Im lebenden Organismus Gentransfer in Brustepithelzellen der Maus durch intraduktale Injektion in der Brust

Bei dieser Methode wird das Erbgut auf spezielle, temporäre und quantitativ kontrollierbare Weise in die Epithelzellen der Brustdrüse eingebracht. Da die Einschleusung von genetischem Material in die Brustepithelzellen speziell, temporär und quantitativ kontrolliert wird, ahmen die mit dieser Methode erzeugten Brustmodelle die natürliche Tumorentstehung besser nach. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Spritze, indem Sie die 33-Gauge-Nadeln aus Metall auf etwa einen Zentimeter Länge schneiden und in Alkohol lagern.

Entfernen Sie Spritzen und Nadeln aus dem Alkohol und drücken Sie den restlichen Alkohol aus der Spritze und den Nadeln. Zerlegen Sie dann die Spritze zum Trocknen an der Luft. Setzen Sie die Spritze nach dem Trocknen zusammen.

Nehmen Sie die viralen Vorratsröhrchen aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und tauen Sie sie auf Eis auf. Um Bromphenolblau hinzuzufügen, tauchen Sie die Pipettenspitze bis zu einer Tiefe von einem Zentimeter in das Bromphenolblaupulver. Bringen Sie dann die angehängte Spurenmenge Bromphenolblau in die Virussuspension.

Mischen Sie das Bromphenolblau mit der Viruslösung, indem Sie es 10 Mal auf und ab pipettieren, bevor Sie das Virus auf Eis legen. Überprüfen Sie die Narkosetiefe, indem Sie den Zeh einer betäubten weiblichen Maus einklemmen. Tragen Sie Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit zu verhindern, während das Tier unter Narkose steht.

Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine warme Unterlage und befestigen Sie alle vier Gliedmaßen mit Klebeband an der Bank. Identifizieren Sie die Brustwarze, die injiziert werden soll, und legen Sie sie frei, indem Sie das umgebende Haar mit einer Schere abschneiden. Tragen Sie 70%Alkohol und vier Tupfer in drei abwechselnden Runden auf den Brustwarzenbereich auf, um die Brustwarze zu reinigen und freizulegen.

Durchtrennen Sie die distale Spitze einer Brustwarze mit einer sterilisierten Mikrodissektionsfederschere, bis unter einer Lupenlampe eine kleine zentrale Kanalöffnung zu sehen ist. Geben Sie dann 10 Mikroliter der Virusbromphenolblau-Mischung in die Spritze und führen Sie die Nadel mit Hilfe der Lupenlampe vorsichtig in die Brustwarzenöffnung ein. Injizieren Sie die gesamten 10 Mikroliter des Virus in den Kanalbaum und legen Sie die Maus auf einen auf 45 Grad Celsius eingestellten Diawärmer, bis die Maus vollständig aufgewacht ist.

Öffnen Sie die Brusthöhle drei bis fünf Tage nach der Virusinjektion. Schneiden Sie die Haut entlang der ventralen Mittellinie und der oberen und unteren Gliedmaßen mit einer Schere ab. Heben Sie die Haut an und legen Sie die Brustdrüsen frei.

Entfernen Sie die injizierte Brustdrüse von der Haut und eine nicht injizierte Drüse zur Kontrolle mit Pinzette und Schere. Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Brustdrüse auf einen Objektträger und spreizen Sie die Drüse in ihre ursprüngliche Form, bevor Sie sie unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop beobachten und abbilden. Der Erfolg der intraduktalen Injektion wurde durch Freilegung der Brustdrüse und Beobachtung eines blauen duktalen Baumes bestätigt.

Nach zwei bis fünf Tagen nach der Injektion des Lenti-EGFPFUCGW-Virus wurde die Infektion mit dem Brustepithel durch Beobachtung der gesamten Montierungspräparation unter einem Fluoreszenz-Stereomikroskop beurteilt. Für die durchflusszytometrische Analyse der vom Virus produzierten fluoreszierenden Proteine oder Zelloberflächenmarker wurden die nicht infizierten Drüsen und infizierten Drüsen gesammelt und zu einer einzigen Zellsuspension verarbeitet, um die Rate der Virusinfektion abzuschätzen. Aktiviertes ERBBB2 führte innerhalb weniger Wochen zu präkanzerösen Läsionen und innerhalb weniger Monaten zu Tumoren.

Die Größe der Brustwarzen kann aufgrund der Unterschiede in Masse, Alter, Körpergewicht und Stärke zwischen den einzelnen Mäusen erheblich variieren. Das richtige Trimmen der Brustwarzenspitze, um die Öffnung des Milchgangs freizulegen, und das Einsetzen der Nadel ist ein wichtiger Schritt für eine erfolgreiche Injektion des Virus.