 2% di solito comporta una sufficiente anestesia e respirazione spontanea, senza la necessità di intubazione tracheale o ventilazione meccanica. - Controlla i riflessi degli animali pizzicando il piede con una pinzetta. Assicurati che l'animale non risponda prima di procedere. Rasare il campo operatorio dal ginocchio alla caviglia con un rasoio elettrico e applicare un unguento oftalmico sugli occhi per prevenire la secchezza. Iniettare 0,5 mg/kg di carprofen analgesico per via sottocutanea nella regione addominale.
- Posizionare il ratto anestetizzato sulla schiena con la testa a sinistra o a destra e la gamba da operare vicino al chirurgo. Esorotate l'arto posteriore inferiore in modo che il malleolo mediale sia rivolto verso l'alto. Posizionare il ratto sotto un microscopio chirurgico stereo con ingrandimento 6x.
- Disinfettare l'area rasata con tre cicli alternati di scrub a base di iodio seguiti da alcool. Posizionare un foglio sterile con un foro operativo sulla gamba, in modo che sia visibile solo il campo operatorio. Assicurarsi di mantenere queste condizioni sterili durante l'intervento chirurgico.
3. Chirurgia
- Posizionare un piccolo batuffolo di cotone sotto la caviglia in modo da mantenere orizzontale il campo operatorio. Individuare il ginocchio e praticare delicatamente un'incisione longitudinale di 1-2 cm usando un bisturi sul lato mediale della zampa posteriore da metà polpaccio alla caviglia. Se necessario, aprire ulteriormente la pelle e il sottocute con micro forbici fino a quando gli strati muscolari sono visibili.
- Identificare il fascio neurovascolare superficiale come due o tre bianchi e una linea viola / rossa più spessa, a volte con rami minori, che possono muoversi liberamente sugli strati muscolari. Utilizzando un elettrocauterizzazione (vedi Tabella dei materiali), coagulare qualsiasi sanguinamento attivo o stillicidio nel campo operatorio. Fare attenzione a non danneggiare il fascio neurovascolare.
- Sezionare bruscamente per aprire la fascia tra i muscoli gastrocnemio, appena posteriore al fascio neurovascolare superficiale di 3.2. Tra la fascia dei muscoli, si può trovare il nervo tibiale. Il nervo tibiale è circa tre volte la dimensione del nervo superficiale nel fascio neurovascolare. Usa l'osso tibiale come punto di riferimento aggiuntivo (il nervo tibiale si trova appena posteriormente all'osso tibiale).
- Identificare il nervo tibiale e la sua biforcazione.
NOTA: La biforcazione è solitamente visibile con una linea più leggera longitudinalmente sopra il nervo. - Sezionare attentamente il nervo tibiale libero dai fasci vascolari circostanti. Eseguire la dissezione muovendo bruscamente il nervo tibiale e tagliando il tessuto esposto che mostra un certo allungamento mentre si muove il nervo tibiale.
NOTA: Se il nervo tibiale è attaccato alle vene incrociate dopo la dissezione, queste vene possono essere coagulate per esporre l'intero nervo tibiale. Fare attenzione a non coagulare il fascio tibiale stesso. - Esporre il nervo tibiale prossimalmente fino a quando non scompare sotto uno strato muscolare incrociato. A questo punto, il nervo tibiale sembra immergersi più profondamente nella zampa posteriore verso il ginocchio. Esporre il nervo tibiale distalmente fino alla caviglia.
NOTA: Quando il nervo tibiale è esposto più distalmente, la quantità di fibre di collagene che attraversano (cioè fibre perpendicolari alla direzione delle fibre nervose) aumenterà. Queste fibre di collagene devono essere tagliate per consentire una lunghezza sufficiente per trasporre il nervo tibiale.- Quando l'intero nervo tibiale è esposto, posizionare gli strati muscolari indietro per evitare la disidratazione del nervo. Se il nervo si disidrata (cioè diventa più rigido, opaco e rugoso) e la copertura con strati muscolari non è sufficiente, aggiungere gocce di soluzione salina per idratarlo.
