Ein Abonnement von JoVE ist erforderlich, um diesen Inhalt anzuzeigen. Melden Sie sich an oder beginnen Sie noch heute mit einer kostenlosen Testphase.

Methodenartikel

Nachweis polyfunktioneller T-Zellen bei Kindern, die mit Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, mittels Durchflusszytometrie

1.9K Ansichten

⸱

DOI:

10.3791/64671

⸱

23. September 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infectious Diseases, Key Laboratory of Major Diseases in Children, Ministry of Education, National Clinical Research Center for Respiratory Diseases, Laboratory of Infection and Virology, Beijing Pediatric Research Institute, Beijing Children’s Hospital, Capital Medical University, National Center for Children’s Health, 2Research Unit of Critical Infection in Children, 2019RU016, Chinese Academy of Medical Sciences, 3Department of Pediatric Rehabilitation, Beijing Boai Hospital, School of Rehabilitation Medicine, Capital Medical University, China Rehabilitation Research Center, 4Center of Excellence (Beijing), Becton Dickinson Medical Devices (Shanghai) Co Ltd

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll kombiniert Ex-vivo-Stimulation und Durchflusszytometrie, um polyfunktionelle T-Zell-Profile (T PF) in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) bei mit dem Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) geimpften Kindern zu analysieren. Die Detektionsmethode und das Farbschema der Durchflusszytometrie von JEV-spezifischen TPFs wurden getestet, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern.

Zusammenfassung

Die T-Zell-vermittelte Immunität spielt eine wichtige Rolle bei der Kontrolle der Flavivirus-Infektion, entweder nach der Impfung oder nach einer natürlichen Infektion. Die "Qualität" einer T-Zelle muss nach Funktion beurteilt werden, und eine höhere Funktion ist mit einem stärkeren Immunschutz verbunden. T-Zellen, die gleichzeitig zwei oder mehr Zytokine oder Chemokine auf Einzelzellebene produzieren können, werden als polyfunktionelle T-Zellen (TPFs) bezeichnet, die Immunantworten durch eine Vielzahl von molekularen Mechanismen vermitteln, um Degranulationsmarker (CD107a) zu exprimieren und Interferon (IFN)-γ, Tumornekrosefaktor (TNF)-α, Interleukin (IL)-2 oder Makrophagen-Entzündungsprotein (MIP)-1α zu sezernieren. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dassT-PFeng mit der Aufrechterhaltung des langfristigen Immungedächtnisses und -schutzes zusammenhängen und dass ihr erhöhter Anteil ein wichtiger Marker für schützende Immunität und wichtig für die wirksame Kontrolle von Virusinfektionen und Reaktivierungen ist. Diese Bewertung gilt nicht nur für spezifische Immunantworten, sondern auch für die Beurteilung von kreuzreaktiven Immunantworten. Hier wurden am Beispiel des Japanischen Enzephalitis-Virus (JEV) die Nachweismethode und das durchflusszytometrische Farbschema von JEV-spezifischenT-PFsgetestet, die von peripheren mononukleären Blutzellen von Kindern produziert werden, die gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, um eine Referenz für ähnliche Studien zu liefern.

Einleitung

Das Japanische Enzephalitis-Virus (JEV) ist ein wichtiges durch Mücken übertragenes Virus der Gattung Flavivirus innerhalb der Familie Flaviviridae1. Viele asiatisch-pazifische Länder stehen aufgrund der enormen Krankheitslast durch die Japanische Enzephalitis (JE) seit langem vor enormen Herausforderungen für die öffentliche Gesundheit, aber dies hat sich mit der zunehmenden Verfügbarkeit verschiedener Arten von Impfungen dramatisch verbessert2. Adaptive schützende Immunantworten, die durch natürliche Infektionen oder Impfungen hervorgerufen werden, tragen zur Prävention und antiviralen Regulation bei. Humorale Immunität und zellvermittelte Immunität werden als adaptive Immunität klassifiziert, und die Induktion der ersteren wurde immer als Schlüsselstrategie im Impfstoffdesign angesehen, wenn auch mit relativ begrenztem Verständnis in der Vergangenheit3. Die Rolle der T-Zell-vermittelten Immunität bei der Begrenzung der Flavivirusverbreitung und Virusclearance wurde jedoch zunehmend in den Fokus gerückt und umfassend untersucht4. Darüber hinaus ist die T-Zell-Immunität nicht nur für JEV-spezifische antivirale Reaktionen unverzichtbar, sondern spielt auch eine herausragende Rolle beim Kreuzschutz vor Sekundärinfektionen mit heterologen Flaviviren, was in früheren Studien gezeigt wurde5. Es wird spekuliert, dass dieser Effekt potenzielle Antikörper-vermittelte Verstärkungseffekte bei Infektion umgehen kann5. Bemerkenswert ist, dass eine solche kreuzreaktive T-Zell-Immunität wichtig ist, insbesondere in Abwesenheit von Impfstoffen und antiviralen Medikamenten gegen Flaviviren. Obwohl viele Studien durchgeführt wurden, um den Beitrag von T-Zellen bei der JEV-Infektion in Bezug auf CD4+ und CD8+ T-Zellen6,7 zu bestimmen, bleiben die jeweiligen Linien der Zytokine und ihre funktionelle Diversifizierung unbestimmt, was bedeutet, dass die Aufklärung der genauen Funktionen von Helfer- und Killer-T-Zellen behindert wird.

