Analyse und Bildgebung von Osteozyten

Zusammenfassung

In dieser Studie wird die Methode zur Visualisierung und Entwicklung dreidimensionaler (3D) Modelle von Osteozyten innerhalb des lakunar-kanalikulären Netzwerks (LCN) für die CFD-Analyse (Computational Fluid Dynamics) beschrieben. Die mit dieser Methode generierten Modelle helfen, die Mechanoempfindung von Osteozyten in gesunden oder kranken Knochen zu verstehen.

Zusammenfassung

Osteozyten sind die Knochenzellen, von denen angenommen wird, dass sie auf mechanische Dehnungen und Fluidströmungsscherstress (FFSS) reagieren, indem sie verschiedene biologische Signalwege in einem Prozess aktivieren, der als Mechanotransduktion bekannt ist. Konfokale bildabgeleitete Modelle von Osteozytennetzwerken sind ein wertvolles Werkzeug für die Durchführung von CFD-Analysen (Computational Fluid Dynamics) zur Bewertung von Scherspannungen auf der Osteozytenmembran, die nicht durch direkte Messung bestimmt werden können. Die computergestützte Modellierung unter Verwendung dieser hochauflösenden Bilder der mikrostrukturellen Architektur des Knochens wurde verwendet, um die auf den Knochen ausgeübte mechanische Belastung numerisch zu simulieren und die belastungsinduzierte Stimulation von Osteozyten zu verstehen.

In dieser Studie werden die Methoden zur Entwicklung von 3D-Einzelosteozytenmodellen unter Verwendung von konfokalen Mikroskopbildern des Lacunar-Canalicular Network (LCN) erläutert, um CFD-Analysen unter Verwendung verschiedener Computermodellierungssoftware durchzuführen. Vor der konfokalen Mikroskopie werden die Knochen der Maus geschnitten und mit Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-Farbstoff gefärbt, um die LCN zu markieren. Bei 100-facher Auflösung werden Z-Stapel-Bilder mit einem konfokalen Mikroskop aufgenommen und in die MIMICS-Software (3D-Bildbearbeitungssoftware) importiert, um ein Oberflächenmodell des LCN und der Osteozyten-dendritischen Prozesse zu erstellen.

Diese Oberflächen werden dann mit einer booleschen Operation in der 3-Matic-Software (3D-Datenoptimierungssoftware) subtrahiert, um den lakunaren fluidischen Raum um den Osteozytenzellkörper und den Kanalraum um die Dendriten mit lakunokanalikulärer Flüssigkeit zu modellieren. Die volumetrische 3D-Fluidgeometrie wird für die CFD-Analyse in die ANSYS-Software (Simulationssoftware) importiert. ANSYS CFX (CFD-Software) wird verwendet, um den Knochen physiologisch als Flüssigkeitsdruck zu belasten und die Wandschubspannungen auf die Osteozyten und dendritischen Prozesse zu bestimmen. Die Morphologie des LCN beeinflusst die Scherspannungswerte, die von der Osteozytenzellmembran und den Zellprozessen wahrgenommen werden. Daher können die Details, wie konfokale bildbasierte Modelle entwickelt werden, für das Verständnis der Osteozyten-Mechanoempfindung wertvoll sein und die Grundlage für zukünftige Studien in diesem Bereich bilden.

Einleitung

Es wird postuliert, dass Osteozyten die Knochenmasse als Reaktion auf körperliche Betätigung regulieren¹. Die Membrandeformation von Osteozyten und ihre dendritischen Fortsätze aufgrund mechanischer Belastung unterwirft sie einer FFSS, die von den Osteozyten detektiert wird und die intrazelluläre Signalübertragung auslöst ^2,3,4. Die Knochenmikrostruktur erfährt eine Verschlechterung oder Veränderung ihrer lakunar-kanalikulären Morphologie aufgrund von Alterung oder Knochenerkrankungen wie Osteoporose und Diabetes sowie bei Erkrankungen wie Perlikanmangel, der zu einer Beeinträchtigung der Mechano-Reaktionsfähigkeit der Osteozyten führt ^5,6. Diese Veränderungen in der Knochenarchitektur führen dazu, dass Osteozyten unterschiedliche FFSS- und Dehnungsniveaus aufweisen ^7,8. Wichtig ist, dass die FFSS, die Osteozyten als Reaktion auf mechanische Belastung erfahren, in vivo schwer zu quantifizieren ist, da sie in die verkalkte Knochenmatrix eingebettet sind.

