Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

In vivo Genlevering til musebrystepitelceller gennem brystintraduktal injektion

Published: February 10, 2023 doi: 10.3791/64718
Automatic Translation
1,2, 1,3
1Lester & Sue Smith Breast Center, Baylor College of Medicine, 2Department of Medicine, Baylor College of Medicine, 3Department of Molecular & Cellular Biology, Baylor College of Medicine, Houston, TX 77030

Summary

Denne protokol beskriver intraduktal injektion af virale vektorer via sutten for at levere gener af interesse i brystepitelcellerne.

Abstract

Musens brystkirtler omfatter duktale træer, som er foret med epitelceller og har en åbning på spidsen af hver brystvorte. Epitelcellerne spiller en vigtig rolle i brystkirtelfunktionen og er oprindelsen til de fleste brysttumorer. Introduktion af gener af interesse i musebrystepitelceller er et kritisk skridt i evalueringen af genfunktionen i epitelceller og generering af musebrysttumormodeller. Dette mål kan opnås gennem intraduktal injektion af en viral vektor, der bærer generne af interesse i musens brystkanaltræ. Den injicerede virus inficerer efterfølgende brystepitelceller, hvilket bringer generne af interesse ind. Den virale vektor kan være lentiviral, retroviral, adenoviral eller adenovirusassocieret viral (AAV). Denne undersøgelse viser, hvordan et gen af interesse leveres til brystepitelceller gennem musebryst intraduktal injektion af en viral vektor. Et lentivirus, der bærer GFP , bruges til at vise stabil ekspression af et leveret gen, og et retrovirus, der bærer Erbb2 (HER2 / Neu), bruges til at demonstrere onkogeninducerede atypiske hyperplastiske læsioner og brysttumorer.

Introduction

Epitelceller i brystkirtler spiller en vigtig rolle i funktionen af disse kirtler og er den vigtigste celle af oprindelse af brystkræft. Undersøgelser af brystkirtelbiologi og tumorigenese ofte har brug for levering af gen (r) af interesse i disse celler. Hver mus brystkirtel består af et duktalt træ foret med epitelceller med en enkelt åbning på spidsen af brystvorten. Denne struktur gør brystepitelcellerne let tilgængelige for virale vektorer, som kan leveres ind i lumen i et duktalt træ via intraduktal injektion1.

Teknikken til brystintraduktal injektion blev oprindeligt brugt til meget større dyr som geder, kaniner og rotter1. For et meget mindre dyr som mus har intraduktal injektion brug for mange sarte værktøjer og mere praksis hos operatørerne. Der er to tilgange til intraduktal injektion med mus. Den ene er up-the-patteinjektion1. En anden er den direkte injektion af den primære kanal af # 3 eller # 4 brystkirtel efter kirurgisk eksponering1. Da den første er ikke-invasiv og hurtigere, når operatøren er veluddannet, er denne teknik mere almindeligt anvendt og vil blive beskrevet detaljeret i denne artikel.

Sammenlignet med de udbredte traditionelle transgene musemodeller, hvor genet af interesse introduceres på stadiet af befrugtede æg gennem mikroinjektion 2,3,4, har genlevering gennem den intraduktale virusinjektionsmetode mange fordele, herunder: (1) det undgår den tidskrævende proces med at lave en transgen muselinje for hvert gen af interesse; (2) det undgår potentiel forringelse af den normale udvikling af brystkirtler pålagt af genet af interesse; (3) det introducerer genet af interesse på et hvilket som helst ønsket tidspunkt efter fødslen; (4) det kan let samintroducere mere end et gen af interesse; (5) det efterligner bedre den naturlige tumorigene proces, fordi de inficerede og dermed onkogenbærende celler er omgivet af normale celler; og (6) i kombination med TVA-teknologien (tumorvirus A, et fuglecelleoverfladeprotein og receptoren for retrovirus RCAS-vektor)5 kan genet af interesse indføres i en specifik cellepopulation for at undersøge tumorigenesens celleoprindelse og udføre celleafstamningssporingsassays i brystkirtlerne 6,7,8, 9.