Das Ausmaß ihrer antiviralen Abwehrkräfte bestimmt die Qualität der T-Zell-Antworten. CD4+ oder CD8+ T-Zellen, die kompatibel zwei oder mehr Funktionen übertragen können, einschließlich Zytokinsekretion und Degranulation, werden bei spezifischer Stimulation auf Einzelzellebene als polyfunktionelle T-Zellen (TPFs) charakterisiert8. CD4+ T-Zellen, die einzelne oder mehrere Zytokine produzieren, können verschiedene Wirkungen und Immungedächtnisse haben. Zum Beispiel bilden IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-Zellen eher eine langfristig wirksame Schutzreaktion als IL-2+ CD4+ T-Zellen9, was als wichtiger Parameter zur Bewertung des Impfeffekts verwendet werden kann. Die Häufigkeit von IL-2+ IFN-γ+ CD4+ T-Zellen ist bei Patienten mit langfristiger Nicht-Progression des erworbenen Immunschwächesyndroms (AIDS) erhöht, während CD4+ T-Zellen bei Patienten mit AIDS-Progression aufgrund der fördernden Wirkung von IL-2 auf die T-Zellproliferationeher dazu neigen, IFN-γ allein zu produzieren. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass eine Untergruppe von IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ langfristig in vivo überlebt und die Tötungsfunktion synergistisch fördert11. Obwohl CD8+ T-Zellen eher zytotoxische Aktivität aufweisen, sind einige CD4+ T-Zellen auch mit zytotoxischer Aktivität als indirekt nachgewiesene Expression von Oberflächen-CD107a-Molekülenausgestattet 12. Darüber hinaus exprimieren bestimmte T-Zell-Untergruppen das Chemokin MIP-1α, das oft von Monozyten sezerniert wird, um an der T-Zell-vermittelten Neutrophilenrekrutierung teilzunehmen13. In ähnlicher Weise können CD8+ TPFs auch verwendet werden, um die Vielseitigkeit der oben genannten Marker zu charakterisieren. Studien haben gezeigt, dass die Prime-Boost-Strategie effektiv einen längeren Zeitraum von T-PF-Schutzwirkungen induzieren kann13, was den durch die Impfung hervorgerufenen Schutz verstärken kann. Ein zentrales Merkmal bei der Untersuchung des Immunsystems ist die Fähigkeit von Gedächtnis-T-Zellen, stärkere, schnellere und effektivere Reaktionen auf sekundäre virale Herausforderungen zu ermöglichen als naive T-Zellen. Effektorgedächtnis-T-Zellen (T EM) und zentrale Gedächtnis-T-Zellen (T CM) sind wichtige T-Zell-Untergruppen, die oft durch die zusammengesetzte Expression von CD27/CD45RO oder CCR7/CD45RA 14 unterschieden werden. TCM (CD27+ CD45RO+ oder CCR7+ CD45RA-) neigt dazu, sich in sekundären lymphatischen Geweben zu lokalisieren, während TEM (CD27- CD45RO+ oder CCR7- CD45RA-) in lymphatischen und peripheren Geweben lokalisiert15,16. TEM bietet eine sofortige, aber nicht anhaltende Abwehr, während TCM die Reaktion aufrechterhält, indem es sich in den sekundären lymphatischen Organen vermehrt und neue Effektoren erzeugt17. Da Gedächtniszellen spezifische und effiziente Erinnerungsreaktionen auf Viren vermitteln können, stellen sich Fragen nach dem Beitrag dieser Untergruppe von Polyfunktionen.