- Utilizzando uno strumento di microchirurgia smussato, preferibilmente un micro portaaghi, sezionare la pelle pretibiale dallo strato muscolare sottocutaneo per creare un tunnel sottocutaneo. Per fare questo, tenere la pelle sollevata e spingere la punta smussata nel tessuto, parallela alla pelle. Assicurarsi che l'estremità del tunnel sia posizionata pretibialmente o più lateralmente per garantire una facile accessibilità dell'area per il test del neuroma.
- Aumentare l'isoflurano al 5%. Tornare al nervo tibiale ed esporlo (cioè, tornare al luogo descritto al punto 3.6). Tagliare il nervo tibiale (cioè entrambi i rami plantari) al livello più distale vicino alla caviglia. Diminuire l'isoflurano al livello normale del 2% -3%.
- Modificare l'ingrandimento del microscopio a 10x o 16x. Identificare l'epineurium del nervo tibiale prossimale al taglio effettuato al punto 3.8, o in caso di una biforcazione più prossimale del nervo tibiale, identificare l'epineurium di entrambi i rami plantari mediale e laterale prossimale al taglio al punto 3.8.
NOTA: L'epineurio è più bianco e più solido rispetto alle fibre nervose all'interno, che sono più gialle e morbide. - Posiziona con cura un 8-0 sutura di nylon (vedi Tabella dei materiali) attraverso l'epineurio dell'estremità del nervo prossimale tenendo attentamente l'epineurium con una pinzetta e mettendo l'ago tra il nervo e l'epineurio con un morso di circa 0,5 mm. Tirare la sutura e prendere un morso con l'ago per via sottocutanea alla fine del tunnel sottocutaneo fatto al punto 3.7. Fai un nodo, che trasporrà il nervo lateralmente nel tunnel sottocutaneo.
NOTA: Se entrambi i rami plantari condividono un epineurio comune, una sutura dovrebbe essere sufficiente. Se entrambi i rami plantari hanno il proprio epineurio, ogni epineurio deve essere fissato individualmente. Evitare di posizionare la sutura attraverso la pelle; fissarlo solo per via sottocutanea. - Posizionare una sutura più spessa con un colore scuro (preferibilmente una sutura blu o nera 4-0) a filo verso l'estremità nervosa fissata, non penetrando nella pelle. Assicurarsi che la sutura sia visibile dall'esterno della pelle. Controlla se il nervo rimane in posizione dopo aver spostato la zampa e i muscoli. Tagliare le estremità della sutura con un'estremità di sutura leggermente più lunga sul 4-0 rispetto all'8-0 sutura.
- Riportare l'ingrandimento del microscopio a 6x. Chiudere la pelle con suture intraepidermiche utilizzando il comando 8-0 sutura e pulire delicatamente la pelle con NaCl allo 0,9% utilizzando un batuffolo di cotone.
4. Trattamento post-chirurgico
- Metti il topo in una gabbia pulita sotto un tovagliolo di carta in una posizione comoda. Se la stanza è fredda, posizionare un termoforo sotto una parte della gabbia (solo sotto una parte della gabbia poiché l'animale dovrebbe essere in grado di sfuggire al calore quando necessario). Garantire un facile accesso al cibo e all'acqua.
- Non lasciare il ratto post-chirurgico incustodito fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la recumbency sternale. Il ratto può essere restituito alla compagnia di altri animali quando si è completamente ripreso dall'anestesia dopo l'intervento chirurgico. Questo di solito è dopo 1 ora e quando il ratto mostra il suo normale modello di camminata e comportamento.
- A 24 ore e 48 ore dopo l'intervento, somministrare una dose di 0,5 mg/kg di carprofen per via sottocutanea (regione addominale) per trattare il dolore post-chirurgico.
5. Test di Von Frey del lato plantare delle zampe posteriori
NOTA: Il test di Von Frey (fase 5 e 6) viene eseguito prima dell'intervento chirurgico (per la misurazione al basale) e da 3 giorni dopo l'intervento.
- Posizionare i ratti in gabbie di fondo a rete metallica 1 settimana prima della misurazione di base, o 2 settimane prima dell'intervento, per garantire l'acclimatazione all'ambiente di test.
- Iniziare con misure basali almeno 1 settimana prima dell'intervento. Assicurarsi che tre misurazioni di base indipendenti vengano eseguite in giorni separati.