Alle vektorer afledt af retrovirus10, lentivirus 11,12, adenovirus13 og adenovirusassocieret virus (AAV)14 kan anvendes til intraduktal levering af genetisk materiale. Retrovirus- og lentivirusvektorer integreres permanent i værtsgenomet; Således introducerer de gener af interesse stabilt i brystepitelceller. Mens lentivirus kan integreres i genomet i enhver celle, den møder15, har den effektive genomiske integration af retrovirus brug for spredning af målcellerne16. De adenovirale og AAV-vektorer integreres ikke i genomet af inficerede celler og udtrykker derfor kun forbigående genetaf interesse 17,18. Denne funktion kan være en fordel, når genet af interesse kun skal udtrykkes i kort tid, såsom Cre, for at slette et floxed tumorsuppressorgen.

Lentivirus, adenovirus og AAV inficerer alle museceller, de støder på. Men da luminalepitel stort set er isoleret fra det underliggende basale lag, som yderligere adskilles fra stroma af kældermembranen, begrænser intraduktal injektion infektionen stort set til luminale epitelceller, den primære oprindelsescelle for brystkræft. Inden for dette luminale epitellag er der også forskellige celleundertyper, herunder stamceller, stamceller og flere grupper af differentierede celler. For at inficere specifikke celleundergrupper inden for luminalcellepopulationen kan TVA-teknologien anvendes, hvormed fugleleukosevirusafledte RCAS-vektorer5,10 eller pseudotypede lentivirale vektorer11 selektivt inficerer de celler, der udtrykker TVA, i mus, der bærer et TVA-transgen under kontrol af en celletypespecifik promotor, såsom en promotor, der kun er aktiv i stamceller 6 eller visse forfædre6 7 eller alveolære celler8 eller Wnt-pathway aktive celler9.

Denne protokol præsenterer teknikken til at indføre gener af interesse i brystepitelceller gennem intraduktal injektion af en viral vektor. Påvisning af ekspression af de indførte gener og de resulterende hyperplastiske læsioner og tumorer demonstreres derefter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle forsøg med mus blev udført i overensstemmelse med den Institutionelle Animal Care and Use Committee-godkendte dyreprotokol. Til denne undersøgelse blev 9-12 uger gamle FVB/N- eller MMTV-tva-hunmus anvendt. Musene blev anskaffet kommercielt eller selvfremstillet (se materialetabel). Lenti-EGFP (FUCGW) og RCAS-Erbb2 (Neu) vira blev anvendt. Viruspræparation og titerbestemmelse blev udført efter de tidligere offentliggjorte rapporter10,12.

1. Klargøring af sprøjte

  1. Skær navnålene af 33 G metal (se materialetabellen) til ca. 1 cm lange. Opbevar kanylerne og 50 μL sprøjten i 70% alkohol efter autoklavering.
  2. Tag sprøjter og nåle ud af alkoholen. Driv den resterende alkohol ud af sprøjten og kanylen. Demonter sprøjten til lufttørring på en autoklaveret absorberende bænkpude.
  3. Saml sprøjten efter tørring.

2. Virus forberedelse

  1. Tag et eller flere virale stamrør ud efter behov fra -80 °C fryseren, og tø virussen op på is.
    BEMÆRK: Afhængigt af antallet af celler, der skal inficeres, skal virussen muligvis fortyndes til tilsigtede titere ved hjælp af 1x PBS på dette tidspunkt.
  2. Tilsæt bromphenolblåt ved at dyppe pipettespidsen i en dybde på 1 cm i bromphenolblåt pulver (se materialetabel). Derefter bringes den vedhæftede spormængde af bromphenolblåt ind i virussuspensionen.
    BEMÆRK: For denne undersøgelse er virusstammen normalt 200 μL pr. Rør, så den endelige farvestofkoncentration er ca. 0,2% (0,2 μg / 100 μL). Bromophenolblåt skal steriliseres med mikrobølgestråling i 45 sekunder ved høj effekt på 1250 W (se materialetabel). Sørg for at udføre hele proceduren i et sterilt miljø.
  3. Bland bromphenolblåt med virusopløsningen ved pipettering op og ned 10 gange.
  4. Placer virussen på is og bring isspanden til vivarium.