Mit der Entwicklung der Durchflusszytometrie-Technologie ist es üblich geworden, Marker von mehr als 10 Clustern, Phänotypen und Differenzierungsantigenen gleichzeitig zu erkennen, was vorteilhaft ist, um die funktionellen immunologischen Merkmale einzelner T-Zellen besser zu kommentieren, um Fehlinterpretationen und Schwierigkeiten beim Verständnis von T-Zell-Phänotypen zu reduzieren. Diese Studie verwendete Ex-vivo-Stimulation und Durchflusszytometrie, umT-PF-Profile in peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) bei JEV-geimpften Kindern zu analysieren. Mit diesem Ansatz wird das Verständnis der kurz- und langfristigen JEV-spezifischen und sogar kreuzreaktiven T-Zell-Immunität, die durch Impfung induziert wird, erweitert.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

Die ethische Genehmigung für die vorliegende Studie wurde von der Ethikkommission des Beijing Children's Hospital, Capital Medical University, erhalten (Zulassungsnummer: 2020-k-85). Freiwillige wurden vom Beijing Children's Hospital der Capital Medical University rekrutiert. Periphere venöse Blutproben wurden von scheinbar gesunden Kindern (2 Jahre alt) entnommen, die zuvor weniger als ein halbes Jahr lang eine Prime- und Boost-Impfung mit lebend-attenuiertem JE SA14-14-2-Impfstoff erhalten hatten (JE-geimpfte Kinder, n = 5) und ungeimpfte Kinder (6 Monate alt, n = 5). Auf die Einwilligung des Menschen wurde verzichtet, da in dieser Studie nur die Restproben verwendet wurden, nachdem sie klinisch getestet wurden. Um die Privatsphäre der Freiwilligen zu schützen, wurden alle Daten vollständig anonymisiert und anonymisiert.

1. Isolierung von PBMCs aus peripherem venösem Blut

  1. Sammeln Sie periphere venöse Blutproben (2 ml) von JE-geimpften und ungeimpften Kindern in EDTA-K 2-antikoagulierten Röhrchen (siehe Materialtabelle) mit der Standard-Venenpunktionstechnik18.
  2. Fügen Sie 2 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x PBS) hinzu, um das periphere Blut zu verdünnen.
    HINWEIS: Der Prozess wird so schnell wie möglich durchgeführt, um die maximale Überlebensfähigkeit zu erhalten.
  3. 4 ml des Dichtegradientenmediums (siehe Materialtabelle) in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen geben und das verdünnte Blut langsam in die obere Schicht des Trennmediums überführen.
    HINWEIS: Mischen Sie das Blut nicht mit dem Trennmedium und zerstören Sie nicht die Kontaktfläche, die von den beiden Flüssigkeiten gebildet wird. Andernfalls wird der Trenneffekt nicht erreicht.
  4. Bei 800 × g 20 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Beobachten Sie die signifikanten Schichten nach dem Zentrifugieren.
  5. Die PBMCs (die mittlere Schicht) werden in ein weiteres 15-ml-Zentrifugenröhrchen überführt und die PBMCs mit 10 ml RPMI-1640-Medium gewaschen, das 10% fötales Rinderserum enthält (FBS, siehe Materialtabelle).
  6. Bei 800 × g 10 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand mit einer Pipette vorsichtig entsorgen.
  7. Resuspendieren Sie die PBMCs mit 1 ml RPMI-1640-Medium, das 10% FBS enthält, und zählen Sie die Zellen mit einem automatisierten Trypanblau-basierten Zähler (siehe Materialtabelle).

2. Stimulation von PBMCs durch inaktivierte JEV-Partikel zur Induktion der Zytokinexpression

  1. Legen Sie zwei Untergruppen der JEV-Stimulations- und Kontrollgruppen in den JE-geimpften bzw. ungeimpften Proben fest.
  2. Stellen Sie die Anzahl der PBMCs auf 2 × 10 6 Zellen/ml mit RPMI-1640-Medium mit 10 % FBS ein und säen Sie die PBMCs in 24-Well-Platten (2 × 106 Zellen/1 ml Medium pro Well); Impfen Sie drei Brunnen für jede Gruppe.
  3. Stimulation der PBMCs der JEV-Stimulationsgruppe mit konzentrierten inaktivierten JEV-Partikeln 5 (2 × 105 PFU) für 16 h bei 37 °C in Gegenwart der monoklonalen Antikörper CD28 (1 μg/ml, 1:1.000) und CD49d (1 μg/ml), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1.000) und Monensin (1 μg/ml, 1:1.000). Verwenden Sie zur Oberflächenfärbung BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000) (siehe Materialtabelle).
    ANMERKUNG: Der JEV wurde durch UV-Bestrahlung inaktiviert, wie zuvor beschrieben19.
  4. Stimulierung der PBMCs der Kontrollgruppe ohne konzentrierte Viruspartikel für 16 h bei 37 °C in Gegenwart der monoklonalen Antikörper CD28 (1 μg/ml, 1:1.000) und CD49d (1 μg/ml, 1:1.000), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1.000) und Monensin (1 μg/ml, 1:1.000). Färben Sie die Oberfläche mit BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1.000).