- Verificare che i ratti siano calmi nelle gabbie inferiori cablate a rete. Applicare una serie di monofilamenti di Von Frey con una scala logaritmica perpendicolare alla superficie plantare della zampa posteriore.
- Per stimolare il nervo surale (ipersensibilità), applicare il monofilo sul lato laterale vicino al bordo del capello. Evitare di toccare i poggiapiedi in quanto sono più sensibili.
- Per stimolare il nervo tibiale (iposensibilità), applicare il monofilamento nel mezzo della superficie plantare della zampa posteriore. Se il monofilamento viene applicato nella zona più mediale, questo potrebbe anche stimolare il nervo safeno, un ramo del nervo femorale (Figura 1). Evitare di toccare i cuscinetti dei piedi.
- Inizia con il monofilamento da 4 g. Applicare una forza sufficiente al monofilamento in modo che i capelli si pieghino e tengano premuto per 3 secondi, quindi controllare le risposte dell'animale sul monofilamento. Una risposta positiva è il ritiro improvviso della zampa, l'improvviso flinching, l'improvvisa leccata delle zampe o la vocalizzazione. In alcuni casi, il ratto si muove e cerca di trovare/attaccare il monofilamento.
- Scegli il monofilamento successivo a seconda della risposta allo stimolo tramite il metodo up-down23. Ad esempio, se il ratto risponde, stimolare successivamente con il monofilamento da 2 g; Se il ratto non risponde, stimolare con il monofilamento da 6 g e così via. In totale, applicare 5-10 stimoli a seconda della reazione.
6. Test di Von Frey del sito neuroma
- Maneggiare gli animali ogni giorno per un minimo di 5-7 giorni prima delle misure basali o 2 settimane prima dell'intervento. Assicurarsi che gli animali siano tenuti come descritto al punto 6.2, in modo che siano a proprio agio con la posizione.
- Tieni i topi con il naso puntato verso la piega del gomito. Se il ratto è tenuto nella mano destra, la zampa posteriore sinistra dovrebbe pendere liberamente tra il pollice destro e l'indice (primo spazio web). Se il ratto è tenuto nella mano sinistra, la zampa posteriore destra dovrebbe pendere liberamente tra il pollice sinistro e l'indice.
- Iniziare con misure basali almeno 1 settimana prima dell'intervento. Assicurarsi che tre misurazioni di base indipendenti vengano eseguite in giorni separati.
- Verifica che i ratti siano calmi e a proprio agio mentre sono detenuti. Al basale, posizionare delicatamente il monofilo da 15 g sulla superficie pretibiale della zampa posteriore esposta. Dopo l'intervento chirurgico, posizionare il monofilo da 15 g sulla sutura visibile (ad esempio, nella posizione del neuroma). Applicare una forza sufficiente al monofilamento in modo che i capelli si pieghino e si tengano per 1 s.
- Registra la reazione ad ogni stimolo. Le opzioni di reazione includono nessuna reazione, ritiro lento, ritiro rapido e vocalizzazione. Registra la risposta come 0 punti per nessuna reazione e un punto per ritiro lento, ritiro rapido o vocalizzazione.
- Ripetere cinque cluster di cinque applicazioni del monofilamento, con 2-3 s tra ogni applicazione e 2-3 min o più tra i cinque cluster. In totale, ogni zampa posteriore dovrebbe avere 25 applicazioni del monofilamento con risposte registrate.
7. Recupero del campione per istologia e preparazione
NOTA: L'esame istologico viene eseguito 12 settimane dopo l'intervento chirurgico iniziale.
- Indurre l'anestesia e preparare gli animali come descritto nei punti 2.2, 2.3 e 2.4.
- Fai delicatamente un'incisione di 2-3 cm usando un bisturi sopra la cicatrice che è stata fatta dall'intervento chirurgico iniziale, ma fai attenzione a non tagliare troppo in profondità poiché il nervo è posizionato superficialmente.
- Determinare la posizione del neuroma, sezionare attentamente il neuroma e il nervo libero dal tessuto cicatriziale circostante e posizionare il neuroma raccolto in fissativo. Per valutare la morfologia del neuroma, il tessuto è preferibilmente incorporato longitudinalmente in paraffina o resina epossidica come descritto da Tork et al.18.
