Summary
Detta protokoll beskriver tibial neurom-transponeringsmodellen, vilket innebär en lesion av tibialnerven med efterföljande transponering av den proximala nervänden mot en subkutan pretibial eller lateral position. Beteendetestning av neuromsmärta och plantar hyperalgesi kvantifieras med användning av Von Frey-monofilament.
Abstract
Tibial neurom transposition (TNT) är en råttmodell där allodyni vid neuromstället (tibialnerven) oberoende kan utvärderas från allodyni vid plantarytan på bakpoten som innerveras av den intakta sura nerven. Denna TNT-modell är lämplig för att testa terapier för neuromsmärta, såsom den potentiella överlägsenheten hos vissa kirurgiska terapier som redan används i kliniken, eller för att utvärdera nya läkemedel och deras effekt på båda smärtmodaliteterna i samma djur. I denna modell görs en distal lesion (neurotmesis) i tibialnerven, och den proximala nervänden transponeras och fixeras subkutant och pretibiellt för att möjliggöra bedömningar av neuromstället med en 15 g Von Frey-monofilament. För att bedöma allodyni över den sura nerven kan Von Frey-monofilament användas via upp-ner-metoden på baktassens plantarlaterala region. Efter skärning av tibialnerven utvecklas mekanisk överkänslighet vid neuromstället inom 1 vecka efter operationen och kvarstår åtminstone till 12 veckor efter operationen. Allodyni vid den sura innerverade plantarytan utvecklas inom 3 veckor efter operationen jämfört med den kontralaterala extremiteten. Vid 12 veckor bildas ett neurom på den proximala änden av den avskurna tibialnerven, indikerad av dispersion och virvling av axoner. För TNT-modellkirurgi måste flera kritiska (mikro) kirurgiska steg följas, och viss kirurgisk praxis under terminal anestesi rekommenderas. Jämfört med andra neuropatiska smärtmodeller, såsom den sparade nervskademodellen, kan allodyni över neuromstället testas oberoende från sural nervöverkänslighet i TNT-modellen. Neuromplatsen kan dock endast testas hos råttor, inte hos möss. Tipsen och anvisningarna i detta protokoll kan hjälpa forskargrupper som arbetar med smärta att framgångsrikt implementera TNT-modellen i sin anläggning.
Introduction
Varje sår, varierande från enkla lacerationer till hela lemmar amputation, åtföljs av varierande grader av perifer nervskada. Sådan nervskada kan resultera i bildandet av ett neurom, en oorganiserad intrassling av spirande nervfibrer. Neurom blir smärtsamma hos 8% -30% av patienterna, vilket allvarligt påverkar deras livskvalitet 1,2,3,4,5. Efter amputation av lemmar utvecklas neuromsmärta hos 50% av patienterna 6,7,8. Rapporterade symtom inkluderar ömhet, spontan smärta, allodyni, hyperalgesi och mekanisk eller termisk överkänslighet i det innerverade området9. När neuromsmärta inte behandlas tillräckligt inom 1 år kan den avancera till ett kroniskt smärttillstånd, vilket resulterar i hög samhällsbörda och tillhörande medicinska kostnader 10,11,12,13,14. På grund av den dåliga effekten av nuvarande farmakologiska ingrepp behandlas neuromsmärta företrädesvis genom kirurgiskt avlägsnande av det smärtsamma neuromet och nerven behandlas med olika kirurgiska tekniker, som beskrivs i litteraturen15. Det är viktigt att notera att fullständig smärtlindring är sällsynt, smärta förvärras ofta med tiden och 40% av patienterna har inte nytta av operationen, vilket indikerar att nya behandlingar behövs 1,16.