3. Ex-vivo intrazelluläre Färbung

  1. Sammeln Sie die Zellsuspension von jeder Gruppe in einem 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen, zentrifugieren Sie bei 500 × g für 5 min bei Raumtemperatur und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette.
  2. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS, fügen Sie fixierbaren Lebensfähigkeitsfarbstoff (1 μL / ml, 1:1.000, siehe Materialtabelle) zur Zellsuspension hinzu und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur im Dunkeln. Bei 500 × g (bei Raumtemperatur) 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  3. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. Bei 500 × g (bei Raumtemperatur) 5 min zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig.
  4. Führen Sie eine Zelloberflächenmarkerfärbung durch.
    1. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL 1x PBS und fügen Sie der Zellsuspension in jedem Röhrchen 2 μL jedes Oberflächenmarker-Antikörpers (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 und BV480-anti-CD45RO, Verdünnungsfaktor: 1:50, siehe Materialtabelle) hinzu.
      HINWEIS: Das Farbfluoreszenz-Antikörper-Färbeprotokoll ist in Tabelle 1 dargestellt.
    2. Die Röhrchen (Schritt 3.4.1) 30 min bei Raumtemperatur inkubieren und vor Licht schützen. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
      HINWEIS: Der Antikörper von BUV737-anti-CD27 und BV480-anti-CD45RO kann durch BUV737-anti-CCR7 und BV480-anti-CD45RA als Annotation der Gedächtnis-T-Zellen ersetzt werden.
  5. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. Bei 500 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Verwerfen Sie den Überstand vorsichtig.
  6. Führen Sie eine Fixierung und einen Membranbruch durch.
    1. Resuspendieren Sie die Zellen mit 500 μL membranbrechender Fixierlösung (siehe Materialtabelle) und fixieren Sie die Zellen für 20 min im Dunkeln bei Raumtemperatur. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  7. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. 5 min bei 500 × g bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen.
  8. Führen Sie eine intrazelluläre Zytokinfärbung durch.
    1. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 μL 1x PBS und geben Sie 2 μL jedes Zytokin-Antikörpers (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 und APC-anti-MIP-1α, Verdünnungsfaktor: 1:50, siehe Materialtabelle) zur Zellsuspension in jedem Röhrchen.
      HINWEIS: Die Volumina und Informationen zu fluorophorkonjugierten Antikörpern sind in Tabelle 1 aufgeführt.
    2. Die Röhrchen (Schritt 3.8.1) 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubieren. Bei 500 × g 5 min zentrifugieren und den Überstand entfernen.
  9. Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml 1x PBS. Bei 500 × g 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren und den Überstand vorsichtig entfernen. Fügen Sie 500 μL 1x PBS hinzu, um die Zellen zu resuspendieren.