- Dopo aver raccolto il tessuto, eutanasia i ratti in anestesia terminale (isoflurano al 5%) tramite puntura cardiaca o decapitazione.
NOTA: Si consiglia di raccogliere prima il neuroma prima di uccidere i ratti, perché allora è più facile distinguere il neuroma dal suo tessuto circostante in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
La valutazione nel sito del neuroma ha mostrato una maggiore sensibilità all'applicazione del monofilamento di von Frey da 15 g. Al basale, i ratti hanno risposto tipicamente al 10% -15% (± 13%) delle 25 applicazioni di un monofilamento da 15 g. Il tasso di risposta è aumentato al 45%-50% (± 24%) 1 settimana dopo l'intervento chirurgico di TNT. Sul lato controlaterale, il numero di risposte dopo l'intervento chirurgico era simile a quello al basale (Figura 2A). Circa il 20% dei ratti non ha sviluppato un neuroma doloroso; il tasso di risposta non è aumentato rispetto al basale (Figura 2B). Questo è paragonabile alla situazione umana, in cui non tutti i pazienti (50% dopo l'amputazione) sviluppano dolore dopo la formazione di un neuroma. Tutti i ratti hanno sviluppato un neuroma alla fine del moncone del nervo tibiale transettato e trasposto 12 settimane dopo l'intervento chirurgico (Figura 3). Questo neuroma era caratterizzato da assoni e microfascicoli vorticosi all'interno delle deposizioni di collagene.
La transezione del nervo tibiale ha ridotto la sensibilità meccanica al centro del lato plantare della zampa posteriore, innervata dal nervo tibiale (Figura 1). L'iposensibilità era presente 1 settimana dopo l'intervento, era significativamente diversa dal lato controlaterale e basale da 3 settimane dopo l'intervento chirurgico e rimaneva fino ad almeno 12 settimane dopo l'intervento chirurgico (Figura 4). Nella parte laterale del lato plantare della zampa posteriore innervata dal nervo surale intatto, i ratti hanno sviluppato ipersensibilità meccanica significativamente diversa dal lato controlaterale e basale da 1 settimana dopo l'intervento chirurgico (Figura 4). Questa ipersensibilità persisteva per almeno 12 settimane dopo l'intervento chirurgico. Alla zampa controlaterale, la sensibilità meccanica non è stata influenzata rispetto al basale nelle aree innervate dal nervo surale o tibiale (Figura 4).
Figura 1: Distribuzione nervosa sul lato plantare della zampa posteriore. Rosso = distribuzione del nervo surale (laterale); viola = distribuzione del nervo tibiale (centro); verde = distribuzione del nervo safeno (mediale). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Von Frey del sito del neuroma. Il nervo tibiale è stato transettato e il decorso della sensibilità meccanica sul sito del neuroma è stato valutato con un monofilamento di 15 g applicato in cinque gruppi di cinque applicazioni ciascuno, con un totale di 25 applicazioni. Una risposta viene valutata come un punto. (A) Il sito del neuroma ha mostrato una risposta significativamente più alta 1 settimana dopo l'intervento chirurgico rispetto al basale e al lato controlaterale. N = 15; barre di errore: errore standard della media (SEM); analisi del modello misto con confronti multipli e test Tukey. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. (B) I valori individuali del sito omolaterale mostrano diversità nella reazione. Tre ratti (20%) avevano un punteggio basale relativamente alto e tre ratti (20%) non mostravano alcun cambiamento nella sensibilità pretibiale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Morfologia del neuroma. Immagini istologiche di un neuroma di 12 settimane. (A) Colorazione dell'eossina-eosina, (B) colorazione del tricromo di Masson e (C) colorazione dei neurofilamenti. Freccia verde = nervo tibiale appena prossimale al neuroma. Freccia arancione = neuroma, identificato dal vortice degli assoni e dalla diffusione dei fascicoli. Barra di scala = 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Von Frey della zampa posteriore plantare (nervo tibiale e surale). Il nervo tibiale è stato transettato e il decorso della sensibilità meccanica è stato valutato da Von Frey testando sulla superficie plantare della zampa posteriore. La parte centrale della zampa posteriore operata omolaterale innervata dal nervo tibiale mostrava iposensibilità. La parte laterale della zampa posteriore omolaterale innervata dal nervo surale mostrava ipersensibilità. Le parti centrale e laterale della zampa posteriore controlaterale plantare non hanno mostrato cambiamenti di sensibilità rispetto al basale. N = 15; barre di errore: errore standard della media (SEM); analisi del modello misto con confronti multipli e test Tukey. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001 . Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Passaggi critici nel protocollo
Il modello TNT prevede il taglio del nervo tibiale e la sua trasposizione laterale e sottocutanea in una posizione pretibiale per consentire test di sensibilità del neuroma, oltre all'iperalgesia plantare sul nervo surale. Nel modello TNT, è fondamentale che il posto del neuroma sia visibile ai ricercatori. Pertanto, è preferibile un ceppo di ratto albino perché le suture sottocutanee sono facilmente visibili attraverso la pelle e il colore della sutura dovrebbe preferibilmente essere blu scuro o nero.