Die konfokale bildbasierte Modellierung ist eine leistungsfähige Technik, um die Einschränkungen bei der Untersuchung unzugänglicher Osteozyten in ihrer natürlichen Umgebung durch die Replikation von Computermodellen des LCN^{zu überwinden 9,10}. Die Verarbeitung und Modellierung des miteinander verbundenen Netzwerks von LCN in 3D war eine Herausforderung. Es gibt verschiedene bildgebende Verfahren, wie z. B. die Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), die Rasterelektronenmikroskopie (REM), das serielle Blockflächenschneiden und die seriell fokussierte Ionenstrahl-Rasterelektronenmikroskopie (FIB/REM)^2,11,12. Es wurde eine wertvolle Technik entwickelt, um den Knochen 13,14,15 zu visualisieren und 3D-Osteozytenmodelle mittels konfokaler Laser-Scanning-Mikroskopie (CLSM) zu erzeugen. CLSM wurde hier für die Computermodellierung anstelle anderer bildgebender Verfahren gewählt, da es in der Lage ist, das gesamte Lückenvolumen und den größten Teil der Canaliculi in 3D abzubilden^16,17. Die LCN-Geometrie kann mit CLSM für die Osteozyten-Finite-Elemente-Analyse (FEA) generiert werden, um Knochendehnungen vorherzusagen. Die Flüssigkeitsanalyse zur Vorhersage der FFSS bei Osteozyten ist jedoch komplizierter, da sie die Modellierung der Zellmembran des Osteozyten und seiner Dendriten innerhalb des LCN erfordert, um die Modellierung des engen lakunar-kanalikulären Raums zu ermöglichen, in dem sich die interstitielle Flüssigkeit um¹⁸ bewegt.

In diesem Protokoll wird der Farbstoff Fluoresceinisothiocyanat (FITC) vor der konfokalen Mikroskopie auf nicht entkalkte dicke Knochenabschnitte aufgetragen, um das LCN im Knochen zu markieren, und Osteozyten-dendritische Membranen werden auf der Grundlage von Bildgebungsdaten des LCN modelliert. Der lakunar-kanalikuläre Raum wird mit Hilfe von Computermodellen simuliert, und die physiologische Belastung durch körperliche Aktivität wird mit einem CFD-Ansatz modelliert. Die Osteozyten werden in der CFD-Software einem Flüssigkeitsdruckgradienten ausgesetzt, um das Flüssigkeitsprofil im LCN zu analysieren und FFSS an den Osteozyten und dendritischen Membranen zu messen. Darüber hinaus kann ein FEA-Ansatz Osteozytendehnungen oder -spannungen durch Anwendung mechanischer Druckbelastung messen.

Es wurde auch eine Technik zur Modifikation der Geometrie entwickelt, um die Mikrostrukturen, die aus Bildern jungen, gesunden Knochens abgeleitet wurden, zu modifizieren, um die veränderte lakunarkanalikuläre Morphologie bei älteren Tieren oder solchen mit Knochenerkrankungen zu simulieren. Zu den Veränderungen der Knochenmikrostruktur gehörten die Verringerung der Anzahl der Canaliculi mit zunehmendem Alter, die Verkleinerung der lakunar-kanalikulären Raumfläche, um zu modellieren, was bei Perlikanmangel passiert, und deren Vergrößerung, um Alterungseffekte zu modellieren, und die Verkleinerung der kanalikulären und dendritischen Wandfläche, um den diabetischen Knochen^zu modellieren ^5,6. Die Technik der Geometriemodifikation ermöglicht es uns, FFSS von Osteozyten in Knochen mit unterschiedlichen Mikrostrukturen zu vergleichen, wie z. B. jung und alt oder Knochen bei gesunden und kranken Tieren.

Insgesamt ist die konfokale bildbasierte Modellierung ein wertvolles Werkzeug für die Simulation der Morphologie von Osteozyten in gesundem Knochen sowie für alters-/krankheitsbedingte Veränderungen in der Osteozytenmorphologie. Darüber hinaus können morphologische Parameter der Osteozyten, wie z.B. Oberfläche und Volumen des lakunar-kanalikulären Raums, in verschiedenen Knochen gemessen und verglichen werden, um zelluläre Reaktionen auf mechanische Belastung vorherzusagen.

Protokoll

Die Tierversuche wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee an der University of Missouri, Kansas City (UMKC) durchgeführt und entsprachen den einschlägigen Bundesrichtlinien.

