Mikrodissektion und Whole-Mount-Rasterelektronenmikroskopie Visualisierung des Aderhautplexus der Maus

Enge Barrieren trennen das zentrale Nervensystem (ZNS) von der Peripherie, einschließlich der Blut-Hirn-Schranke (BHS) und der Blut-Liquor-Schranke (Liquor). Diese Barrieren schützen das ZNS vor äußeren Beleidigungen und sorgen für eine ausgewogene und kontrollierte Mikroumgebung ^1,2,3. Während die BHS im Laufe der Zeit ausgiebig untersucht wurde, hat die Blut-Liquor-Schranke am Plexus choroideus (CP) erst in den letzten zehn Jahren an Forschungsinteresse gewonnen. Diese letztere Barriere befindet sich in den vier Ventrikeln des Gehirns (Abbildung 1A, B) und ist gekennzeichnet durch eine einzelne Schicht von CPE-Zellen (Aderhautplexus-Epithelzellen), die ein zentrales Stroma, undichte Kapillaren, Fibroblasten und eine lymphatische und myeloische Zellpopulation umgeben (Abbildung 1C)^4,5,6. Die CPE-Zellen sind durch Tight Junctions fest miteinander verbunden und verhindern so ein Austreten aus den darunter liegenden gefensterten Blutkapillaren in den Liquor und das Gehirn. Darüber hinaus wird der Transport durch die CPE-Zellen durch eine Reihe von ein- und ausgehenden Transportsystemen reguliert, die den Zustrom nützlicher Verbindungen (z. B. Nährstoffe und Hormone) aus dem Blut in den Liquor und den Ausfluss schädlicher Moleküle (z. B. Stoffwechselabfälle, überschüssige Neurotransmitter) in die andere Richtung steuern ^1,6. Um ihre aktive Transportfunktion ausüben zu können, enthalten die CPE-Zellen zahlreiche Mitochondrien in ihrem Zytoplasma⁷. Darüber hinaus ist der CP die Hauptquelle für Liquor und fungiert durch das Vorhandensein residenter Entzündungszellen als Torwächter des Gehirns¹. Aufgrund seiner einzigartigen Lage zwischen Blut und Gehirn ist der CP auch perfekt positioniert, um eine Immunüberwachung durchzuführen⁸.

Abbildung 1: Schematische Übersicht über die Lage und Zusammensetzung des Plexus choroideus (CP). (A,B) CP-Gewebe befindet sich in den beiden lateralen, dem dritten und vierten Ventrikel von (A) menschlichen und (B) Mausgehirnen. (C) Das CP-Gewebe besteht aus einer einzigen Schicht eng verbundener quaderförmiger CP-Epithelzellen (CPE), die gefensterte Kapillaren, lockeres Bindegewebe sowie lymphatische und myeloische Zellen umgeben, und bildet die Blut-Liquor-Schranke (angepasst und modifiziert ab Referenz²³). Figur erstellt mit Biorender.com. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

In den letzten zehn Jahren haben immer mehr Beweise, darunter mehrere Berichte unserer Forschungsgruppe, gezeigt, dass die CP eine zentrale Rolle bei Gesundheit und Krankheit spielt. 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . So ist beispielsweise bekannt, dass die alternde Blut-Liquor-Schranke morphologische Veränderungen unter anderem in den Zellkernen, Mikrovilli und der Basalmembran aufweist ^1,19. Darüber hinaus ist im Zusammenhang mit der Alzheimer-Krankheit die allgemeine Barriereintegrität beeinträchtigt und all diese altersbedingten Veränderungen scheinen noch ausgeprägter zu sein ^1,8,20. Zusätzlich zu den morphologischen Veränderungen sind das Transkriptom, das Proteom und das Sekretom des CP während der Erkrankung verändert ^12,21,22,23. Daher ist ein fortgeschrittenes Wissen über die CP unerlässlich, um ihre Rolle bei neurologischen Erkrankungen besser zu verstehen und möglicherweise neue therapeutische Strategien zu entwickeln.