Quando l'intervento chirurgico viene condotto e il nervo tibiale è esposto, c'è variazione nel luogo (ad esempio, prossimale o distale) della biforcazione del nervo tibiale. Se i ratti hanno una biforcazione prossimale, è possibile che si trovino due nervi (il nervo plantare mediale e laterale) prossimali alla caviglia (Figura 5A), invece di un solo nervo tibiale (Figura 5B). È importante che entrambi i rami siano tagliati e trasposti per indurre iperalgesia plantare sul nervo surale. Si potrebbe scegliere di trasporre un solo nervo plantare; Tuttavia, una distinzione tra nervo plantare laterale e mediale non è facilmente realizzabile a questo livello e potrebbe influenzare i risultati. Pertanto, si consiglia di trasporre entrambi i nervi. Inoltre, alcuni ratti potrebbero avere una biforcazione più distale del nervo tibiale e trasporre un solo nervo plantare potrebbe essere impossibile.
Figura 5: Biforcazione prossimale e distale del nervo tibiale. Variazione anatomica del livello di biforcazione (*) del nervo tibiale. (A) Biforcazione prossimale del nervo tibiale; (B) biforcazione distale del nervo tibiale. Abbreviazioni: MPN = nervo plantare mediale, LPN = nervo plantare laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Nell'articolo originale di Dorsi et al.17, una legatura è posta attorno all'estremità del nervo tibiale prossimale e il nervo viene trasposto e fissato tramite questa sutura di legatura. Poiché la legatura intorno al nervo può indurre dolore da costrizione24, un'alternativa descritta in questo metodo è quella di fissare il nervo usando suture epineurinali. Se il nervo tibiale viene tagliato e trasposto, è importante che la sutura per fissare il nervo per via sottocutanea sia posizionata attraverso l'epineurium e non i fascicoli nervosi stessi, poiché ciò potrebbe influenzare anche le misure del dolore. Inoltre, si dovrebbe evitare di posizionare la sutura attraverso la pelle, poiché i ratti tendono a rosicchiare qualsiasi sutura visibile, con conseguente spostamento del neuroma e quindi esiti non affidabili delle misure del dolore.
Quando la pelle è chiusa, è anche importante utilizzare suture intraepidermiche per evitare rosicchiamenti che si tradurranno in una ferita aperta. Inoltre, dopo aver trasposto il nervo tibiale, sarà situato in uno strato più superficiale appena sotto la pelle. Una ferita aperta in combinazione con un nervo posizionato superficialmente è indesiderabile.
Le misurazioni di Von Frey possono essere eseguite per testare il dolore neuromatico sul sito del neuroma e per testare l'iperalgesia plantare sul nervo surale, sul lato laterale della zampa posteriore. Il sito del neuroma è visibile dopo l'intervento chirurgico a causa del colore scuro della sutura. Per testare l'ipersensibilità del nervo surale, è necessario scegliere una posizione in cui viene applicato il monofilamento di Von Frey. Questo può essere prossimale o distale al cuscinetto laterale del cibo, ma dovrebbe essere approssimativamente lo stesso posto durante le misurazioni e le misurazioni al basale nelle settimane successive all'intervento chirurgico.