1. Prozess der Knochenvorbereitung

1. Sammeln Sie Oberschenkelknochen von 4 Monate alten und 22 Monate alten weiblichen C57BL6-Mäusen und fixieren Sie sie 24 Stunden lang bei 4 °C kaltem Paraformaldehyd in PBS unter leichtem Schaukeln, spülen Sie sie dann in PBS ab und lagern Sie sie in 70 % Ethanol, bevor Sie sie einbetten.
   HINWEIS: Das Volumen des Fixiermittels sollte etwa das 20-fache des Gewebevolumens betragen
2. Betten Sie die Knochen schnell in ein schnell polymerisierendes Acryl (Materialtabelle) ein, indem Sie den Anweisungen des Herstellers folgen.
   HINWEIS: Es ist wichtig, für diesen Schritt (~10 min) ein schnell polymerisierendes Harz zu verwenden. Der Zweck besteht darin, das Knochengewebe während des Schneidens mit der Diamantsäge zu stützen, ohne dass das Harz in das LCN eindringt, was das Eindringen des FITC-Flecks blockieren würde.
3. Schneiden Sie mit einer Diamantsäge dicke 300 μm dicke Querscheiben von einer standardisierten Stelle über dem dritten Trochanter ab und lagern Sie sie bei 4 °C in 70 % Ethanol vor der FITC-Färbung.
4. Polieren Sie die Abschnitte mit Schleifpapier der Körnung 600, 800 und dann 1200 auf eine endgültige Dicke von ~90-100 μm.
   HINWEIS: Das Erreichen der richtigen Dicke wurde mit einem digitalen Messschieber sichergestellt.
5. Spülen Sie die Abschnitte jeweils 5 Minuten lang mit 70 %, 95 % und 100 % Ethanol.
6. In 1 % FITC in 100 % Ethanol 4 h bei Raumtemperatur (RT) im Dunkeln unter mäßigem Schütteln färben.
7. Waschen Sie die Abschnitte 30 Minuten lang in 100% Ethanol unter leichtem Schütteln im Dunkeln. Trocknen Sie sie dann über Nacht im Dunkeln an der Luft.
8. Legen Sie den Schnitt zum Montieren in einen Tropfen Einbettmedium auf einem Glasobjektträger. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Abschnitt so flach wie möglich gegen den Objektträger zu positionieren, um die Bildung von Luftblasen zu vermeiden und das umgebende Harz zur Manipulation der Probe zu verwenden. Montieren Sie ein Deckglas auf die Probe.

2. Konfokale Mikroskopie

1. Verwenden Sie ein konfokales Mikroskop für die Bildgebung von FITC-gefärbten Knochenscheiben.
2. Verwenden Sie ein 100x 1,44NA Ölobjektiv mit einem Digitalzoom von 1,7 und einer Schrittweite von 0,126 μm, um detaillierte Z-Stapel von 400 Z-Ebenen bei 1024 x 1024 Pixeln und 0,089 μm Pixelauflösung aufzunehmen.
3. Verwenden Sie einen 488-nm-Laser zur Anregung mit einem Emissionssammelfenster von 496-596 nm. Erfassen Sie die Bildstapel mithilfe von Kompensationseinstellungen, um Signalverluste mit zunehmender Bildtiefe zu korrigieren.
4. Erhöhen Sie die Genauigkeit und Auflösung der Bilder, indem Sie Bilderfassungstechniken wie Oversampling und erhöhte Zeilenmittelung verwenden. Erfassen Sie außerdem die Bilder mit einer 5-fachen, 20-fachen und 100-fachen Auflösung von Querschnitten von Oberschenkelabschnitten, wie in Abbildung 1 gezeigt.
   HINWEIS: Das Bild mit niedriger Auflösung (5x) in Abbildung 1 zeigt den vollständigen Querschnittsbereich des Femurs, wobei drei Bereiche für 100x Bildfelder ausgewählt wurden.
5. Verwenden Sie die 100x Z-Stacks für die Computermodellierung von Osteozyten.

3. Computermodellierung

1. Importieren Sie die gesammelten 100x-Bilder im TIFF-Format in die ImageJ-Software, um eine Sequenz von Bildern des LCN in Z-Richtung zu erstellen.
2. Importieren Sie die Z-Stapel in die bildbasierte 3D-Verarbeitungssoftware, um eine Maske des LCN zu erstellen, nachdem Sie die Bildausrichtung definiert haben.
3. Begrenzen Sie das Originalbild der jungen und betagten Mäuse zwischen 30.012 und 45.677 Hounsfield-Einheiten bzw. 15.000 bis 46.701 Hounsfield-Einheiten, um dem LCN sehr ähnlich zu sein. Passen Sie den Schwellenwert im Abschnittsmenü an, um die Grenzwerte für die Pixelintensität für die Aufnahme in eine Maske zu ändern.
4. Schneiden Sie eine Lücke mit ihren Canalicul als Region of Interest (ROI) aus dem Stapel ab, indem Sie den Vorgang "Maske zuschneiden" verwenden. Definieren Sie den ROI so, dass er die Lücke in der Mitte des Würfels umschließt und alle seine verbundenen Kanäle bis zu den Seiten des Würfels reichen. Umschließen Sie die Lücke mit einem imaginären größeren Würfel mit Seitenlängen von 21 μm, 14 μm und 19 μm.
5. Da das Modell aus mehreren Teilen erstellt wird, führen Sie einen Vorgang zum Vergrößern des Bereichs durch, um die verbundenen Pixelbereiche auszuwählen, Rauschen zu entfernen und Flecken zu entfernen, um eine einheitliche LCN zu erzeugen.
6. Wandeln Sie die lakunarkanalikuläre Maske in ein Objekt um, indem Sie den Vorgang "Berechnetes Teil" in der bildbasierten 3D-Verarbeitungssoftware verwenden.
7. Bauen Sie die Osteozyten- und dendritischen Membranen auf, indem Sie das LCN-Volumen mit der Glättungsoperation reduzieren. Dieser Vorgang ist mehrmals durchzuführen, um eine Dicke des lakunaren und kanalikulären Raums von 0,75 μm bzw. 0,08 μm zu erreichen ^9,18.
8. Exportieren Sie die Objekte (STL-Format) als letzten Schritt in der 3D-Bildbearbeitungssoftware.
9. Importieren Sie zwei Schichten der LCN- und Osteozyten-dendritischen Membranen in die 3D-Datenoptimierungssoftware, um ein Volumennetz zu erstellen.
10. Verwenden Sie das Tool Fix Wizard in der Software, um Netzprobleme in jedem Teil zu identifizieren. Überprüfen Sie die Netzqualität im Diagnosebereich des Fix Wizard nach jedem Vorgang.
11. Entfernen Sie die invertierten Normalteile, sich schneidenden Dreiecke und fehlerhaften Konturen mit dem Vorgang "Automatisch fixieren " im Fixier-Assistenten.
12. Ersetzen Sie die überlappenden Dreiecke manuell, indem Sie neue Dreiecke definieren, oder automatisch über den Vorgang Loch normal füllen .
13. Verbessern Sie die Netzqualität, indem Sie unter anderem scharfe Dreiecke, kleine Kanten und kleine Schalen filtern.
14. Nach Verbesserung der Netzqualität werden zwei Oberflächen der LCN- und Osteozyten-dendritischen Membranen mit einer nicht-mannigfaltigen Anordnung zu einer Oberfläche (lakunar-kanalikulärer Fluidikraum) kombiniert, die zu beiden Teilen gehört.
15. Erstellen Sie mit dem Vorgang "Neu vernetzen " ein volumetrisches Modell des lakunar-kanalikulären Raums, und exportieren Sie es dann als STL-Datei. Stellen Sie die Objektskala im Exportbereich auf Mikrometer ein.