En standardiserad råttmodell av neuromsmärta hjälper till att förstå de mekanismer som driver neuromsmärta och kan hjälpa till att identifiera nya behandlingar eller utvärdera befintliga som används i kliniken. Tibial neuroma transposition (TNT) -modellen beskrevs först av Dorsi et al. 200817 och har använts av olika forskargrupper18,19,20. Det övergripande målet med denna metod är att kunna testa olika behandlingstekniker för neuromsmärta. Fördelen med modellen jämfört med till exempel den förskonade nervskadan (SNI) modell21, är att den gör det möjligt att testa allodyni på neuromplatsen. Detta beror på att modellen involverar transponering av tibialnervens proximala nervänd till en subkutan pretibial position, där den kan undersökas med von Frey-monofilament. Dessutom utvecklas allodyni vid bakpotens plantaryta som innerveras av den intakta sura nerven, som kan bedömas oberoende av neuromsmärtan hos samma djur. Detta liknar symtom på neuromsmärta hos patienter, där ihållande neuropatisk smärta efter avlägsnande av ett smärtsamt neurom ibland orsakas av närliggande nerver22. Dessutom är allodyni över en avskuren nerv med ett neurom en annan smärtmodalitet än allodyni över den intakta angränsande nerven. Således underlättar denna modell bedömningen av effekten av nya terapier på både allodyni närvarande vid neuromstället och mer utbredd neuropatisk smärta testad i bakpotens plantaryta. Eftersom operationen som utförs för att skapa TNT-modellen kan vara utmanande, utarbetar detta dokument proceduren för att stödja forskare som implementerar modellen i sin anläggning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna forskning utfördes i enlighet med IVD (Instantie voor Dierenwelzijn Utrecht) och riktlinjerna för djurförsök, projektnummer AVD1150020198824.
1. Von Frey baslinjemätningar
- Före operationen, utför baslinjemätningar enligt Von Frey-testproceduren, som beskrivs nedan i avsnitt 5 och avsnitt 6.
2. Anestesi och beredning
OBS: Denna studie utfördes på 15 manliga Sprague Dawley-råttor som var 12 veckor gamla.
- Bedöva djuren genom induktion med 5% isofluran och behåll anestesi med 2%-3% isofluran.
OBS: Underhåll med 2% isofluran resulterar vanligtvis i tillräcklig anestesi och spontanandning, utan behov av trakealintubation eller mekanisk ventilation. - Kontrollera djurens reflexer genom att klämma foten med pincett. Se till att djuret inte svarar innan du fortsätter. Raka operationsfältet från knä till fotled med en elektrisk rakapparat och applicera oftalmisk salva på ögonen för att förhindra torrhet. Injicera 0,5 mg/kg smärtstillande karprofen subkutant i bukregionen.
- Placera den bedövade råttan på ryggen med huvudet antingen till vänster eller höger och benet som ska opereras nära kirurgen. Exorotera den nedre bakbenet så att den mediala malleolus vetter uppåt. Placera råttan under ett stereokirurgiskt mikroskop med 6x förstoring.
- Desinficera det rakade området med tre alternerande omgångar jodbaserad skrubb följt av alkohol. Placera ett sterilt ark med ett operativt hål över benet, så att endast operationsfältet är synligt. Se till att upprätthålla dessa sterila förhållanden under operationen.
3. Kirurgi
- Placera en liten bomullspinne under fotleden för att hålla operationsfältet horisontellt. Lokalisera knäet och gör försiktigt ett längsgående snitt på 1-2 cm med en skalpell över bakpotens mediala sida från mitten av kalven till fotleden. Om det behövs, öppna huden och subcutis ytterligare med mikrosax tills muskellagren är synliga.
- Identifiera det ytliga neurovaskulära buntet som två eller tre vita och en tjockare lila / röd linje, ibland med mindre grenar, som kan röra sig fritt över muskelskikten. Använd ett elektrocautery (se materialförteckning), koagulera eventuell aktiv blödning eller sipprar i operationsfältet. Var försiktig så att du inte skadar det neurovaskulära buntet.
- Dissekera rakt på sak för att öppna fascian mellan gastrocnemiusmusklerna, strax bakom det ytliga neurovaskulära knippet på 3,2. Mellan musklernas fascia kan tibialnerven hittas. Tibialnerven är ungefär tre gånger så stor som den ytliga nerven i det neurovaskulära buntet. Använd tibialbenet som ett extra landmärke (tibialnerven ligger precis bakom tibialbenet).
- Identifiera tibialnerven och dess bifurcation.
OBS: Bifurkationen är vanligtvis synlig med en lättare linje längsgående över nerven. - Dissekera försiktigt tibialnerven fri från de omgivande vaskulära buntarna. Utför dissektionen genom att rakt på sak flytta tibialnerven och skära den exponerade vävnaden som visar lite sträcka medan du flyttar tibialnerven.