3. Tilberedning af dyr

  1. Bedøv en hunmus ved intraperitoneal injektion af 2 μL / g bedøvelsesmiddel (37,6 mg / ml ketamin, 1,92 mg / ml xylazin og 0,38 mg / ml acepromazin, se materialetabel). Kontroller dybden af anæstesi med en tåklemme. Påfør salve på øjnene for at forhindre tørhed under anæstesi.
    BEMÆRK: Musen må ikke reagere på tåklemme under god bedøvelse. Isofluran kan også anvendes til bedøvelse af musene.
  2. Sæt musen i liggende stilling på en varm pude og fastgør alle fire lemmer til bænken ved hjælp af tape.
  3. Identificer en brystvorte (eller flere), der skal injiceres (nummer 4 foretrækkes i denne undersøgelse). Udsæt det ved at trimme det omgivende hår ved hjælp af en saks.
  4. Påfør 70% alkohol og iodophor vatpinde på brystvorten i tre runder for at rense og udsætte brystvorten.

4. Intraduktal injektion af virus

BEMÆRK: En forstørrelseslampe kan bruges til at hjælpe med at visualisere nippelåbningen.

  1. Transekter den distale spids af en brystvorte ved hjælp af en steril mikrodissektionsfjedersaks, indtil en lille central kanalåbning kan ses under en forstørrelseslampe (se materialetabel).
  2. Læg 10 μL virus/bromphenolblåt mix i sprøjten.
    BEMÆRK: Lenti-EGFP (FUCGW) og RCAS-Erbb2 (Neu) anvendes i denne demonstration.
  3. Indsæt forsigtigt nålen i brystvortens åbning ved hjælp af forstørrelseslampen. Nålens orientering justeres lidt fra medial til lateral for at justere med hovedkanalen.
  4. Injicer hele 10 μL af virussen i kanaltræet.
    BEMÆRK: Kanalerne under huden skal blive blå, hvis injektionen lykkes. Enhver modstand eller udseendet af en lokaliseret farveændring indikerer injektionens svigt.
  5. Sæt musen på et glidevarmersæt ved 45 °C, indtil musen vågner helt (~30-60 min).

5. Påvisning af inficerede celler ved hjælp af et fluorescerende stereomikroskop

  1. Tre til fem dage efter injektion af virussen, der bærer GFP eller andre fluorescerende gener, aflives musen ved at overdosere den med 4 uL / g bedøvelsesmiddel (37,6 mg / ml ketamin, 1,92 mg / ml xylazin og 0,38 mg / ml acepromazin).
  2. Åbn brysthulen. Skær huden langs den ventrale midterlinje og langs de øvre og nedre lemmer ved hjælp af en saks. Løft huden og udsæt brystkirtlerne.
  3. Fjern den injicerede brystkirtel fra huden ved hjælp af et par tang og saks. Fjern også en ikke-injiceret kirtel som kontrol.
  4. Placer brystkirtlerne på glasskinner og spred kirtlerne til deres oprindelige form.
  5. Overhold og billede kirtlerne under et fluorescerende stereomikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Repræsentative data præsenteres her for at demonstrere vellykket intraduktal injektion, vellykket virusinfektion og virkningen af de leverede gener på brysttumorgenese. Mængden af injiceret virus skal tilpasses formålet med hvert forsøg. For at illustrere, hvor omfattende brystkanaltræet kan inficeres, skal der bruges en stor mængde virusbærende gener, der kan afbildes, såsom GFP. På den anden side, for at efterligne den naturlige spontane tumorgenese, skal en lille mængde virus, der bærer et onkogen, anvendes, så kun få celler er inficeret og vil udvikle sig til precancerøse læsioner og til sidst invasiv kræft i et felt af den ellers helt normale brystkirtel.