4. Geometrieänderungstechnik in der 3D-bildbasierten Verarbeitungssoftware und der 3D-Datenoptimierungssoftware

HINWEIS: Die Technik der Geometriemodifikation wird verwendet, um Veränderungen in der Osteozytenmorphologie zu modellieren, wie z. B. die Kanaldichte und den Durchmesser sowie die lakunar-kanalikuläre Dicke aufgrund von Alterung oder Knochenerkrankungen.

1. Wählen Sie den jungen Osteozyten als Basismodell und modifizieren Sie ihn, um andere unterschiedliche Osteozytenmodelle durch Anwendung morphologischer Veränderungen zu erstellen.
2. Generieren Sie ein Osteozytenmodell mit unterschiedlichen kanalikulären Dichten aus dem Basismodell, indem Sie den Bildschwellenwert in der bildbasierten 3D-Verarbeitungssoftware ändern.
   1. Wählen Sie einen niedrigeren Schwellenwert, um die Lichtintensität des Bildes zu verringern und eine Lücke mit weniger Canaliculi zu erhalten. Der Vorteil der Schwellenwerttechnik besteht darin, dass die Form und Größe der Lücke gleich bleiben und nur der Einfluss der Kanaldichte untersucht wird. Abbildung 2 zeigt das simulierte Altersmodell, das aus den jungen Osteozyten unter Verwendung der Geometriemodifikationstechnik generiert wurde.
3. Entwickeln Sie Osteozytenmodelle mit unterschiedlichen lakunar-kanalikulären Raumdicken oder Dendriten-/Kanalikulärdurchmessern in der 3D-Bildverarbeitungssoftware und der 3D-Datenoptimierungssoftware. Erstellen Sie größere oder kleinere Osteozytenmodelle durch Wickeln bzw. Glätten . Abbildung 3 zeigt sechs Osteozytenmodelle mit veränderter Geometrie, die aus dem jungen Osteozyten entwickelt wurden.

5. CFD-Analyse

HINWEIS: Nach der Generierung der volumetrischen Osteozytenmodelle werden mehrere Schritte, einschließlich Geometrie, Netz und Einrichtung, im CFX-Modul der Simulationssoftware durchgeführt.

1. Erstellen Sie in der Simulationssoftware eine Fluidströmung, um die Modelle für die CFD-Analyse vorzubereiten.
2. Importieren Sie die entwickelten konfokalen bildbasierten Geometrien in die Geometriesektion von CFX, bekannt als ANSYS SpaceClaim (3D-Modellierungstool). Stellen Sie in der Einstellung die Einheitenabmessungen auf Nanometer ein.
3. Die Geometrie erscheint als zwei Facetten des LCN und des Osteozyten-dendritischen Prozesses. Klicken Sie im oberen Menü auf Facette und entfernen Sie die geometrischen Fehler wie Schnittpunkte, scharfe oder überverbundene Kanten sowie Eckpunkte, Öffnungen oder Löcher für jede Facette.
4. Klicken Sie im Menü Facette auf Subtrahieren, um die kleinere Facette und die Osteozyten-dendritischen Prozesse von der größeren Facette, dem LCN, zu reduzieren und so einen einzigen Körper mit lakunar-kanalikulärem Raum zu erhalten. Klicken Sie dann mit der rechten Maustaste auf die generierte Facette und konvertieren Sie sie von Facetten in eine feste Domäne, ohne Flächen zusammenzuführen. Abbildung 4 zeigt die Querschnittsfläche des jungen Osteozytenmodells, die den lakunar-kanalikulären Raum darstellt.
5. Klicken Sie auf Netz und wählen Sie lineare tetraedrische Elemente mit einer Elementgröße von 0,06 μm aus. Verfeinern Sie das Netz mit einer Netzkonvergenzstudie, um genügend Elemente im winzigen dendritischen System zu haben, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse unabhängig von der Maschenweite sind.
6. Wählen Sie die Oberfläche aus und wählen Sie die Canaliculi auf der Oberseite des imaginären Würfels als flüssige Einlässe. Wählen Sie die Kanülen auf den anderen fünf Flächen als Flüssigkeitsauslässe mit Box Select aus.
7. Exportieren Sie das Mesh (fließendes Dateiformat), da es im nächsten Schritt im Setup schneller geladen wird.
8. Erstellen Sie eine weitere Fluidströmung in der Simulationssoftware und importieren Sie das fließende Netz in den Setup-Bereich von CFX. Definieren Sie zwei Randbedingungen für Ein- und Auslässe für die Flächen, die mit der Option Berandung einfügen als Ein-/Auslässe vorausgewählt sind.
9. Um physiologische Bedingungen nachzuahmen, üben Sie einen Flüssigkeitseinlassdruck von 300 Pa bzw. 0 Pa auf die Ein- und Auslässe aus,^19,20. Behandeln Sie die verbleibenden Flächen als Wände mit einer rutschfesten Bedingung in der Flüssigkeit, die an der Schnittstelle der Wände eine Geschwindigkeit von Null hat. Flüssigkeit fließt aus den Einlässen um die Dendriten und den Osteozytenzellkörper und tritt aus den anderen als Auslässe zugewiesenen Kanälen aus.
10. Behandeln Sie die interstitielle laminare Flüssigkeit als Wasser⁹, ausgewählt aus der Materialbibliothek. Legen Sie die Abschnitte Wärmeübertragung, Verbrennung und Wärmestrahlung auf Keine fest, da in der Aufgabe keine Wärmeübertragung definiert ist. Wählen Sie den Turbulenzmodus als Fluidkennlinie im LCN, bei dem es sich um eine laminare Flüssigkeit⁹ handelt.
11. Führen Sie die Software mit "Doppelte Genauigkeit " und "Direktstart " als Übermittlungstyp aus. Überwachen Sie Masse und Impuls, bis die Residuen sinken und konstant werden. Messen Sie nach der Lösungskonvergenz FFSS-Daten mit dem CFD-post-Bereich der CFD-Software.

6. CFD-Nachbearbeitung

1. Um die FFSS der Osteozyten und ihrer Dendriten darzustellen, fügen Sie eine neue Kontur in den Ergebnisbereich der CFD-Software ein. Erstellen Sie eine FFSS-Kontur, indem Sie die Wandscherung auf den Osteozyten-dendritischen Membranen als Variable an der Domäne auswählen.
   HINWEIS: Um einen hohen FFSS-Wert auf dendritischen Membranen besser darzustellen, wird der FFSS-Bereich auf Benutzerspezifisch gesetzt, um die Min-/Max-Werte von FFSS zu ändern.
2. Fügen Sie eine Kontur der Geschwindigkeitsstromlinien innerhalb des lakunar-kanalikulären Bereichs ein, beginnend mit den Einlässen. Stellen Sie die Abtastung auf gleichmäßige Abstände ein, und wählen Sie die Anzahl der Punkte als 2500 aus. Ein Animationsabschnitt in der CFD-Software zeigt anhand des Geschwindigkeitsstromliniendiagramms genau in 3D, wie die Fluidpartikel in den lakunar-kanalikulären Räumen fließen.
3. Verwenden Sie das Funktionsrechner-Tool in der CFD-Software, um die Größe des FFSS oder die Geschwindigkeit basierend auf geometrischen Parametern zu analysieren, insbesondere wenn es verschiedene Osteozytenmodelle gibt (d. h. jung vs. alt). Messen Sie das Volumen und die Oberfläche des lakunar-kanalikulären Raums als geometrische Parameter zusammen mit maximalen, minimalen oder durchschnittlichen FFSS-Werten.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt, wie konfokale Osteozytenmodelle entwickelt werden können, um die Menge an Fluidströmungsscherspannungen zu untersuchen, denen ein Osteozyten und seine dendritischen Prozesse aufgrund mechanischer Belastung ausgesetzt sind. Eine gealterte und eine junge C57BL6-Maus wurden ausgewählt, um konfokale bildbasierte Osteozytenmodelle für junge und ältere Menschen zu erstellen. Sechs weitere simulierte Osteozytenmodelle wurden aus demselben jungen Osteozytenmodell unter Verwendung der Geometriemodifikationstechnik generiert, um die Veränderung der LCN-Morphologie aufgrund von Alterung oder Knochenerkrankungen zu untersuchen. Zu den geometriemodifizierten Parametern gehörten die lakunar-kanalikuläre Dicke, die Kanadierdichte und der Durchmesser. Modifizierte Osteozytenmodelle wurden entwickelt, indem jeweils ein Parameter geändert wurde, während die anderen Parameter gleich blieben. Daher wird der Einfluss jedes einzelnen morphologischen Parameters auf die FFSS isoliert untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass die Menge an FFSS, die ein Osteozyten erfuhr, in diesen Osteozytenmodellen unterschiedlich war, was die Abhängigkeit von FFSS von der LCN-Morphologie zeigt. FFSS-Werte wurden an verschiedenen Teilen des Osteozytenmodells vorhergesagt, wie z.B. am Osteozytenzellkörper oder an dendritischen Membranen. Dendriten wiesen in allen Modellen höhere FFSS-Werte auf als die Körpermembran der Osteozytenzelle.