OBS: Om tibialnerven är fäst vid korsande vener efter dissektion kan dessa vener koaguleras för att exponera hela tibialnerven. Var försiktig så att du inte koagulerar själva tibialbunten. - Exponera tibialnerven proximalt tills den försvinner under ett korsande muskelskikt. Vid denna tidpunkt verkar tibialnerven dyka djupare in i bakpoten mot knäet. Exponera tibialnerven distalt upp till fotleden.
OBS: När tibialnerven exponeras mer distalt kommer mängden korsande kollagenfibrer (dvs fibrer vinkelrätt mot nervfibrernas riktning) att öka. Dessa kollagenfibrer måste skäras för att möjliggöra tillräcklig längd för att transponera tibialnerven.- När hela tibialnerven exponeras, placera muskelskikten tillbaka för att undvika uttorkning av nerven. Om nerven dehydrerar (dvs den blir styvare, tråkig och rynkig) och täckning med muskelskikt inte räcker, tillsätt droppar saltlösning för att hydrera den.
- Använd ett trubbigt mikrokirurgiverktyg, helst en mikronålhållare, dissekera pretibialhuden från det subkutana muskelskiktet för att skapa en subkutan tunnel. För att göra detta, håll upp huden och tryck den trubbiga spetsen in i vävnaden, parallellt med huden. Se till att tunnelns ände ligger pretibiellt eller mer lateralt för att säkerställa enkel åtkomst till området för testning av neurom.
- Öka isofluran till 5%. Gå tillbaka till tibialnerven och exponera den (dvs. gå tillbaka till den plats som beskrivs i steg 3.6). Skär tibialnerven (dvs båda plantargrenarna) på den mest distala nivån nära fotleden. Minska isofluran till den normala nivån på 2%-3%.
- Ändra mikroskopförstoringen till 10x eller 16x. Identifiera tibialnervens epineurium proximalt till snittet i steg 3.8, eller i händelse av en mer proximal bifurkation av tibialnerven, identifiera epineurium för både de mediala och laterala plantargrenarna proximalt till snittet i steg 3.8.
OBS: Pineurium är vitare och fastare jämfört med nervfibrerna inuti, som är mer gula och mjuka. - Placera försiktigt en 8-0 nylonsutur (se materialtabell) genom epineurium i den proximala nervänden genom att försiktigt hålla epineurium med pincett och sätta nålen mellan nerven och epineurium med ett bett på cirka 0,5 mm. Dra suturen igenom och ta en tugga med nålen subkutant i slutet av den subkutana tunneln som gjordes i steg 3.7. Gör en knut, som kommer att transponera nerven lateralt in i den subkutana tunneln.
OBS: Om båda plantargrenarna delar ett gemensamt epineurium, bör en sutur räcka. Om båda plantargrenarna har sitt eget epineurium, bör varje epineurium fixeras individuellt. Undvik att placera suturen genom huden; Fixa det bara subkutant. - Placera en tjockare sutur med en mörk färg (helst en blå eller svart 4-0 sutur) spola till den fixerade nervänden, inte tränga in i huden. Se till att suturen är synlig från utsidan av huden. Kontrollera om nerven förblir på plats efter att ha flyttat tassen och musklerna. Skär av suturändarna med en något längre suturände på 4-0 än på 8-0 sutur.
- Ändra förstoringen av mikroskopet tillbaka till 6x. Stäng huden med intraepidermala suturer med 8-0 sutur och rengör försiktigt huden med 0,9% NaCl med en bomullspinne.
4. Postoperativ behandling
- Placera råttan i en ren bur under en pappershandduk i ett bekvämt läge. Om rummet är kallt, placera en värmedyna under en del av buren (endast under en del av buren eftersom djuret ska kunna fly värmen vid behov). Säkerställ enkel tillgång till mat och vatten.
- Lämna inte den postoperativa råttan utan uppsikt förrän den har återfått tillräckligt med medvetande för att bibehålla sternal liggande. Råttan kan återföras till andra djur när den helt har återhämtat sig från anestesi efter operationen. Detta är vanligtvis efter 1 h och när råttan uppvisar sitt normala gångmönster och beteende.
- Vid 24 timmar och 48 timmar efter operationen, administrera en dos på 0,5 mg / kg karprofen subkutant (bukregionen) för att behandla postoperativ smärta.