Succesen med intraduktal injektion kan straks bekræftes ved at udsætte brystkirtlen og observere et blåt duktalt træ (figur 1). To til fem dage efter injektion af Lenti-EGFP-virus (FUCGW) (~106 IE)12 kan brystepitelcelleinfektion vurderes ved helmonteret præparat efterfulgt af observation under et fluorescerende stereomikroskop (figur 2). Alternativt kan de inficerede kirtler og ikke-inficerede kirtler (som negative kontroller) til flowcytometrianalyse af fluorescerende proteiner eller celleoverflademarkører produceret af virus 6,7,19 opsamles og forarbejdes til en enkeltcellesuspension, således at hastigheden af virusinfektion kan estimeres (figur 3). En anden metode til at teste / kvantificere virusinfektion er at fiksere de inficerede og ikke-inficerede kontrolkirtler ved hjælp af 4% paraformaldehyd (eller formalin), behandle dem i paraffinindlejrede blokke og plette de resulterende sektioner for de viralt producerede genprodukter og epitopmærker som HA og FLAG20,21.

Hvorvidt de viralt inficerede celler vil udvide sig og danne precancerøse læsioner og derefter tumorer, afhænger af styrken af det eller de leverede onkogener og mængden af injiceret virus. For et potent onkogen som PyMT og aktiveret RAS dannes tidlige læsioner om få dage, og tumorer vises om få uger10 (Bu et al., Upublicerede observationer). Aktiveret ERBB2 fører til precancerøse læsioner om få uger og tumorer om få måneder 10,22,23 (figur 4), mens aktiveret PIK3CA fører til tumorer med en median latenstid på ca. 5 måneder 24. På den anden side forårsager Wnt1 tumorer temmelig langsomt: kun ca. 20% af de inficerede mus udviklede tumorer efter 20 måneder21.

Figure 1
Figur 1: Et vellykket injiceret brystkanaltræ. Billedet blev taget umiddelbart efter intraduktal injektion af brystkirtel nummer 4 hos en 9 uger gammel FVB/N hunmus. Pilen angiver placeringen af nummer 4 brystvorten. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Påvisning af inficerede celler ved fluorescerende stereomikroskopi. (A) En ikke-injiceret kontralateral kirtel anvendes som kontrol. (B) Et billede taget under et fluorescerende stereomikroskop viser det inficerede brystkanaltræ. Brystkirtlen nummer 3 hos en 10 uger gammel FVB/N-mus blev intraduktalt injiceret med Lenti-EGFP (FUCGW) virus (~106 IE). Den injicerede brystkirtel blev opsamlet 5 dage efter injektionen. Vægtstang: 1 mm. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Kvantificering af inficerede celler ved flowcytometrianalyse for EGFP produceret af lentivirus. Phycoerythrin (PE) kanalen blev brugt til at afsløre det autofluorescerende signal. De kontralaterale uinjicerede brystkirtler blev anvendt som den negative kontrol. De injicerede mælkekirtler fra en 12 uger gammel FVB/N-hunmus blev indsamlet 2,5 dage efter intraduktal injektion af Lenti-EGFP (~106 IE/kirtel) og forarbejdet til en enkeltcellesuspension. Enkeltcellesuspensionen blev derefter analyseret ved flowcytometri for at detektere de GFP-positive celler. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Immunohistokemisk bekræftelse af virusudtrykt onkogenprodukt i en tidlig læsion og en tumor. (A) En tidlig læsionsholdig #4 brystkirtel blev indsamlet 14 dage efter intraduktal injektion af 106 IE RCAS-Neu (HA) i MMTV-tva-mus. Immunohistokemisk farvning blev brugt til at detektere HA-mærket. (B) En tumor blev indsamlet 1 år efter intraduktal injektion af 10 4 IE RCAS-Neu (HA) i en #4 kirtel af MMTV-tva-mus. Musens alder ved injektion: 12 uger. Vægtstang: 20 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikel demonstrerer den virale intraduktale injektionsteknik til introduktion af gener i musebrystepitelceller til modellering af sporadisk brystkræft. Normalt injiceres mus på mindst 5 uger eller ældre, så den onkogene proces starter, efter at brystkirtlen er udviklet. Desuden er brystvorteåbningen hos mus yngre end 5 uger gamle ofte for lille til injektion. På den anden side er brystvorterne hos meget gamle mus undertiden degenererede, og transektion kan muligvis ikke afsløre en kanalåbning. Det er også vigtigt at bemærke, at brystvorterne i nogle transgene eller knockout tumormodeller også kan være vanskelige at injicere på grund af unormal brystudvikling forårsaget af kimlinjegenetiske mutationer.