Abbildung 5 zeigt die FFSS-Konturen für junge vs. gealterte Osteozytenmodelle, die direkt aus konfokalen FITC-Bildstapeln generiert wurden, und sechs weitere Osteozytenmodelle, die aus Modell 1 unter Verwendung der Geometriemodifikationstechnik entwickelt wurden. Die durchschnittliche FFSS auf Osteozyten und dendritischen Membranen im jungen Osteozytenmodell (Modell 1) betrug 0,42 Pa, was signifikanter ist als die durchschnittliche FFSS von 0,13 Pa im gealterten Osteozytenmodell (Modell 2). Die erhaltenen Daten zeigen einen Anstieg der durchschnittlichen FFSS bei Osteozyten mit größerem lakunar-kanalikulären Raum (Modell 7 und Modell 8) und eine Abnahme der FFSS bei Osteozyten mit geringerer Kanaldichte (Modell 3 und Modell 4), während sich die FFSS mit der Änderung des Dendritendurchmessers in Modell 5 und Modell 6 nicht signifikant veränderte. Modell 2 und Modell 4 hatten die niedrigsten FFSS-Werte von 0,19 Pa bzw. 0,13 Pa. Die Größe des FFSS in Modell 8 ist größer als in den anderen Osteozytenmodellen. Nicht nur, dass die meisten Dendriten in Modell 8 rot gefärbt sind, sondern der Osteozytenzellkörper erfährt auch eine höhere FFSS als in anderen Modellen.

Die FFSS, die bei Osteozyten erlebt wurde, wurde ebenfalls auf der Grundlage des lakunar-kanalikulären Raumvolumens und der Oberfläche vorgestellt, die durch Nachbearbeitung in ANSYS CFX gewonnen wurden, um die Korrelation zwischen FFSS und der veränderten Struktur des LCN herauszufinden. Es war auch möglich, die Oberfläche jedes Modells zu messen, die einem FFSS-Wert von mehr als 0,8 Pa ausgesetzt war, was als das FFSS-Niveau angesehen wird, das die Knochenbildung verursacht^21,22. Die Osteozytenmodellierung zeigte für alle Osteozytenmodelle eine Korrelation zwischen dem durchschnittlichen FFSS und dem lakunarkanalikulären Raumvolumen bzw. der Oberfläche, wie in Tabelle 1 gezeigt. Der gealterte Osteozyten (Modell 2) und der simulierte Osteozyten mittleren Alters (Modell 4) mit der geringsten kanalikulären Dichte hatten die geringste lakunarkanalikuläre Oberfläche von 1372,7 μm² und 1122,6 μm². Modell 2 und Modell 4 wiesen auch das geringste lakunar-kanalikuläre Raumvolumen von 229,4 μm³ bzw. 203,5 μm³ auf, was mit ihren geringen FFSS-Mengen korreliert werden kann. Modell 6 mit dem größten Dendritendurchmesser hatte die größte lakunar-kanalikuläre Oberfläche. Modell 8 hatte das größte lakunar-kanalikuläre Raumvolumen und die größten FFSS-Werte.

Abbildung 1: Konfokale Einzelbilder einer Z-Ebene eines Querschnitts eines FITC-gefärbten Femurs, aufgenommen mit 5x-, 20x- und 100x-Ölobjektiven. Das lakunar-kanalikuläre Netzwerk ist auf dem Bild sichtbar, das mit dem 100x-Objektiv aufgenommen wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Konfokale bildbasierte Modelle eines jungen (Modell 1) und eines gealterten (Modell 2) Osteozyten, die aus dem FITC-gefärbten Femur einer 4 Monate alten und 22 Monate alten C57BL6-Maus erzeugt wurden. Das vergrößerte Bild zeigt die lakunar-kanalikuläre (LC) Dicke für junge Osteozyten und die gleiche für ältere Osteozyten. Das Bild von Modell 1 wurde mit Genehmigung von Niroobakhsh et ^al.23 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Sechs Osteozytenmodelle, die aus Modell 1 unter Verwendung der Geometriemodifikationstechnik entwickelt wurden. Die kanalikuläre Dichte wurde reduziert, um Modell 3 (simuliertes Alter mittleren Alters) und Modell 4 (simuliertes Alter) zu erzeugen, während der Dendritendurchmesser und die LC-Dicke die gleichen waren wie in Modell 1. Modell 5 und Modell 6 wurden mit der gleichen Kanaldichte und LC-Dicke wie Modell 1 entwickelt, wobei ihr Dendritendurchmesser zwei- und viermal größer war als bei Modell 1. Modell 7 und Modell 8 wiesen eine zwei- bzw. viermal höhere lakunarkanalikuläre Dicke auf, während die Kanaldichte und der Dendritendurchmesser gleich blieben wie in Modell 1. Das Bild von Modell 1 wurde mit Genehmigung von Niroobakhsh et ^al.23 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Konfokales bildbasiertes Jungosteozytenmodell in der 3D-Ansicht. 3D-Ansicht der Querschnittsfläche des konfokalen bildbasierten jungen Osteozytenmodells, das die Modellierung des lakunar-kanalikulären Raums darstellt, der für die Flüssigkeitsanalyse um die Osteozyten und Dendriten verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Die FFSS-Verteilung für alle Osteozytenmodelle zeigt die Abhängigkeit der FFSS-Größe von der Osteozytenmorphologie. Rote Regionen zeigen die höchsten FFSS-Werte, insbesondere auf den dendritischen Membranen und nicht auf dem Osteozyten-Zellkörper. Dieses Bild wurde mit Genehmigung von Niroobakhsh et ^al.23 geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

	Modelle	Lakunar-kanalikuläre Oberfläche (μm2)	Lakunar-kanalikuläres Raumvolumen (μm3)	Ave FFSS (Pa)
Konfokale bildbasierte Osteozytenmodelle	Modell 1	2652.9	261	0.42
	Jung (4 Monate alt)
	Modell 2	1372.7	229.4	0.19
	Alter (22 Monate alt)
Simulierte Osteozytenmodelle, die mit Hilfe der Geometriemodifikationstechnik erstellt wurden	Modell 3	1530.4	242.6	0.27
	(Simuliert mittleren Alters)
	Modell 4	1122.6	203.5	0.13
	(Simuliertes Alter)
	Modell 5	3724.9	302.9	0.49
	(2 x Dendriten Durchmesser)
	Modell 6	4791	337	0.57
	(4 x Dendriten Durchmesser)
	Modell 7	3116.3	440.6	1.17
	(2 x LC-Dicke)
	Modell 8	3542.2	658.2	1.89
	(4 x LC Dicke)

Tabelle 1: Vergleich von Osteozytenmodellen. Vergleich des durchschnittlichen FFSS, des lakunar-kanalikulären Raumvolumens und der Oberfläche in acht verschiedenen Osteozytenmodellen, einschließlich zwei konfokaler bildbasierter Modelle und sechs simulierter Modelle, die aus Modell 1 unter Verwendung der Geometriemodifikationstechnik generiert wurden.

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt ein konfokales Bildgebungsverfahren zur Visualisierung und computergestützten Modellierung der Osteozyten. Vor der konfokalen Bildgebung wird der Knochenvorbereitungsprozess für das Schneiden und Färben von Knochenproben durchgeführt. Konfokale Bilder mit 100-facher Vergrößerung werden in verschiedene Software importiert, um Computermodelle von Osteozyten und dem lakunar-kanalikulären Raum zu entwickeln. Abschließend wird eine CFD-Analyse an den konfokalen bildbasierten Modellen durchgeführt, um FFSS zu modellieren, die die Osteozyten und dendritischen Membranen aufgrund körperlicher Aktivität umgeben, was in vivo aufgrund der Unzugänglichkeit von Osteozyten in der Knochenmatrix eine technische Herausforderung darstellt. Das bereitgestellte Protokoll ist auch hilfreich bei der Bestimmung anderer Spannungen oder Dehnungen unter Verwendung eines Finite-Elemente- oder Fluid-Struktur-Wechselwirkungs-Ansatzes (FSI) in der multiphysikalischen Modellierung.

Zur Visualisierung des LCN 7,9,24,25 wurde die konfokale Bildgebung verwendet, da mit der FITC-Färbung des Knochens hochauflösende Bilder erzielt werden können. Obwohl der Durchmesser der Canaliculi nahe an der Auflösungsgrenze des Mikroskops liegt, können zuverlässige konfokale Bilder der Canaliculi erhalten werden, die den größten Teil der Canaliculi erfassen können. Aufgrund des kleineren Durchmessers der Osteozyten-Dendriten ist es technisch schwieriger, Bilder der Dendriten genau aufzunehmen. Daher wurde eine hilfreiche Technik entwickelt, um die Osteozyten und Dendriten aus konfokalen Bildern des LCN zu modellieren, indem ihr Volumen durch eine Glättungsoperation in der Software reduziert wurde. Einige andere veröffentlichte Studien verwendeten einen ähnlichen Ansatz, um das LCN auszugleichen, um die Osteozyten-dendritische Membran^{zu erzeugen 9}. Der andere Vorteil der Glättungstechnik besteht darin, dass einige Abbildungsfehler in CLSM verbessert werden, wie z. B. die Verlängerung des Kanalikulardurchmessers, die in der Z-Achse aufgrund der geringeren Abbildungsauflösung in der Z-Achse auftritt, was ein Merkmal der optischen Bildgebung ist. Die Entfaltung wird auch als alternative Methode zur Verringerung der optischen Dehnung in Z-Richtung angesehen, da sie das Signal-Rausch-Verhältnis im Originaldatensatz verbessert. Der lakunar-kanalikuläre Raum wird aus LCN und Osteozyten-dendritischen Membranen modelliert, um das Fluidprofil im LCN zu analysieren.

Insbesondere wurde eine neue Technik im Vergleich zu bestehenden Methoden eingeführt, um geometriemodifizierte Osteozytenmodelle zu entwickeln, ohne eine weitere Maus zu opfern. Die Technik der Geometriemodifikation hilft auch, die Veränderung der Knochenmikrostruktur aufgrund von Alterung oder Knochenkrankheiten wie Osteoporose, Diabetes und Erkrankungen wie Perlikanmangel usw. zu simulieren. Bei dieser Technik wurde ein konfokales bildbasiertes Osteozytenmodell einer jungen Maus verwendet, um die Morphologie von gealterten oder anderen knochenkranken Osteozyten zu modellieren, indem Parameter wie Kanaldichte, lakunar-kanalikulärer Raum und Dendritendurchmesser modifiziert wurden. Dieser Ansatz wurde durch die Ähnlichkeit der beiden gealterten Osteozytenmodelle validiert, eines aus der konfokalen bildbasierten Modellierung eines tatsächlichen Osteozyten einer 22 Monate alten Maus und das andere aus der Modellierung der Geometriemodifikation eines Osteozyten, der ursprünglich von einer 4 Monate alten Maus abgebildet wurde, indem seine kanalikuläre Dichte reduziert wurde. Diese beiden gealterten Osteozytenmodelle zeigten eine ähnliche FFSS-Größe, was die niedrigste unter allen Osteozytenmodellen war. Die Technik der Geometriemodifikation könnte viele Anwendungen in verschiedenen biologischen Bereichen haben, da sie vergleichbare Ergebnisse mit Osteozytenmodellen vorhersagen kann, die mit echten Osteozyten eines Tieres erstellt wurden. Zu den Einschränkungen dieser Arbeit gehören der Verlust einiger Details der Oberflächenrauheit aufgrund der Glättungstechnik und die Tatsache, dass die Kanaldurchmesser an der Auflösungsgrenze der konfokalen Mikroskope liegen, was möglicherweise zu einer gewissen Ungenauigkeit bei Canaliculi mit kleineren Durchmessern führen könnte, sowie die Idealisierung der Flüssigkeitsströmung anstelle der Modellierung mit oszillatorischer Strömung.

Um die Funktionalität der Technik zu demonstrieren, wurden die FFSS-Werte der Osteozyten für verschiedene Osteozytenmodelle gemessen, die von einer jungen und einer alten Maus oder mit der Technik der Geometriemodifikation erzeugt wurden. Eine der bemerkenswerten Erkenntnisse mit diesen Computermodellen war, dass das Volumen des lakunar-kanalikulären Raums direkt proportional zur durchschnittlichen FFSS ist, die die Osteozyten erfahren. Diese neue Erkenntnis, die bisher nicht untersucht wurde, könnte verschiedene Anwendungen bei der Bestimmung der Mechano-Reaktionsfähigkeit der Osteozyten haben, da sie die Morphologie des Osteozytennetzwerks mit dem von den Osteozyten und ihren Prozessen nachgewiesenen FFSS korrelieren kann.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1.200 Körnung Schleifpapier	Buehler	30-5170-012-100
3-Matic Software	Materialise	3D-Datenoptimierungssoftware
600 Körnung	Bühler	30-5118-600-100
800 Körnung Schleifpapier	Buehler	30-5170-800-100
ANSYS Software	ANSYS	https://www.ansys.com/	Simulationssoftware
Fluorescein Isothiocyanate (FITC)	Sigma-Aldrich	F7250
ImageJ Software		https://imagej.net/ij/
Immersionsöl für Mikroskope	Leica Microsystems	195371-10-9
Leica TCS Sp5 II Konfokalmikroskop	Leica Microsystems	TCS Sp5 II
Leitz 1600 Innenloch-Diamantsäge	Leica
MIMICS Innovation Suite-Software	Materialise	https://www.materialise.com/en/healthcare/mimics-innovation-suite	bildbasierte 3D-Verarbeitungssoftware
Permount Montierungsmedium Fisher	scientific	SP15-500
Sampl-Kwick Fast Cure Acrylic Kit	Buehler	20-3560
Single Platform Laboratory Shaker	Zuverlässiger wissenschaftlicher INC	Modell 55S