Risoluzione dei problemi del metodo
Se i ratti reagiscono a tutti gli stimoli applicati all'area pretibiale già durante le misurazioni di base, assicurarsi che siano calmi e rilassati e che siano adeguatamente acclimatati all'area di test. Ripetere la misurazione basale fino a quando i ratti reagiscono meno agli stimoli. Inoltre, è preferibile non indossare alcun profumo durante l'esecuzione delle misurazioni. Idealmente, i ratti non reagiscono allo stimolo pretibiale quando viene applicato un monofilo da 15 g prima dell'intervento chirurgico. Tuttavia, se i ratti sono calmi e il 50% -100% dei ratti reagisce ancora al monofilamento da 15 g, cambiarlo in un monofilamento che abbia un tasso di risposta del 10% -20% durante il basale. Tuttavia, se il monofilamento viene modificato, si consiglia di eseguire prima un esperimento pilota per verificare se i ratti TNT reagiscono a questa minore forza del monofilamento. Nel documento iniziale del modello TNT, il sito del neuroma è stato misurato applicando il monofilamento attraverso un'apertura sul fondo di una scatola di perspex17. Negli esperimenti pilota, i ratti reagiscono a ogni stimolo quando applicati attraverso il fondo della gabbia e tendono ad attaccare il monofilamento. Quando tenuti strettamente dal ricercatore, i ratti erano in uno stato calmo, con conseguente tasso di risposta inferiore sul monofilamento durante la misurazione di base.
Se l'estremità del nervo tibiale prossimale non può raggiungere abbastanza lontano nel tunnel sottocutaneo, seguire il corso del nervo tibiale più prossimale e rimuovere qualsiasi tessuto collagenoso e grasso intorno al nervo. Tagliare eventuali rami o vasi nervosi minori che mantengono il nervo fissato all'ambiente circostante. Ciò darà al nervo una gamma più ampia di movimento da trasporre più lateralmente. Si noti che nell'articolo originale di Dorsi et al.17, il nervo è stato trasposto più lateralmente. Negli esperimenti pilota, è risultato impossibile raggiungere la posizione laterale. Pertanto, questo metodo descrive una posizione pretibiale del sito del neuroma.
Limitazioni del metodo
Una limitazione del modello TNT è che l'intervento chirurgico comporta più passaggi (micro) chirurgici da seguire. Un'altra limitazione è che il modello TNT non è facilmente traducibile nei topi. Per esperienza, i topi tendono ad essere piuttosto sensibili agli stimoli applicati in un'area pretibiale, anche con l'applicazione di un monofilamento da 0,008 g.
Significato del metodo rispetto ai metodi esistenti/alternativi
Nel modello TNT, il dolore neuromatico può essere testato indipendentemente dall'iperalgesia plantare sul nervo surale. Quest'ultimo è anche indotto in altri modelli di dolore neuropatico come il modello SNI, ma qui, il dolore neuroma non può essere testato in modo indipendente21. Inoltre, sia il nervo tibiale che quello peroneo vengono tagliati nel modello SNI, con conseguente maggiore perdita della funzione motoria che si traduce in muscoli intrinseci paralizzati della zampa21. Poiché solo il nervo tibiale viene tagliato a livello distale nel modello TNT, i muscoli intrinseci dei piedi mostrano solo una perdita trascurabile della funzione motoria.
Potenziali applicazioni del metodo
Ricerche precedenti hanno già dimostrato che il modello TNT può essere utilizzato per testare vari farmaci antidolorifici, tappi nervosi o altri strumenti chirurgici per il trattamento del neuroma18,19,20. Tuttavia, tutti i gruppi di ricerca interessati al dolore potrebbero trarre potenziale beneficio dall'utilizzo del modello TNT, poiché due diverse modalità di dolore possono essere testate nello stesso animale.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori riferiscono di non avere conflitti di interesse. Sebbene questo lavoro di ricerca sia stato in parte finanziato da Axogen, la ditta non ha avuto alcuna influenza sull'esecuzione dello studio e sui risultati.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Sabine Versteeg per l'assistenza durante la microchirurgia e Anja van der Sar e Trudy Oosterveld-Romijn del Laboratorio animale comune (Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium) per il loro aiuto nella preparazione del microscopio e della sala chirurgica e nella cura degli animali.
Questa ricerca è stata finanziata da Axogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
- Stokvis, A., vander Avoort, D. J., van Neck, J. W., Hovius, S. E., Coert, J. H. Surgical management of neuroma pain: a prospective follow-up study. Pain. 151 (3), 862-869 (2010).
- Domeshek, L. F., et al. Surgical treatment of neuromas improves patient-reported pain, depression, and quality of life. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (2), 407-418 (2017).
- Lame, I. E., Peters, M. L., Vlaeyen, J. W., Kleef, M., Patijn, J. Quality of life in chronic pain is more associated with beliefs about pain, than with pain intensity. European Journal of Pain. 9 (1), 15-24 (2005).
- Koch, H., Haas, F., Hubmer, M., Rappl, T., Scharnagl, E. Treatment of painful neuroma by resection and nerve stump transplantation into a vein. Annals of Plastic Surgery. 51 (1), 45-50 (2003).
- Fisher, G. T., Boswick, J. A. Neuroma formation following digital amputations. Journal of Trauma. 23 (2), 136-142 (1983).
- Bowen, J. B., Ruter, D., Wee, C., West, J., Valerio, I. L. Targeted muscle reinnervation technique in below-knee amputation. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (1), 309-312 (2019).
- Jensen, T. S., Krebs, B., Nielsen, J., Rasmussen, P. Phantom limb, phantom pain and stump pain in amputees during the first 6 months following limb amputation. Pain. 17 (3), 243-256 (1983).
- Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 4 (12), 1038 (2016).
- Arnold, D. M. J., et al. Diagnostic criteria for symptomatic neuroma. Annals of Plastic Surgery. 82 (4), 420-427 (2019).
- Liedgens, H., Obradovic, M., De Courcy, J., Holbrook, T., Jakubanis, R. A burden of illness study for neuropathic pain in Europe. Clinicoeconomics and Outcomes Research. 8, 113-126 (2016).
- Langley, P. C., Van Litsenburg, C., Cappelleri, J. C., Carroll, D. The burden associated with neuropathic pain in Western Europe. Journal of Medical Economics. 16 (1), 85-95 (2013).
- Dworkin, R. H., et al. Interpreting the clinical importance of group differences in chronic pain clinical trials: IMMPACT recommendations. Pain. 146 (3), 238-244 (2009).
- Mackinnon, S. E., Dellon, A. L. Results of treatment of recurrent dorsoradial wrist neuromas. Annals of Plastic Surgery. 19 (1), 54-61 (1987).
- Harden, R. N. Chronic neuropathic pain. Mechanisms, diagnosis, and treatment. Neurologist. 11 (2), 111-122 (2005).
- Poppler, L. H., et al. Surgical interventions for the treatment of painful neuroma: a comparative meta-analysis. Pain. 159 (2), 214-223 (2018).
- Eberlin, K. R., Ducic, I. Surgical algorithm for neuroma management: a changing treatment paradigm. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (10), 1952 (2018).
- Dorsi, M. J., et al. The tibial neuroma transposition (TNT) model of neuroma pain and hyperalgesia. Pain. 134 (3), 320-334 (2008).
- Tork, S., et al. Application of a porcine small intestine submucosa nerve cap for prevention of neuromas and associated pain. Tissue Engineering Part A. 26 (9-10), 503-511 (2020).
- Miyazaki, R., Yamamoto, T. The efficacy of morphine, pregabalin, gabapentin, and duloxetine on mechanical allodynia is different from that on neuroma pain in the rat neuropathic pain model. Anesthesia and Analgesia. 115 (1), 182-188 (2012).
- Tian, J., et al. Swimming training reduces neuroma pain by regulating neurotrophins. Medicine and Science in Sports Exercise. 50 (1), 54-61 (2018).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
- Poublon, A. R., et al. The anatomical relationship of the superficial radial nerve and the lateral antebrachial cutaneous nerve: A possible factor in persistent neuropathic pain. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 68 (2), 237-242 (2015).
- Dixon, W. J.
- Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats. Journal of Visualized Experiments. (61), e3393 (2012).