Udover at praktisere brugen af standard personlige værnemidler (PPE) til håndtering af vira, skal der udvises forsigtighed for at undgå utilsigtede nålestik i eksperimentatorens hænder. Selvom der ikke er tegn på, at aviær leukosevirus inficerer mennesker, kan lentivirus, der anvendes til kræftmodellering hos gnavere, også inficere mennesker. Denne beskyttelse mod utilsigtet infektion er især vigtig, når virussen bærer et potent onkogen25.

Når flere gener af interesse skal leveres til epitelceller, kan de leveres af en blanding af forskellige vektorer, der bærer hvert enkelt gen eller af en vektor designet til at bære alle de gener, der skal testes. Den førstnævnte metode kan drage fordel af tidligere producerede vira, men co-infektion forekommer kun i en lille delmængde af den inficerede befolkning. På den anden side kræver sidstnævnte tilgang ofte konstruktion af nye vira, men co-infektion er garanteret.

Sammenlignet med de genetisk manipulerede musemodeller (GEMM'er) giver den intraduktale injektionsteknik bedre rumlig tidsmæssig fleksibilitet til at levere genet af interesse i brystepitelceller. Denne fleksibilitet letter bedre efterligning af tumorigenese hos patienter, da de fleste brystkræftformer stammer fra somatiske celler, der lider genetiske ændringer i voksne stadier5. Spatiotemporal kontrol kan også bidrage til at studere bidraget fra celleundertyper til brysttumorigenese 6,7,9,26,27,28.

Den intraduktale injektionsteknik er hovedsagelig blevet brugt til at levere eksogene gener drevet af kunstige promotorer med en viral vektor. Når et onkogen leveres på denne måde, adskiller dets transkription sig fra et naturligt muteret endogent proto-onkogen. Og denne forskel kan efterfølgende påvirke kræftdannelse, progression og respons på terapi. For at overvinde denne bekymring kan vektorer, der bærer CRISPR / Cas9-baserede genredigeringskomponenter, bruges til at redigere endogene gener af interesse 29,30. Vi har for nylig forbedret denne strategi og gjort den meget fleksibel og effektiv (Bu et al., ikke offentliggjorte resultater). Disse fremskridt inden for genredigering gør den intraduktale injektionsteknik til et endnu mere kraftfuldt værktøj til kræftmodellering.