4. Einrichtung der Durchflusszytometrie

  1. Isolieren Sie die PBMC-Probe allein, indem Sie die in Schritt 1 beschriebenen Verfahren als Kontrollstichprobe ausführen. Teilen Sie die Zellsuspension in 12 gleiche Teile in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen (100 μL / Röhrchen), wie unten erwähnt.
    1. Stellen Sie ungefärbte, APC-Cy7-live/dead fixierbare gefärbte, BV650-anti-CD3 einfach gefärbte, BUV395-anti-CD4 einfach gefärbte, BV421-anti-CD8 einfach gefärbte, BUV737-anti-CD27 einfach gefärbte, BV480-anti-CD45RO gefärbt, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ gefärbt, PE-anti-TNF-α einfach gefärbt, BV785-anti-IL-2 einfach gefärbt und APC-anti-MIP-1α einfach gefärbte Proben auf.
  2. Fügen Sie die Zelloberflächenmarker und die intrazelluläre Zytokinfärbung wie in Schritt 3 beschrieben hinzu. Fügen Sie für jede einzelne Färbeprobe nur einen der Fluorophore aus dem Färbeschritt hinzu. Fügen Sie 500 μL 1x PBS hinzu, um die Zellen und den Wirbel mit niedriger Geschwindigkeit zu resuspendieren.
  3. Passen Sie mit einer ungefärbten Probe die Vorwärtsstreuung (FSC), die Seitenstreuung (SSC) und die verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffspannungen an.
    HINWEIS: Für die vorliegende Studie wurden die folgenden Spannungen eingestellt. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V und BV785: 725 V.
  4. Passen Sie die Durchflusszytometrie-Kompensation mithilfe der Einzelfärbungsproben an, um die Kontaminationssignale zwischen den verschiedenen Fluorophoren zu eliminieren.
    HINWEIS: Die Kompensationsparameter sind in Tabelle 2 aufgeführt.

5. Gating-Strategie und Datenanalyse

ANMERKUNG: In der vorliegenden Studie wurden für diese Analyse die zentralen Gedächtnis-T-Zellen (TCM von CD8+ oder CD4+ T-Zellen als CD27+ CD45RO+ oder CCR7+ CD45RA- und die Effektorgedächtnis-T-Zellen (TEM) von CD8+ oder CD4+ T-Zellen als CD27- CD45RO+ oder CCR7- CD45RA- definiert16.

  1. Zeichnen Sie ein Polygongatter durch das FSC-Area (FSC-A)/SSC-Area (SSC-A) Punktdiagramm, um die intakte Lymphozytenpopulation auszuwählen und dabei die Trümmer auszuschließen (Abbildung 1A).
  2. Zeichnen Sie ein rechteckiges Tor durch das FSC-A/FSC-width (FSC-W)-Punktdiagramm, um die einzelnen Zellen auszuwählen (Abbildung 1B).
  3. Zeichnen Sie ein rechteckiges Tor durch das Live/Dead/SSC-A-Punktdiagramm, um die lebenden Zellen auszuwählen (Abbildung 1C).
  4. Zeichnen Sie ein rechteckiges Tor durch das CD3/SSC-A-Punktdiagramm, um die CD3+ T-Zellen zu identifizieren (Abbildung 1D).
  5. Zeichnen Sie ein Quad-Gate durch das CD4/CD8-Punktdiagramm, um die CD4+- oder CD8+-T-Zellen zu identifizieren (Abbildung 1E).
  6. Zeichnen Sie ein Quad-Gate durch das CD45RO/CD27-Punktdiagramm, um die CD4+- oder CD8+-T-Zellen in TCM (CD27+ CD45RO+) und TEM (CD27- CD45RO+) zu unterteilen (Abbildung 1F-I).
  7. Zeichnen Sie die Gatter von CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 und MIP-1α aus dem TCM oder TEM der CD8+ oder CD4+ T-Zellen, um die Frequenz verschiedener Antwortmuster zu bestimmen.
  8. Laden Sie die Proben nacheinander auf die Zytometrie. Verwenden Sie ein Stopptor 20, um 1 ×10 6 Lymphozyten zu erfassen.
    HINWEIS: Der einzelne Benutzer kann mehr als 1 × 106 Zellen sammeln. Diese Zahl war ein Kompromiss zwischen der benötigten Zeit und der Sammlung von genügend Zellen, um aussagekräftige Ergebnisse zu liefern.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt die Gating-Strategie, mit der dieT-CM- oderT-EM von CD8+- oder CD4+-T-Zellen aus einer repräsentativen JEV-Stimulationsgruppe von JE-geimpften Kindern geteilt wird. Das FSC-A/SSC-A-Punktdiagramm wird verwendet, um Lymphozyten zu identifizieren, und das FSC-A/FSC-W-Punktdiagramm wird verwendet, um einzelne Zellen zu identifizieren. Lebensfähige Zellen werden auf dem Lebend/Toten/SSC-A-Punktdiagramm ausgewählt. Das CD3/SSC-A-Punktdi...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

Dieses Protokoll stellt eine praktikable Durchflusszytometrie-basierte Nachweismethode fürT-PF-Profile in den PBMCs von Kindern dar, die mit dem JEV-Impfstoff SA14-14-2 geimpft wurden. Diese Studie verwendete die venösen Blut-PBMCs von geimpften und ungeimpften Kindern als Forschungsmaterialien. Mit der Stimulation von PBMCs mit dem JEV-Antigen können diese amplifizierten antigenspezifischenT-PFsdurch mehrfarbige Durchflusszytometrie-Antikörperfärbung charakterisiert werden. Im Vergleich zur herkömm...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