5. Von Frey-testning av baktassarnas plantarsida
OBS: Von Frey-testning (steg 5 och 6) utförs före operationen (för baslinjemätning) och från 3 dagar efter operationen.
- Placera råttorna i nättrådsbottenburar 1 vecka före baslinjemätning, eller 2 veckor före operationen, för att säkerställa acklimatisering till testmiljön.
- Börja med baslinjeåtgärder minst 1 vecka före operationen. Se till att tre oberoende baslinjemätningar utförs på separata dagar.
- Kontrollera att råttorna är lugna i de trådbundna bottenburarna. Applicera en serie Von Frey-monofilament med en logaritmisk skala vinkelrätt mot bakpotens plantaryta.
- För att stimulera den sura nerven (överkänslighet), applicera monofilamentet på sidosidan nära hårgränsen. Undvik att röra vid trampdynorna eftersom dessa är känsligare.
- För att stimulera tibialnerven (hyposensitivitet), applicera monofilamentet i mitten av bakpotens plantaryta. Om monofilamentet appliceras i det mest mediala området kan detta också stimulera saphenous nerven, en gren av lårbensnerven (figur 1). Undvik att röra vid trampdynorna.
- Börja med 4 g monofilament. Applicera tillräcklig kraft på monofilamentet så att håret böjer sig och håll i 3 s, och kontrollera sedan djurets svar på monofilamentet. Ett positivt svar är plötslig tassuttag, plötslig flinching, plötslig tasslickning eller vokalisering. I vissa fall rör sig råttan och försöker hitta/attackera monofilamentet.
- Välj nästa monofilament beroende på svaret på stimulansen via upp-ner-metoden23. Till exempel, om råttan svarar, stimulera nästa med 2 g monofilament; Om råttan inte svarar, stimulera med 6 g monofilament, och så vidare. Totalt applicera 5-10 stimuli beroende på reaktionen.
6. Von Frey-testning av neuromplatsen
- Hantera djuren dagligen i minst 5-7 dagar före baslinjeåtgärder eller 2 veckor före operation. Se till att djuren hålls fast enligt beskrivningen i steg 6.2 så att de är bekväma med positionen.
- Håll råttorna med näsan riktad mot armbågsvecket. Om råttan hålls i höger hand ska vänster baktass hänga fritt mellan höger tumme och pekfinger (första banutrymmet). Om råttan hålls i vänster hand ska höger baktass hänga fritt mellan vänster tumme och pekfinger.
- Börja med baslinjeåtgärder minst 1 vecka före operationen. Se till att tre oberoende baslinjemätningar utförs på separata dagar.
- Kontrollera att råttorna är lugna och bekväma medan de hålls. Vid baslinjen placeras 15 g monofilament försiktigt på den pretibiala ytan av den exponerade baktassen. Efter operationen, placera 15 g monofilament på den synliga suturen (t.ex. på platsen för neurom). Applicera tillräcklig kraft på monofilamentet så att håret böjer sig och håll i 1 s.
- Registrera reaktionen på varje stimulans. Reaktionsalternativen inkluderar ingen reaktion, långsam tillbakadragande, snabb tillbakadragande och vokalisering. Registrera svaret som 0 poäng för ingen reaktion och en poäng för långsam tillbakadragande, snabb tillbakadragande eller vokalisering.
- Upprepa fem kluster med fem appliceringar av monofilamentet, med 2-3 s mellan varje applikation och 2-3 min eller mer mellan de fem klustren. Totalt bör varje bakpote ha 25 applikationer av monofilamentet med registrerade svar.
7. Provåtervinning för histologi och beredning
OBS: Histologisk undersökning utförs 12 veckor efter den första operationen.
- Inducera anestesi och bereda djuren enligt beskrivningen i steg 2.2, 2.3 och 2.4.
- Gör försiktigt ett snitt på 2-3 cm med en skalpell över ärret som gjordes vid den första operationen, men var försiktig så att du inte skär för djupt eftersom nerven är ytligt placerad.
- Bestäm neuromets position, dissekera försiktigt neuromet och nerven fri från omgivande ärrvävnad och placera det skördade neuromet i fixativ. För att utvärdera neurommorfologi är vävnaden företrädesvis longitudinellt inbäddad i paraffin eller epoxiharts enligt beskrivningen av Tork et al.18.
- Efter skörd av vävnaden, avliva råttorna under terminal anestesi (5% isofluran) via hjärtpunktion eller halshuggning.
OBS: Det rekommenderas att först skörda neuromet innan du dödar råttorna, för då är det lättare att skilja neuromet från dess omgivande vävnad in vivo.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bedömning vid neuromstället visade ökad känslighet för applicering av 15 g von Frey-monofilamentet. Vid baslinjen svarade råttor vanligtvis på 10% -15% (± 13%) av de 25 applikationerna av en 15 g monofilament. Svarsfrekvensen ökade till 45%-50% (± 24%) 1 vecka efter TNT-operation. På den kontralaterala sidan var antalet svar efter operationen liknande dem vid baseline (figur 2A). Cirka 20% av råttorna utvecklade inte ett smärtsamt neurom; svarsfrekvensen ökade inte jämfört med utgångsvärdet (figur 2B). Detta är jämförbart med den mänskliga situationen, där inte alla patienter (50% efter amputation) utvecklar smärta efter bildandet av ett neurom. Alla råttor utvecklade ett neurom i slutet av den transekterade och transponerade tibialnervstubben 12 veckor efter operationen (figur 3). Detta neurom kännetecknades av virvlande axoner och mikrofasciklar inom kollagenavsättningar.
Transektion av tibialnerven minskade mekanisk känslighet i mitten av plantarsidan av bakpoten, innerverad av tibialnerven (figur 1). Hyposensitiviteten var närvarande 1 vecka efter operationen, skilde sig signifikant från den kontralaterala sidan och baslinjen från 3 veckor efter operationen och kvarstod till minst 12 veckor efter operationen (figur 4). Vid den laterala delen av plantarsidan av bakpoten som innerverades av den intakta sura nerven utvecklade råttorna mekanisk överkänslighet som skilde sig signifikant från den kontralaterala sidan och baslinjen från 1 vecka efter operationen (figur 4). Denna överkänslighet kvarstod i minst 12 veckor efter operationen. Vid den kontralaterala tassen påverkades inte den mekaniska känsligheten jämfört med utgångsvärdet i de områden som antingen innerverades av den sura eller tibialnerven (figur 4).
Figur 1: Nervfördelning på bakpotens plantarsida. Röd = sural nervfördelning (lateral); lila = tibial nervfördelning (mitten); grön = saphenös nervfördelning (medial). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Von Frey på neuromplatsen. Tibialnerven transekterades och förloppet av mekanisk känslighet över neuromstället bedömdes med en 15 g monofilament applicerad i fem kluster om fem applikationer vardera, med totalt 25 applikationer. Ett svar poängsätts som en poäng. (A) Neuromstället visade ett signifikant högre svar 1 vecka efter operationen jämfört med baslinjen och den kontralaterala sidan. N = 15; felstaplar: medelfel (SEM); blandad modellanalys med flera jämförelser och Tukey-test. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001. (B) Individuella värden på den ipsilaterala platsen visar mångfald i reaktion. Tre råttor (20 %) hade en relativt hög baslinjepoäng och tre råttor (20 %) visade inga förändringar i pretibial känslighet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Neuromets morfologi. Histologiska bilder av ett 12 veckor gammalt neurom. (A) Hematoxylin-Eosinfärgning, (B) Massons trikromfärgning och (C) Neurofilamentfärgning. Grön pil = tibialnerven bara proximal till neurom. Orange pil = neurom, identifierad genom virvlande av axoner och diffusion av fasciklarna. Skalstapel = 500 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Von Frey av plantar bakpoten (tibial och sural nerv). Tibialnerven transekterades och förloppet av mekanisk känslighet bedömdes genom Von Frey-testning vid baktassens plantaryta. Den mellersta delen av den ipsilaterala opererade bakpoten som innerverades av tibialnerven visade hyposensitivitet. Den laterala delen av den ipsilaterala opererade baktassen som innerverades av den sura nerven visade överkänslighet. De mellersta och laterala delarna av plantar kontralateral baktass visade inga förändringar i känslighet jämfört med baslinjen. N = 15; felstaplar: medelfel (SEM); blandad modellanalys med flera jämförelser och Tukey-test. * = p < 0,05, ** = p < 0,01, *** = p < 0,001, **** = p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet
TNT-modellen innebär att tibialnerven skärs och transponeras lateralt och subkutant till en pretibial plats för att möjliggöra känslighetstestning av neuromet, förutom plantarhyperalgesi över den sura nerven. I TNT-modellen är det viktigt att neuromets plats är synlig för forskarna. Därför föredras en albino råttstam eftersom subkutana suturer är lätt synliga genom huden och suturens färg bör helst vara mörkblå eller svart.