Afslutningsvis er intraduktal injektion af virale vektorer en kraftfuld teknik til generering af musemodeller af brystkræft, der nøje efterligner dannelse af menneskelig brystkræft. Kombinationen af denne teknik med TVA-teknologien og CRISPR-redigering frigør endnu mere potentiale for denne alsidige metode til forståelse af brystkræftdannelse. Disse modeller giver også værdifulde ressourcer til at teste nye strategier inden for forebyggelse af brystkræft.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Begge forfattere erklærer ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Vi takker Dr. Gary Chamness for hans nyttige kommentarer til dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af Department of Defense (DOD), CDMRP BC191649 (YL) og BC191646 (YL) samt National Institutes of Health (NIH) CA271498 (YL). Forfatterne vil gerne takke Breast Center Pathology Core Facility understøttet af SPORE P50CA186784 og cytometri- og cellesorteringskerne understøttet af CPRIT-RP180672, NIH CA125123 og RR024574 med hjælp fra Joel M. Sederstrom.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Anti-HA antibody Covance MMS-101P Dilution: 1 : 1000
Artificial Tears Covetrus NDC 11695-0832-1
Bromophenol blue Sigma B5525 microwave radiation for 45 seconds at power high of 1250W microwave oven
FACSCantoII BD Biosciences V96100899
Fluorescent stereomicroscope Leica MZ16 FA
FUCGW lenti-virus Self-made N/A See reference # 12
FVB/N The Jackson Laboratory JAX:001800
Hamilton needle Hamilton 91033 autoclaved
Hamilton syringe Hamilton 201000 autoclaved
LED magnifying lamp Intertek 3165273
Micro dissection spring scissor Roboz RS-5621 autoclaved
MMTV-tva Self-made See reference # 10
RCAS-Neu (HA) Self-made N/A See reference # 10
Rodent Comboanesthetic III Veterinary Pharmacy Veterinary prescription 37.6 mg/mL ketamine, 1.92 mg/mL xylazine, and 0.38 mg/mL acepromazine

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).
  2. Gordon, J. W., Ruddle, F. H. Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei. Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).
  3. Costantini, F., Lacy, E. Introduction of a rabbit beta-globin gene into the mouse germ line. Nature. 294 (5836), 92-94 (1981).
  4. Brinster, R. L., et al. Somatic expression of herpes thymidine kinase in mice following injection of a fusion gene into eggs. Cell. 27 (1), 223-231 (1981).
  5. Du, Z., Li, Y. RCAS-TVA in the mammary gland: an in vivo oncogene screen and a high fidelity model for breast transformation. Cell Cycle. 6 (7), 823-826 (2007).
  6. Bu, W., et al. Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes. Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).
  7. Bu, W., et al. Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer. Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).
  8. Haricharan, S., et al. Contribution of an alveolar cell of origin to the high-grade malignant phenotype of pregnancy-associated breast cancer. Oncogene. 33 (50), 5729-5739 (2014).
  9. Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis. PLoS One. 8 (11), 78720 (2013).
  10. Du, Z., et al. Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).
  11. Siwko, S. K., et al. Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors. Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).
  12. Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).
  13. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. Journal of Virology. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  14. Wagner, S., Thresher, R., Bland, R., Laible, G. Adeno-associated-virus-mediated transduction of the mammary gland enables sustained production of recombinant proteins in milk. Scientific Reports. 5, 15115 (2015).
  15. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  16. Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. Retroviruses. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).
  17. Mitani, K., Kubo, S. Adenovirus as an integrating vector. Current Gene Therapy. 2 (2), 135-144 (2002).
  18. McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors. Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).
  19. Bu, W., Li, Y. Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo. Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).
  20. Dong, J., et al. Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones. Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).
  21. Haricharan, S., et al. Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy. eLife. 2, 00996 (2013).
  22. Reddy, J. P., et al. Defining the ATM-mediated barrier to tumorigenesis in somatic mammary cells following ErbB2 activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (8), 3728-3733 (2010).
  23. Dong, J., et al. The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors. Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).
  24. Young, A., et al. Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer. Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).
  25. Schlimgen, R., et al. Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies. Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).
  26. Holloway, K. R., et al. Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2. PLoS One. 10 (1), 0117239 (2015).
  27. Holloway, K. R., et al. Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype. International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).
  28. Hein, S. M., et al. Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress. Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).
  29. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO Journal. 39 (5), 102169 (2020).
  30. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).

Tags

Kræftforskning nr. 192
<em>In vivo</em> Genlevering til musebrystepitelceller gennem brystintraduktal injektion
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bu, W., Li, Y. In Vivo Gene … More

Bu, W., Li, Y. In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection. J. Vis. Exp. (192), e64718, doi:10.3791/64718 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter