Name: Im lebenden Organismus Gentransfer in Brustepithelzellen der Maus durch intraduktale Injektion in der Brust (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 36 s
Description: Erfahren Sie die intraduktale Injektion viraler Vektoren zur kontrollierten Gentransfer in Brustepithelzellen der Maus. Diese Methode ermöglicht realistischere Tumormodelle für die Krebsforschung.

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Wir danken Dr. Gary Chamness für seine hilfreichen Kommentare zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde vom Department of Defense (DOD) CDMRP BC191649 (YL) und BC191646 (YL) sowie den National Institutes of Health (NIH) CA271498 (YL) unterstützt. Die Autoren bedanken sich bei der Breast Center Pathology Core Facility, die von SPORE P50CA186784 unterstützt wird, und dem Cytometry and Cell Sorting Core, das von CPRIT-RP180672, NIH CA125123 und RR024574 mit Unterstützung von Joel M. Sederstrom unterstützt wird.

Alle Eingriffe mit Mäusen wurden in Übereinstimmung mit dem vom Institutional Animal Care and Use Committee genehmigten Tierprotokoll durchgeführt. Für die vorliegende Studie wurden 9-12 Wochen alte weibliche FVB/N- oder MMTV-tva-Mäuse verwendet. Die Mäuse wurden kommerziell oder selbst hergestellt (siehe Materialtabelle). Zum Einsatz kamen die Viren Lenti-EGFP (FUCGW) und RCAS-Erbb2 (Neu). Die Viruspräparation und die Titerbestimmung erfolgten in Anlehnung an die zuvor veröffentlichten Berichte10,12.
1. Vorbereitung der Spritze
<ol><li>Die 33 g langen Nadeln aus Metall (siehe Materialtabelle) auf ca. 1 cm Länge zuschneiden. Bewahren Sie die Nadeln und die 50-μl-Spritze nach dem Autoklavieren in 70%igem Alkohol auf.</li>
	<li>Nehmen Sie Spritzen und Nadeln aus dem Alkohol. Drücke den restlichen Alkohol aus der Spritze und der Nadel. Zerlegen Sie die Spritze zum Trocknen an der Luft auf einer autoklavierten, saugfähigen Bankunterlage.</li>
	<li>Setzen Sie die Spritze nach dem Trocknen zusammen.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Virus
<ol><li>Nehmen Sie je nach Bedarf ein oder mehrere Virusröhrchen aus dem -80 °C Gefrierschrank und tauen Sie das Virus auf Eis auf. HINWEIS: Abhängig von der Anzahl der zu infizierenden Zellen muss das Virus möglicherweise mit 1x PBS zu diesem Zeitpunkt mit 1x PBS in die vorgesehenen Titer verdünnt werden.</li>
	<li>Fügen Sie Bromphenolblau hinzu, indem Sie die Pipettenspitze bis zu einer Tiefe von 1 cm in das Bromphenolblaupulver tauchen (siehe Materialtabelle). Bringen Sie dann die angehängte Spurenmenge Bromphenolblau in die Virussuspension. HINWEIS: Für die vorliegende Studie beträgt der Virusbestand normalerweise 200 μl pro Röhrchen, so dass die endgültige Farbstoffkonzentration etwa 0,2 % (0,2 μg/100 μl) beträgt. Bromphenolblau sollte 45 Sekunden lang mit Mikrowellenstrahlung bei hoher Leistung von 1250 W sterilisiert werden (siehe Materialtabelle). Stellen Sie sicher, dass Sie das gesamte Verfahren in einer sterilen Umgebung durchführen.</li>
	<li>Mischen Sie das Bromphenolblau mit der Viruslösung, indem Sie 10 Mal auf und ab pipettieren.</li>
	<li>Legen Sie das Virus auf Eis und bringen Sie den Eiskübel zum Vivarium.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Tiere
<ol><li>Betäubung einer weiblichen Maus durch intraperitoneale Injektion von 2 μl/g Anästhetikum (37,6 mg/ml Ketamin, 1,92 mg/ml Xylazin und 0,38 mg/ml Acepromazin, siehe Materialtabelle). Überprüfen Sie die Narkosetiefe mit einer Zehenzwicke. Tragen Sie Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit unter Narkose zu vermeiden. HINWEIS: Die Maus muss unter guter Betäubung nicht auf Zehenkneifen reagieren. Isofluran kann auch zur Betäubung der Mäuse verwendet werden.</li>
	<li>Legen Sie die Maus in Rückenlage auf eine warme Unterlage und befestigen Sie alle vier Gliedmaßen mit Klebeband an der Bank.</li>
	<li>Identifizieren Sie eine Brustwarze (oder mehrere), die injiziert werden soll (Nummer 4 wird für die vorliegende Studie bevorzugt). Legen Sie es frei, indem Sie das umgebende Haar mit einer Schere abschneiden.</li>
	<li>Tragen Sie 70%igen Alkohol und Jodophor-Tupfer in drei Runden auf den Brustwarzenbereich auf, um die Brustwarze zu reinigen und freizulegen.</li>
</ol>4. Intraduktale Injektion des Virus
Anmerkungen: Eine Lupenlampe kann verwendet werden, um die Nippelöffnung zu visualisieren.
<ol><li>Die distale Spitze einer Brustwarze wird mit einer sterilen Mikrodissektions-Federschere durchtrennt, bis unter einer Lupenlampe eine kleine zentrale Kanalöffnung zu sehen ist (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Geben Sie 10 μl Virus/Bromphenolblau-Gemisch in die Spritze. HINWEIS: In dieser Demonstration werden Lenti-EGFP (FUCGW) und RCAS-Erbb2 (Neu) verwendet.</li>
	<li>Führen Sie die Nadel vorsichtig mit Hilfe der Lupenlampe in die Nippelöffnung ein. Die Ausrichtung der Nadel wird leicht von medial nach lateral angepasst, um sie mit dem Hauptkanal auszurichten.</li>
	<li>Injizieren Sie die gesamten 10 μl des Virus in den Duct Tree. HINWEIS: Die Kanäle unter der Haut sollten sich blau färben, wenn die Injektion erfolgreich war. Jeder Widerstand oder das Auftreten einer lokalisierten Farbänderung weist auf ein Versagen der Injektion hin.</li>
	<li>Stellen Sie die Maus auf einen Diawärmer, der auf 45 °C eingestellt ist, bis die Maus vollständig aufgewacht ist (~30-60 min).</li>
</ol>5. Detektion infizierter Zellen durch ein fluoreszierendes Stereomikroskop
<ol><li>Drei bis fünf Tage nach der Injektion des Virus, das GFP oder andere fluoreszierende Gene trägt, wird die Maus durch Überdosierung mit 4 μl/g Anästhetikum (37,6 mg/ml Ketamin, 1,92 mg/ml Xylazin und 0,38 mg/ml Acepromazin) eingeschläfert.</li>
	<li>Öffne die Brusthöhle. Schneiden Sie die Haut mit einer Schere entlang der ventralen Mittellinie und entlang der oberen und unteren Gliedmaßen. Heben Sie die Haut an und legen Sie die Brustdrüsen frei.</li>
	<li>Entfernen Sie die injizierte Brustdrüse mit einer Pinzette und einer Schere aus der Haut. Entfernen Sie auch eine nicht injizierte Drüse als Kontrolle.</li>
	<li>Legen Sie die Brustdrüsen auf Glasobjektträger und spreizen Sie die Drüsen in ihre ursprüngliche Form.</li>
	<li>Beobachte und bilde die Drüsen unter einem fluoreszierenden Stereomikroskop ab.</li>
</ol>

<ol><li>Nguyen, D. -A., Beeman, N., Lewis, M., Schaack, J., Neville, M. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNguyen%2C+D-A+%22Methods+in+Mammary+Gland+Biology+and+Breast+Cancer+Research.+Eds+Margot%22">Methods in Mammary Gland Biology and Breast Cancer Research. Eds Margot</a>. Ip, M. M., Asch, B. B. , Springer US. 259-270 (2000).</li>
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<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+precancerous+stem+and+non-stem+cells+evolve+into+cancers+of+distinct+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Mammary precancerous stem and non-stem cells evolve into cancers of distinct subtypes.</a> Cancer Research. 79 (1), 61-71 (2019).</li>
<li>Bu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratin+6a+marks+mammary+bipotential+progenitor+cells+that+can+give+rise+to+a+unique+tumor+model+resembling+human+normal-like+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Keratin 6a marks mammary bipotential progenitor cells that can give rise to a unique tumor model resembling human normal-like breast cancer.</a> Oncogene. 30 (43), 4399-4409 (2011).</li>
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<li>Bu, W., Zhang, X., Dai, H., Huang, S., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammary+cells+with+active+Wnt+signaling+resist+ErbB2-induced+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mammary cells with active Wnt signaling resist ErbB2-induced tumorigenesis.</a> PLoS One. 8 (11), 78720(2013).</li>
<li>Du, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+oncogenes+into+mammary+glands+in+vivo+with+an+avian+retroviral+vector+initiates+and+promotes+carcinogenesis+in+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Introduction of oncogenes into mammary glands in vivo with an avian retroviral vector initiates and promotes carcinogenesis in mouse models.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17396-17401 (2006).</li>
<li>Siwko, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-mediated+oncogene+introduction+into+mammary+cells+in+vivo+induces+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-mediated oncogene introduction into mammary cells in vivo induces tumors.</a> Neoplasia. 10 (7), 653-662 (2008).</li>
<li>Bu, W., Xin, L., Toneff, M., Li, L., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Lentivirus vectors for stably introducing genes into mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 14 (4), 401-404 (2009).</li>
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<li>Naldini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+delivery+and+stable+transduction+of+nondividing+cells+by+a+lentiviral+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector.</a> Science. 272 (5259), 263-267 (1996).</li>
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<li>McCarty, D. M., Young, S. M., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+adeno-associated+virus+%28AAV%29+and+recombinant+AAV+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Integration of adeno-associated virus (AAV) and recombinant AAV vectors.</a> Annual Review of Genetics. 38, 819-845 (2004).</li>
<li>Bu, W., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraductal+injection+of+lentivirus+vectors+for+stably+introducing+genes+into+rat+mammary+epithelial+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Mammary+Gland+Biology+and+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Intraductal injection of lentivirus vectors for stably introducing genes into rat mammary epithelial cells in vivo.</a> Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia. 25 (4), 389-396 (2020).</li>
<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+individual+somatic+mammary+cells+in+vivo+reveals+a+master+role+of+STAT5a+in+inducing+alveolar+fate+commitment+and+lactogenesis+even+in+the+absence+of+ovarian+hormones%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of individual somatic mammary cells in vivo reveals a master role of STAT5a in inducing alveolar fate commitment and lactogenesis even in the absence of ovarian hormones.</a> Developmental Biology. 346 (2), 196-203 (2010).</li>
<li>Haricharan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+preclinical+prevention+of+increased+breast+cancer+risk+caused+by+pregnancy%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Mechanism and preclinical prevention of increased breast cancer risk caused by pregnancy.</a> eLife. 2, 00996(2013).</li>
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<li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PR+status+of+the+originating+cell+of+ER%2FPR-negative+mouse+mammary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The PR status of the originating cell of ER/PR-negative mouse mammary tumors.</a> Oncogene. 35 (31), 4149-4154 (2016).</li>
<li>Young, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+the+pro-survival+protein+BCL-2+to+prevent+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Prevention+Research%22%5BJournal%5D)">Targeting the pro-survival protein BCL-2 to prevent breast cancer.</a> Cancer Prevention Research. 15 (1), 3-10 (2022).</li>
<li>Schlimgen, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Risks+associated+with+lentiviral+vector+exposures+and+prevention+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Occupational+and+Environmental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Risks associated with lentiviral vector exposures and prevention strategies.</a> Journal of Occupational and Environmental Medicine. 58 (12), 1159-1166 (2016).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Krt6a-positive+mammary+epithelial+progenitors+are+not+at+increased+vulnerability+to+tumorigenesis+initiated+by+ErbB2%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Krt6a-positive mammary epithelial progenitors are not at increased vulnerability to tumorigenesis initiated by ErbB2.</a> PLoS One. 10 (1), 0117239(2015).</li>
<li>Holloway, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+oncogenes+into+a+defined+subset+of+mammary+cells+demonstrates+that+the+initiating+oncogenic+mutation+defines+the+resulting+tumor+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Biological+Sciences%22%5BJournal%5D)">Targeting oncogenes into a defined subset of mammary cells demonstrates that the initiating oncogenic mutation defines the resulting tumor phenotype.</a> International Journal of Biological Sciences. 12 (4), 381-388 (2016).</li>
<li>Hein, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Luminal+epithelial+cells+within+the+mammary+gland+can+produce+basal+cells+upon+oncogenic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Luminal epithelial cells within the mammary gland can produce basal cells upon oncogenic stress.</a> Oncogene. 35 (11), 1461-1467 (2015).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+CRISPR-Cas9+base+editing+for+the+development+of+genetically+engineered+mouse+models+of+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer.</a> EMBO Journal. 39 (5), 102169(2020).</li>
<li>Annunziato, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+invasive+lobular+breast+carcinoma+by+CRISPR%2FCas9-mediated+somatic+genome+editing+of+the+mammary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland.</a> Genes & Development. 30 (12), 1470-1480 (2016).</li>
</ol>

Beide Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Dieser Artikel demonstriert die virale intraduktale Injektionstechnik zur Einschleusung von Genen in Brustepithelzellen von Mäusen zur Modellierung von sporadischem Brustkrebs. In der Regel werden Mäuse, die mindestens 5 Wochen oder älter sind, injiziert, damit der onkogene Prozess beginnt, nachdem sich die Brustdrüse entwickelt hat. Außerdem ist die Brustwarzenöffnung von Mäusen, die jünger als 5 Wochen sind, oft zu klein für eine Injektion. Auf der anderen Seite sind die Brustwarzen von sehr alten Mäusen manchmal degen...

Epithelzellen der Brustdrüsen spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion dieser Drüsen und sind die Hauptursprungszelle von Brustkrebs. Studien zur Biologie der Brustdrüse und zur Tumorgenese erfordern häufig den Transport von Genen von Interesse in diese Zellen. Jede Brustdrüse der Maus besteht aus einem von Epithelzellen ausgekleideten Ductusbaum mit einer einzigen Öffnung an der Spitze der Brustwarze. Diese Struktur macht die Brustepithelzellen für virale Vektoren leicht zugänglich, die durch intraduktale Injektion in das Lumen eines duktalen Baumes eingebracht werden können1.
Die Technik der intraduktalen Injektion der Brust wurde ursprünglich bei viel größeren Tieren wie Ziegen, Kaninchen und Ratten angewendet1. Bei einem viel kleineren Tier wie Mäusen erfordert die intraduktale Injektion viele empfindliche Werkzeuge und mehr Übungen der Bediener. Es gibt zwei Ansätze für die intraduktale Injektion von Mäusen. Eine davon ist die Zitzeninjektion1. Eine weitere Möglichkeit ist die direkte Injektion des Primärgangs der Brustdrüse #3 oder #4 nach chirurgischer Exposition1. Da die erste Technik nicht-invasiv und schneller ist, sobald der Bediener gut geschult ist, wird diese Technik häufiger verwendet und in diesem Artikel ausführlich beschrieben.
Im Vergleich zu den weit verbreiteten traditionellen transgenen Mausmodellen, bei denen das interessierende Gen im Stadium der befruchteten Eizellen durch Mikroinjektion eingeführt wird 2,3,4, hat die Genübertragung durch die intraduktale Virusinjektionsmethode viele Vorteile, darunter: (1) es vermeidet den zeitaufwändigen Prozess der Herstellung einer transgenen Mauslinie für jedes Gen von Interesse; (2) es vermeidet eine mögliche Beeinträchtigung der normalen Entwicklung der Brustdrüsen, die durch das interessierende Gen verursacht wird; (3) es führt das interessierende Gen zu einem beliebigen Zeitpunkt nach der Geburt ein; (4) es kann leicht mehr als ein Gen von Interesse einführen; (5) es ahmt den natürlichen tumorigenen Prozess besser nach, da die infizierten und damit Onkogen-tragenden Zellen von normalen Zellen umgeben sind; und (6) in Kombination mit der TVA-Technologie(Tumorvirus A, ein aviäres Zelloberflächenprotein und der Rezeptor für den Retrovirus-RCAS-Vektor) 5 das Gen von Interesse in eine bestimmte Zellpopulation eingeführt werden kann, um den Zellursprung der Tumorgenese zu untersuchen und Assays zur Rückverfolgung der Zelllinie in den Brustdrüsendurchzuführen 6,7,8, 9. Sonstiges
Alle Vektoren, die von Retrovirus 10, Lentivirus 11,12, Adenovirus 13 und Adenovirus-assoziiertem Virus (AAV)14 abgeleitet sind, können für die intraduktale Verabreichung von genetischem Material verwendet werden. Retrovirus- und Lentivirus-Vektoren integrieren sich dauerhaft in das Wirtsgenom; Auf diese Weise schleusen sie interessante Gene stabil in Brustepithelzellen ein. Während sich das Lentivirus in das Genom jeder Zelle integrieren kann, auf die es trifft15, erfordert die effiziente genomische Integration des Retrovirus die Proliferation der Zielzellen16. Die adenoviralen und AAV-Vektoren integrieren sich nicht in das Genom infizierter Zellen und exprimieren daher nur vorübergehend das interessierende Gen17,18. Diese Eigenschaft kann von Vorteil sein, wenn das interessierende Gen nur für kurze Zeit exprimiert werden muss, wie z. B. Cre, um ein gefloxtes Tumorsuppressorgen zu löschen.
Lentivirus, Adenovirus und AAV infizieren alle Mäusezellen, denen sie begegnen. Da das luminale Epithel jedoch weitgehend von der darunter liegenden Basalschicht isoliert ist, die durch die Basalmembran weiter vom Stroma getrennt ist, beschränkt die intraduktale Injektion die Infektion weitgehend auf luminale Epithelzellen, die primäre Ursprungszelle von Brustkrebs. Innerhalb dieser luminalen Epithelschicht gibt es auch verschiedene Zellsubtypen, darunter Stammzellen, Vorläuferzellen und mehrere Gruppen differenzierter Zellen. Um bestimmte Zelluntergruppen innerhalb der luminalen Zellpopulation zu infizieren, kann die TVA-Technologie verwendet werden, mit der von aviären Leukoseviren abgeleitete RCAS-Vektoren5,10 oder pseudotypisierte lentivirale Vektoren11 selektiv die Zellen infizieren, die TVA in Mäusen exprimieren, die ein tva-Transgen unter der Kontrolle eines zelltypspezifischen Promotors tragen, wie z. B. eines Promotors, der nur in Stammzellen 6 oder bestimmter Vorläuferzellen6 aktiv ist, 7 oder Alveolarzellen8 oder Wnt-Signalweg-aktive Zellen9.
Dieses Protokoll stellt die Technik vor, bei der Gene von Interesse durch intraduktale Injektion eines viralen Vektors in Brustepithelzellen eingeführt werden. Anschließend wird die Detektion der Expression der eingeführten Gene und die daraus resultierenden hyperplastischen Läsionen und Tumoren demonstriert.

<table><tbody><tr><td>Anti-HA-Antikörper</td><td>Covance</td><td>MMS-101P</td><td>Verdünnung: 1 : 1000</td></tr><tr><td>Künstliche Tränen</td><td>Covetrus</td><td>NDC 11695-0832-1</td><td></td></tr><tr><td>Bromphenolblau</td><td>Sigma</td><td>B5525</td><td>Mikrowellenstrahlung für 45 Sekunden bei hoher Leistung von 1250W Mikrowellenherd</td></tr><tr><td>FACSCantoII</td><td>BD Biosciences</td><td>V96100899</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszierendes Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>MZ16 FA</td><td></td></tr><tr><td>FUCGW Lenti-Virus</td><td>Self-made</td><td>N/A</td><td>Siehe Referenz # 12</td></tr><tr><td>FVB/N</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>JAX:001800</td><td></td></tr><tr><td>Hamilton-Nadel</td><td>Hamilton</td><td>91033</td><td>autoklavierte</td></tr><tr><td>Hamilton-Spritze</td><td>Hamilton</td><td>201000</td><td>autoklavierte</td></tr><tr><td>LED-Lupenlampe</td><td>Intertek</td><td>3165273</td><td></td></tr><tr><td>Mikrodissektions-Federschere</td><td>Roboz</td><td>RS-5621</td><td>autoklaviert</td></tr><tr><td>MMTV-tva</td><td>Selbsthergestellt</td><td></td><td>Siehe Referenz # 10</td></tr><tr><td>RCAS-Neu (HA)</td><td>Selbst hergestellt</td><td>N/A</td><td>Siehe Referenz # 10</td></tr><tr><td>Nagetier Komboanästhetikum III</td><td>Veterinärapotheke</td><td>Tierärztliche Verschreibung</td><td>37,6 mg/mL Ketamin, 1,92 mg/mL Xylazin und 0,38 mg/mL Acepromazin</td></tr></tbody></table>

im lebenden organismus gentransfer in brustepithelzellen der maus durch intraduktale injektion in der brust

In Vivo Gene Delivery into Mouse Mammary Epithelial Cells Through Mammary Intraductal Injection

Die Milchdrüsen der Maus bestehen aus duktalen Bäumen, die von Epithelzellen ausgekleidet sind und eine Öffnung an der Spitze jeder Brustwarze haben. Die Epithelzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Funktion der Brustdrüsen und sind der Ursprung der meisten Brusttumoren. Das Einschleusen von Genen von Interesse in Brustepithelzellen von Mäusen ist ein entscheidender Schritt bei der Evaluierung der Genfunktion in Epithelzellen und der Erstellung von Mammatumormodellen der Maus. Dieses Ziel kann durch die intraduktale Injektion eines viralen Vektors, der die interessierenden Gene in den duktalen Brustbaum der Maus trägt, erreicht werden. Das injizierte Virus infiziert anschließend Brustepithelzellen und bringt die interessierenden Gene ein. Der virale Vektor kann lentiviral, retroviral, adenoviral oder Adenovirus-assoziiertes Virus (AAV) sein. Diese Studie zeigt, wie ein interessantes Gen durch intraduktale Injektion eines viralen Vektors in Brustepithelzellen der Brust eingeschleust wird. Ein Lentivirus, das GFP trägt, wird verwendet, um eine stabile Expression eines transportierten Gens zu zeigen, und ein Retrovirus, das Erbb2 (HER2/Neu) trägt, wird verwendet, um onkogeninduzierte atypische hyperplastische Läsionen und Mammatumoren nachzuweisen.

Repräsentative Daten werden hier präsentiert, um die erfolgreiche intraduktale Injektion, die erfolgreiche Virusinfektion und den Einfluss der gelieferten Gene auf die Entstehung von Mammatumoren zu demonstrieren. Die Menge des injizierten Virus muss auf den Zweck des jeweiligen Experiments abgestimmt sein. Um zu veranschaulichen, wie umfangreich der Milchgangbaum infiziert sein kann, muss eine große Menge an abgebildeten Virus-tragenden Genen wie GFP verwendet werden. Um die natürliche spontane Tumorgenese nachzuahmen, ...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die intraduktale Injektion von viralen Vektoren über die Zitze, um Gene von Interesse in die Brustepithelzellen einzuschleusen.

Im lebenden Organismus Gentransfer in Brustepithelzellen der Maus durch intraduktale Injektion in der Brust

Mouse mammary glands comprise ductal trees, which are lined by epithelial cells and have one opening at the tip of each nipple. The epithelial cells play ...

Bei dieser Methode wird das Erbgut auf spezielle, temporäre und quantitativ kontrollierbare Weise in die Epithelzellen der Brustdrüse eingebracht. Da die Einschleusung von genetischem Material in die Brustepithelzellen speziell, temporär und quantitativ kontrolliert wird, ahmen die mit dieser Methode erzeugten Brustmodelle die natürliche Tumorentstehung besser nach. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der Spritze, indem Sie die 33-Gauge-Nadeln aus Metall auf etwa einen Zentimeter Länge schneiden und in Alkohol lagern.Entfernen Sie Spritzen und Nadeln aus dem Alkohol und drücken Sie den restlichen Alkohol aus der Spritze und den Nadeln. Zerlegen Sie dann die Spritze zum Trocknen an der Luft. Setzen Sie die Spritze nach dem Trocknen zusammen.Nehmen Sie die viralen Vorratsröhrchen aus dem minus 80 Grad Celsius heißen Gefrierschrank und tauen Sie sie auf Eis auf. Um Bromphenolblau hinzuzufügen, tauchen Sie die Pipettenspitze bis zu einer Tiefe von einem Zentimeter in das Bromphenolblaupulver. Bringen Sie dann die angehängte Spurenmenge Bromphenolblau in die Virussuspension.Mischen Sie das Bromphenolblau mit der Viruslösung, indem Sie es 10 Mal auf und ab pipettieren, bevor Sie das Virus

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Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video beschreibt eine intraduktale Injektionstechnik, bei der wir Injektionsmischung in die Kanäle der Brustdrüsen von Mäusen einbringen.

Intraduktale Injektion: Abgabe der Injektionsmischung in die Kanäle der Brustdrüse der Maus

Ein Protokoll für die nicht-invasive intraductal Lieferung von wässrigen Reagenzien zu der Brustdrüse der Maus beschrieben. Die Methode nutzt lokalisierte Injektion in den Brustwarzen der Brustdrüsen Targeting Milchgänge speziell. Diese Technik ist für eine Vielzahl von Verbindungen, einschließlich siRNA, chemotherapeutischen Mitteln und kleinen Molekülen anpaßbar.

Intraduktale Injection für Lokalisierte Drug Delivery auf die Maus Milchdrüse

Die Aktivierung von latenten Mutationen mit Adenovirus-Cre im duktalen System der Brust führt zu einem klinisch relevanten metastasierten Brustkrebs. Der Einbau eines YFP-Promotors ermöglicht die Verfolgung von distalen metastasierten Tumorzellen. Dieses Modell ist nützlich, um latente Metastasen und Anti-Tumor-Immunität zu untersuchen und neuartige Immuntherapien zur Behandlung von Brustkrebs zu entwickeln.

Initiation Metastasierende Mammakarzinom durch Targeting des duktalen Epithel mit Adenovirus-Cre: Eine neue transgene Maus-Modell der Brustkrebs

Krebs ist eine komplexe Erkrankung, die durch den den Tumor umgebenden Gewebes sowie lokale pro- und anti-inflammatorischen Mediatoren beeinflusst wird. Daher kann orthotrope Pritzer, anstatt subkutanen Modellen nützlich sein, um Krebsprogression in einer Weise, dass eine bessere ahmt menschlichen Pathologie studieren.

Orthotopische Injektion von Brustkrebszellen in das Brustfettpolster von Mäusen, das Tumorwachstum zu studieren.

Hier beschreiben wir eine Technik zur lokalisierten Verabreichung von Reagenzien an die Brustdrüse von Kaninchen über eine intraduktale Injektion. Darüber hinaus beschreiben wir ein Protokoll zur Visualisierung und Bestätigung der Abgabe durch hochauflösende Ultraschallbildgebung von Kontrastmitteln.

Intraduktale Lieferung an die Kaninchen Brustdrüse

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Brustkrebs-Zellen in der Mamma Fettpolster in einer einfachen, weniger invasiv und einfach zu handhabende Möglichkeit, einzupflanzen und dieses orthotopen Brust Krebs Mausmodell mit einer richtigen Mamma Fettlappen Umgebung kann verwendet werden, um verschiedene Aspekte zu untersuchen Krebs.

Orthotopen Injektion von Brustkrebs-Zellen in den Mäusen Mamma Fettlappen

Das Ziel dieses Protokolls ist es, einen neuen Ansatz zur Modellierung von Brustkrebs zu beschreiben, der auf der intraduktiven Injektion von Cre-expressing adenovirus in Maus-Mammary-Drüsen basiert. Dieser Ansatz ermöglicht sowohl eine zelltyp- als auch organspezifische Manipulation onkogener Ereignisse in zeitlich kontrollierter Weise.

Modellierung von Brustkrebs über eine intraduktive Injektion des Cre-expressingAvirus in die Maus-Mammary Drüse

Es wird ein Verfahren der intraduktalen Injektion von Reagenzien für eine ethanolbasierte ablative Lösung in den maktalen Brustbaum der Maus zur In-vivo-Bildgebung und Brustkrebsprävention beschrieben. Die Injektion direkt in die Brustwarzenöffnung ermöglicht das Targeting von Brustepithelzellen mit minimalen Kollateralschäden.

Intraduktale Verabreichung und Röntgenvisualisierung von Ethanol-basierter ablativer Lösung zur Prävention und lokalen Behandlung von Brustkrebs in Mausmodellen

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einfache Technik zur intravitalen Bildgebung der Milchdrüse der laktierenden Maus mittels konfokaler Laserscanning- und Multiphotonenmikroskopie.

Intravitale subzelluläre Mikroskopie der Brustdrüse

Das Manuskript beschreibt eine Methodik für die Etablierung sowie das longitudinale Wachstumsmonitoring von spontanen Lungenmetastasen von orthotopisch injizierten Brusttumoren, die in allen Stadien der Metastasierungskaskade interveniert werden kann.

Im lebenden Organismus Bildgebung zur Messung der spontanen Lungenmetastasierung von orthotopisch injizierten Brusttumorzellen

Dieses Protokoll beschreibt einen skalierbaren intraduktalen CRISPR-Screening-Ansatz, der parallele in vivo Gen-Knockout- und Aktivierungsstudien in der Mammarydrüse der Maus ermöglicht.

Paralleles In vivo-Screening von Gen-Knockout und -Aktivierung in der Mammarisdrüse der Maus

Erfahren Sie die intraduktale Injektion viraler Vektoren zur kontrollierten Gentransfer in Brustepithelzellen der Maus. Diese Methode ermöglicht realistischere Tumormodelle für die Krebsforschung.

Im lebenden Organismus Gentransfer in Brustepithelzellen der Maus durch intraduktale Injektion in der Brust

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