När operationen utförs och tibialnerven exponeras finns det variation på platsen (t.ex. proximal eller distal) för bifurkationen av tibialnerven. Om råttor har en proximal bifurkation är det möjligt att två nerver kan hittas (den mediala och laterala plantarnerven) proximalt till fotleden (figur 5A), istället för bara en tibialnerv (figur 5B). Det är viktigt att båda grenarna skärs och transponeras för att inducera plantar hyperalgesi över den sura nerven. Man kan välja att bara transponera en plantarnerv; En skillnad mellan den laterala och mediala plantarnerven är dock inte lätt att göra på denna nivå och kan påverka resultaten. Därför rekommenderas att transponera båda nerverna. Dessutom kan vissa råttor ha en mer distal bifurcation av tibialnerven, och transponering av endast en plantarnerv kan vara omöjligt.
Figur 5: Proximal och distal bifurcation av tibialnerven. Anatomisk variation i bifurkationsnivån (*) av tibialnerven. a) Proximal förgrening av tibialnerven. b) distal förgrening av tibialnerven. Förkortningar: MPN = medial plantarnerv, LPN = lateral plantarnerv. Klicka här för att se en större version av denna figur.
I originalartikeln av Dorsi et al.17 placeras en ligatur runt den proximala tibialnervänden och nerven transponeras och fixeras via denna ligatursutur. Eftersom ligaturen runt nerven kan framkalla förträngningssmärta24, är ett alternativ som beskrivs i denna metod att fixera nerven med hjälp av epineurinala suturer. Om tibialnerven skärs och transponeras är det viktigt att suturen för att fixera nerven subkutant placeras genom epineurium och inte nervfasciklarna själva, eftersom detta också kan påverka smärtåtgärder. Dessutom bör man undvika att placera suturen genom huden, eftersom råttor tenderar att gnaga några synliga suturer, vilket resulterar i förskjutning av neurom och därmed otillförlitliga resultat av smärtåtgärder.
När huden är stängd är det också viktigt att använda intraepidermala suturer för att undvika gnagning som kommer att resultera i ett öppet sår. Dessutom, efter att ha transponerat tibialnerven, kommer den att ligga i ett mer ytligt lager strax under huden. Ett öppet sår i kombination med en ytligt placerad nerv är oönskade.
Von Frey-mätningar kan utföras för att testa neuromsmärta på neuromplatsen och för att testa plantarhyperalgesi över den sura nerven, på bakpotens laterala sida. Neuromplatsen är synlig efter operationen på grund av suturens mörka färg. För att testa den sura nervens överkänslighet bör en plats väljas där Von Frey-monofilamentet appliceras. Detta kan vara proximalt eller distalt mot den laterala matdynan, men bör vara ungefär samma plats under baslinjemätningar och mätningar under veckorna efter operationen.
Felsökning av metoden
Om råttorna reagerar på alla stimuli som appliceras på pretibialområdet redan under baslinjemätningarna, se till att de är lugna och avslappnade och att de är ordentligt acklimatiserade till testområdet. Upprepa baslinjemätningen tills råttorna reagerar mindre på stimuli. Dessutom är det att föredra att inte bära någon parfym när du utför mätningar. Helst reagerar råttor inte på pretibial stimulans när en 15 g monofilament appliceras före operationen. Men om råttorna är lugna och 50% -100% av råttorna fortfarande reagerar på 15 g monofilament, byt det till ett monofilament som har en svarsfrekvens på 10% -20% under baslinjen. Men om monofilamentet byts rekommenderas det att först utföra ett pilotexperiment för att testa om TNT-råttorna reagerar på denna lägre styrka av monofilament. I det ursprungliga papperet i TNT-modellen mättes neuromstället genom att applicera monofilamentet genom en öppning i botten av en Perspex-låda17. I pilotexperiment befanns råttor reagera på varje stimulans när de applicerades via botten av buret och tenderade att attackera monofilamentet. När de hölls nära av forskaren var råttorna i ett lugnt tillstånd, vilket resulterade i en lägre svarsfrekvens på monofilamentet under baslinjemätningen.