R.W. wurde von der National Natural Science Foundation of China (82002130) und der Beijing Natural Science Foundation of China (7222059) unterstützt. ZD.X. wurde vom CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026) unterstützt.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Anti-Human-CD28Biolegend302934-Antikörper
Anti-Human-CD49dBiolegend304339-Antikörper
APC Anti-Human-MIP-1αBD551533Fluoreszierender Antikörper 
Automatisierter ZellzählerBIO RADTC20Zellzahl
BD FACSymphonie A5BDA5Durchflusszytometrie
BUV395 Anti-Human-CD4BD563550Fluoreszierender Antikörper
BUV737 Anti-Human-CCR7BD741786Fluoreszierender Antikörper 
BUV737 Anti-Human-CD27BD612829Fluoreszierender Antikörper 
BV421 Anti-Human-CD8Biolegend344748Fluoreszierender Antikörper 
BV480 Anti-Human-CD45RABD566114Fluoreszierender Antikörper 
BV480 Anti-Human-CD45ROBD566143Fluoreszierender Antikörper 
BV605 Anti-Human-CD107aBiolegend328634Fluoreszierender Antikörper 
BV650 Anti-Human-CD3BD563999Fluoreszierender Antikörper 
BV785 Anti-Human-IL-2Biolegend500348Fluoreszierender Antikörper 
ZentrifugenröhrchenBD FalconBD-3520971515 mL Zentrifugenröhrchen
Cytofix/Cytoperm Fixierung/Permeabilisierung Solution KitBD554714Zellfixierung und Permeabilisierung
DichtegradientenmediumDakeweDKW-KLSH-0100Ficoll-Paque, humanes Lymphozytentrennmedium
FITC anti-human IFN-& gamma;Biolegend502506Fluoreszierender Antikörper 
Gibco Fötales KälberserumThermo Fisher Scientific16000-044Fötales Kälberserum
Gibco RPMI-1640 MediumThermo Fisher Scientific22400089Zellkulturmedium
Hochgeschwindigkeits  ZentrifugeSigma  3K15Küvettenzentrifugation für 15 mL Zentrifugenröhrchen
Hochgeschwindigkeits  ZentrifugeEppendorf5424RZellzentrifugation für 1,5 mL Eppendorf (EP) Röhrchen
MikrozentrifugenröhrchenAxygenMCT-150-C1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen
PE anti-human TNF-αBiolegend502909Fluoreszierender Antikörper
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)BI02-024-1ACSPBS
Proteintransportinhibitor (enthält Brefeldin A, GolgiPlug)BD555029blockiert intrazelluläre Proteintransportprozesse
Proteintransportinhibitor (enthält Monensin)BD554724blockiert intrazelluläre Proteintransportprozesse
Reagenzglas mit rundem BodenBD Falcon3522355 mL Reagenzglas
Trypanblau-Färbe-Zellviabilitäts-Assay-KitBeyotimeC0011
ViabilitätsfarbstoffBiolegend423106Totzellfärbung
Trypanblau-Färbe-Zombie-NIR-Fixierbarer

Referenzen

  1. Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317(2022).
  2. Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562(2022).
  3. Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
  4. Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476(2020).
  5. Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
  6. Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888(2022).
  7. Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329(2017).
  8. Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72(2021).
  9. Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275(2013).
  10. Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
  11. Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
  12. Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
  13. Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36(2021).
  14. Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
  15. Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
  16. Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212(2022).
  17. Shin, H., Iwasaki, A. Tissue-resident memory T cells. Immunological Reviews. 255 (1), 165-181 (2013).
  18. Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
  19. Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
  20. Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431(2019).
  21. Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443(2020).
  22. Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126(2020).
  23. Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416(2018).
  24. Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
  25. Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Schlagwörter

T Zell Immunit tintrazellul re Zytokinf rbungperiphere mononukle re BlutzellenCD4 positive T ZellenCD8 positive T ZellenDegranulationsmarkerimmunologisches Ged chtnis
Nachweis polyfunktioneller T-Zellen bei Kindern, die mit Impfstoff gegen Japanische Enzephalitis geimpft wurden, mittels Durchflusszytometrie
Kontakt
Rückmeldung an Ihre Bibliothek

Datenschutz

Nutzungsbedingungen

Richtlinien

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Alle Rechte vorbehalten.