Modellierung des oral-ösophagealen Plattenepithelkarzinoms in 3D-Organoiden

Samuel Flashner; Cecilia Martin; Norihiro Matsuura; Masataka Shimonosono; Yasuto Tomita; Masaki Morimoto; Ogoegbunam Okolo; Victoria X. Yu; Anuraag S. Parikh; Andres J. P. Klein-Szanto; Kelley Yan; Joel T. Gabre; Chao Lu; Fatemeh Momen-Heravi; Anil K. Rustgi; Hiroshi Nakagawa

doi:10.3791/64676

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Methodenartikel

Modellierung des oral-ösophagealen Plattenepithelkarzinoms in 3D-Organoiden

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DOI:

10.3791/64676

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23. Dezember 2022

Samuel Flashner^*¹ , Cecilia Martin^*¹^,² , Norihiro Matsuura¹ , Masataka Shimonosono¹ , Yasuto Tomita¹ , Masaki Morimoto¹ , Ogoegbunam Okolo¹ , Victoria X. Yu¹^,³ , Anuraag S. Parikh¹^,³ , Andres J. P. Klein-Szanto⁴ , Kelley Yan¹^,² , Joel T. Gabre¹^,⁵ , Chao Lu¹^,⁶ , Fatemeh Momen-Heravi¹^,⁷ , Anil K. Rustgi¹^,⁵ , Hiroshi Nakagawa¹^,²^,⁵

¹Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, ²Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, ³Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, ⁴Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, ⁵Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, ⁶Department of Genetics and Development, Columbia University, ⁷Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Erzeugung und Charakterisierung von murinen oral-ösophagealen 3D-Organoiden, die normale, präneoplastische und Plattenepithelkarzinomläsionen darstellen, die durch chemische Karzinogenese induziert werden.

Zusammenfassung

Das Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre (ESCC) ist weltweit weit verbreitet und macht jedes Jahr 90 % aller Fälle von Speiseröhrenkrebs aus und ist das tödlichste aller menschlichen Plattenepithelkarzinome. Trotz jüngster Fortschritte bei der Definition der molekularen Veränderungen, die mit der Initiierung und Entwicklung von ESCC einhergehen, bleibt die Prognose der Patienten schlecht. Die funktionelle Annotation dieser molekularen Veränderungen ist der notwendige nächste Schritt und erfordert Modelle, die sowohl die molekularen Eigenschaften von ESCC erfassen als auch leicht und kostengünstig für die funktionelle Annotation manipuliert werden können. Mäuse, die mit dem Tabakrauchmimetikum 4-Nitrochinolin-1-oxid (4NQO) behandelt wurden, bilden vorhersagbar ESCC und ösophageale Präneoplasien. Bemerkenswert ist, dass 4NQO-Läsionen auch in der Mundhöhle auftreten, am häufigsten in der Zunge, sowie im Vormagen, die alle das geschichtete Plattenepithel teilen. Diese Mäuse können jedoch nicht einfach für funktionale Hypothesentests manipuliert werden, da die Erstellung isogener Mausmodelle zeit- und ressourcenintensiv ist. In dieser Arbeit überwinden wir diese Einschränkung, indem wir aus Einzelzellen abgeleitete dreidimensionale (3D) Organoide von Mäusen erzeugen, die mit 4NQO behandelt wurden, um murine ESCC oder präneoplastische Zellen ex vivo zu charakterisieren. Diese Organoide erfassen die hervorstechenden Merkmale von ESCC und ösophagealer Präneoplasie, können kostengünstig und schnell zur Bildung isogener Modelle genutzt und für syngene Transplantationsexperimente verwendet werden. Wir zeigen, wie man 3D-Organoide aus normalem, präneoplastischem und SCC-murinem Ösophagusgewebe erzeugt und diese Organoide erhält und kryokonserviert. Die Anwendungen dieser vielseitigen Organoide sind breit gefächert und umfassen die Verwendung von gentechnisch veränderten Mäusen und die weitere Charakterisierung durch Durchflusszytometrie oder Immunhistochemie, die Erzeugung isogener Organoidlinien unter Verwendung von CRISPR-Technologien sowie das Wirkstoffscreening oder die syngene Transplantation. Wir glauben, dass die weit verbreitete Übernahme der in diesem Protokoll demonstrierten Techniken die Fortschritte in diesem Bereich beschleunigen wird, um die schwere Belastung durch ESCC zu bekämpfen.

Einleitung

Das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus (ESCC) ist aufgrund seiner späten Diagnose, Therapieresistenz und Metastasierung das tödlichste Plattenepithelkarzinom des Menschen ^1,2. ESCC entsteht aus dem geschichteten Plattenepithel, das die luminale Oberfläche der Speiseröhre auskleidet. Das Plattenepithel besteht aus proliferativen Basalzellen und differenzierten Zellen innerhalb der suprabasalen Zellschicht. Unter physiologischen Bedingungen exprimieren Basalzellen Marker wie p63, Sox2 und Zytokeratin K5 und K14, während differenzierte Zellen K4, K13 und IVL exprimieren. Basalzellen selbst sind heterogen und um....