Om den proximala tibialnervänden inte kan nå tillräckligt långt i den subkutana tunneln, följ tibialnervens kurs mer proximalt och ta bort eventuell kollagen och fettvävnad runt nerven. Skär några mindre nervgrenar eller kärl som håller nerven fixerad till dess omgivning. Detta kommer att ge nerven ett bredare rörelseområde som ska transponeras mer lateralt. Observera att i den ursprungliga artikeln av Dorsi et al.17 transponerades nerven mer lateralt. I pilotexperiment visade det sig vara omöjligt att nå sidopositionen. Därför beskriver denna metod en pretibial position av neuromplatsen.
Begränsningar av metoden
En begränsning med TNT-modellen är att operationen innebär flera (mikro)kirurgiska steg som ska följas. En annan begränsning är att TNT-modellen inte lätt översätts till möss. Av erfarenhet tenderar möss att vara ganska känsliga för stimuli applicerade vid ett pretibiellt område, även med applicering av en 0,008 g monofilament.
Metodens betydelse i förhållande till befintliga/alternativa metoder
I TNT-modellen kan neuromsmärta testas oberoende av plantarhyperalgesi över den sura nerven. Det senare induceras också i andra neuropatiska smärtmodeller som SNI-modellen, men här kan neuromsmärta inte testas oberoende21. Dessutom skärs både tibial- och peronealnerven i SNI-modellen, vilket resulterar i mer förlust av motorisk funktion vilket resulterar i förlamade inneboende muskler i tassen21. Eftersom endast tibialnerven skärs på en distal nivå i TNT-modellen, visar de inneboende musklerna i fötterna endast en försumbar förlust av motorisk funktion.
Potentiella tillämpningar av metoden
Tidigare forskning har redan visat att TNT-modellen kan användas för att testa olika smärtstillande läkemedel, nervkapslar eller andra kirurgiska verktyg för neurombehandling18,19,20. Alla forskargrupper som är intresserade av smärta kan dock ha potentiell nytta av att använda TNT-modellen, eftersom två olika smärtmodaliteter kan testas i samma djur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna rapporterar att de inte har någon intressekonflikt. Även om detta forskningsarbete delvis finansierades av Axogen hade företaget inget inflytande över genomförandet av studien och på resultaten.
Acknowledgments
Vi vill tacka Sabine Versteeg för att ha hjälpt till under mikrokirurgi och Anja van der Sar och Trudy Oosterveld-Romijn från Common Animal Laboratory (Gemeenschappelijk Dieren Laboratorium) för deras hjälp med att förbereda mikroskopet och operationsrummet och ta hand om djuren.
Denna forskning finansierades av Axogen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Aesthesio | Linton Instrumentation | 514007 until 514015 | 0.6 g until 15 g monofilaments |
| Carprofen | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes caprofen dilution |
| Cotton swabs | Nobamed | 974255 | |
| Electrocautery | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Ethanol 70% | Interchema BV | 400406 | |
| Ethilon 4.0 | Johnson & Johnson | 1854G | IMPORTANT: the color should be blue or black |
| Ethilon 8.0 | Johnson & Johnson | BV130-5 | |
| Isoflo, isoflurane Zoetis | Dechra Veterinary Products | B506 | |
| Mesh bottom cages | StoeltingCo | 57816 and 57824 | |
| Micro forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Micro needle holder | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Micro scissors | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Micro tweezers | Fine Science Tools | 11254-20 | |
| NaCl 0.9% | Trademed | H7 1000-FRE | |
| Needle holder | Fine Science Tools | 12004-16 | |
| Ophthalmic ointment | Local Veterinary Pharmacy | n/a | The local veterinary pharmacy makes the ophthalmic ointment |
| Scalpel | Fine Science Tools | 10003-12 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14001-12 | |
| Stereo surgical microscope | Leica | A60 F | |
| Sterile sheet with hole | Evercare OneMed | 1555-01 | |
| Surgical blade nr.15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Tweezers | Fine Science Tools | 11617-12 |
References
- Stokvis, A., vander Avoort, D. J., van Neck, J. W., Hovius, S. E., Coert, J. H. Surgical management of neuroma pain: a prospective follow-up study. Pain. 151 (3), 862-869 (2010).
- Domeshek, L. F., et al. Surgical treatment of neuromas improves patient-reported pain, depression, and quality of life. Plastic and Reconstructive Surgery. 139 (2), 407-418 (2017).
- Lame, I. E., Peters, M. L., Vlaeyen, J. W., Kleef, M., Patijn, J. Quality of life in chronic pain is more associated with beliefs about pain, than with pain intensity. European Journal of Pain. 9 (1), 15-24 (2005).
- Koch, H., Haas, F., Hubmer, M., Rappl, T., Scharnagl, E. Treatment of painful neuroma by resection and nerve stump transplantation into a vein. Annals of Plastic Surgery. 51 (1), 45-50 (2003).
- Fisher, G. T., Boswick, J. A. Neuroma formation following digital amputations. Journal of Trauma. 23 (2), 136-142 (1983).
- Bowen, J. B., Ruter, D., Wee, C., West, J., Valerio, I. L. Targeted muscle reinnervation technique in below-knee amputation. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (1), 309-312 (2019).
- Jensen, T. S., Krebs, B., Nielsen, J., Rasmussen, P. Phantom limb, phantom pain and stump pain in amputees during the first 6 months following limb amputation. Pain. 17 (3), 243-256 (1983).
- Woo, S. L., et al. Regenerative peripheral nerve interfaces for the treatment of postamputation neuroma pain: a pilot study. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 4 (12), 1038 (2016).
- Arnold, D. M. J., et al. Diagnostic criteria for symptomatic neuroma. Annals of Plastic Surgery. 82 (4), 420-427 (2019).
- Liedgens, H., Obradovic, M., De Courcy, J., Holbrook, T., Jakubanis, R. A burden of illness study for neuropathic pain in Europe. Clinicoeconomics and Outcomes Research. 8, 113-126 (2016).
- Langley, P. C., Van Litsenburg, C., Cappelleri, J. C., Carroll, D. The burden associated with neuropathic pain in Western Europe. Journal of Medical Economics. 16 (1), 85-95 (2013).
- Dworkin, R. H., et al. Interpreting the clinical importance of group differences in chronic pain clinical trials: IMMPACT recommendations. Pain. 146 (3), 238-244 (2009).
- Mackinnon, S. E., Dellon, A. L. Results of treatment of recurrent dorsoradial wrist neuromas. Annals of Plastic Surgery. 19 (1), 54-61 (1987).
- Harden, R. N. Chronic neuropathic pain. Mechanisms, diagnosis, and treatment. Neurologist. 11 (2), 111-122 (2005).
- Poppler, L. H., et al. Surgical interventions for the treatment of painful neuroma: a comparative meta-analysis. Pain. 159 (2), 214-223 (2018).
- Eberlin, K. R., Ducic, I. Surgical algorithm for neuroma management: a changing treatment paradigm. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 6 (10), 1952 (2018).
- Dorsi, M. J., et al. The tibial neuroma transposition (TNT) model of neuroma pain and hyperalgesia. Pain. 134 (3), 320-334 (2008).
- Tork, S., et al. Application of a porcine small intestine submucosa nerve cap for prevention of neuromas and associated pain. Tissue Engineering Part A. 26 (9-10), 503-511 (2020).
- Miyazaki, R., Yamamoto, T. The efficacy of morphine, pregabalin, gabapentin, and duloxetine on mechanical allodynia is different from that on neuroma pain in the rat neuropathic pain model. Anesthesia and Analgesia. 115 (1), 182-188 (2012).
- Tian, J., et al. Swimming training reduces neuroma pain by regulating neurotrophins. Medicine and Science in Sports Exercise. 50 (1), 54-61 (2018).
- Decosterd, I., Woolf, C. J. Spared nerve injury: an animal model of persistent peripheral neuropathic pain. Pain. 87 (2), 149-158 (2000).
- Poublon, A. R., et al. The anatomical relationship of the superficial radial nerve and the lateral antebrachial cutaneous nerve: A possible factor in persistent neuropathic pain. Journal of Plastic, Reconstructive and Aesthetic Surgery. 68 (2), 237-242 (2015).
- Dixon, W. J.
- Austin, P. J., Wu, A., Moalem-Taylor, G. Chronic constriction of the sciatic nerve and pain hypersensitivity testing in rats. Journal of Visualized Experiments. (61), e3393 (2012).