Eine effiziente Methode zur genauen Mikrodissektion des CP aus den Hirnventrikeln ist der erste unschätzbare Schritt, um eine ordnungsgemäße Untersuchung dieser winzigen Gehirnstruktur zu ermöglichen. Aufgrund seiner stark vaskularisierten Beschaffenheit (Abbildung 2B) kann der CP, der in den Ventrikelhöhlen des Gehirns schwimmt, mit einem binokularen Mikroskop identifiziert werden. Für die nachgelagerte Analyse ist jedoch häufig eine transkardiale Perfusion erforderlich, was die korrekte Identifizierung und Isolierung des CP-Gewebes erschwert (Abbildung 2C). Wenn es die weiteren Verarbeitungsschritte zulassen (z.B. bei RNA- und Proteinanalysen), kann der CP über eine transkardiale Perfusion mit Bromphenolblau visualisiert werden (Abbildung 2A). Mehrere Veröffentlichungen beschreiben bereits die Isolierung des CP aus Rattengehirnen²⁴ und Mäusewelpen²⁵. In dieser Arbeit wird eine Mikrodissektions-Isolationstechnik beschrieben, um den CP aus erwachsenen Mäusen zu isolieren. Wichtig ist, dass diese Isolationstechnik die Lebensfähigkeit, Funktion und Struktur der Zellen innerhalb des CP bewahrt. Die Isolierung des im vierten und lateralen Ventrikel schwimmenden CP wird hier beschrieben. Kurz gesagt, die Mäuse werden unheilbar betäubt und bei Bedarf transkardiale Perfundierte durchgeführt. Es ist jedoch zu beachten, dass die Perfusion die Struktur der Zellen innerhalb des CP schädigen kann. Wenn die Probe mit Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), serieller Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie (SBF-REM) oder fokussiertem Ionenstrahl-SEM (FIB-REM) analysiert werden soll, sollte daher keine Perfusion durchgeführt werden. Als nächstes wird das gesamte Gehirn isoliert und eine Zange verwendet, um das Gehirn sagittal zu halbisieren. Von hier aus können die in den Seitenventrikeln schwimmenden CPs identifiziert und präpariert werden, während die CPs aus dem vierten Ventrikel von der Kleinhirnseite des Gehirns isoliert werden können.

Abbildung 2: Darstellung des (A-C) vierten und (D-F) lateralen Ventrikelplexus choroideus (CP) nach (A,D)-Bromphenolblau-Perfusion, (B,E) keiner Perfusion und (C,F)-Perfusion mit PBS/Heparin. Die Bilder werden mit einem Stereomikroskop (8x-32-fache Vergrößerung) aufgenommen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Sobald der CP richtig aus den Hirnventrikeln herauspräpariert ist, kann ein ganzes Repertoire an Techniken angewendet werden, um die Funktion dieser Struktur besser zu verstehen. Beispielsweise kann eine Durchflusszytometrie oder Einzelzell-RNA-Sequenzierung durchgeführt werden, um die infiltrierenden Entzündungszellen unter bestimmten Krankheitsbedingungen zu quantifizieren und phänotypisch zu analysieren^26,27. Zusätzlich zur zellulären Zusammensetzung kann die molekulare Zusammensetzung des CP analysiert werden, um das Vorhandensein von Zytokinen und Chemokinen über den Enzyme-linked Immunosorbent Assay (ELISA), Immunoblot oder durch gleichzeitige Analyse mehrerer Zytokine unter Verwendung des Zytokin-Bead-Arrays²⁸ zu beurteilen. Darüber hinaus können Transkriptom-, Gefäß-, Immunzell-Histologie- und Sekretomanalysen an den mikropräparierten CP-Explantaten^{durchgeführt werden 29}. Hier wird die Rasterelektronenmikroskopie (REM) am gesamten CP eingesetzt, um einen Gesamtüberblick über die CP-Struktur zu erhalten. Das REM verwendet einen Strahl fokussierter Elektronen, um die Oberfläche abzutasten und ein Bild der Topographie und Zusammensetzung der Oberfläche zu erstellen. Da die Wellenlänge von Elektronen viel kleiner ist als die von Licht, liegt die Auflösung des REM im Nanometerbereich und ist der eines Lichtmikroskops überlegen. Folglich können morphologische Untersuchungen auf subzellulärer Ebene mittels REM durchgeführt werden. Kurzzeitig wird das präparierte CP sofort in ein glutaraldehydhaltiges Fixiermittel für eine nächtliche Fixierung überführt, gefolgt von Osmication und Uranylacetat-Färbung. Die Proben werden dann mit Blei-Aspartat-Färbung behandelt, dehydriert und schließlich für die Bildgebung eingebettet.

Somit ermöglicht dieses Protokoll die effiziente Isolierung des CP aus den Hirnventrikeln der Maus, die mit einer Vielzahl von nachgeschalteten Techniken weiter analysiert werden können, um seine Struktur und Funktion zu untersuchen.

Alle in dieser Studie beschriebenen Tierversuche wurden gemäß den nationalen (belgisches Gesetz vom 14.08.1986 und 22.12.2003, belgisches Königliches Dekret vom 06.04.2010) und europäischen Rechtsvorschriften (EU-Richtlinien 2010/63/EU, 86/609/EWG) durchgeführt. Alle Versuche an Mäusen und Tierprotokollen wurden von der Ethikkommission der Universität Gent genehmigt (Genehmigungsnummern LA1400091 und EC 2017-026).

1. Vorbereitung

1. Anästhetika: Bereiten Sie ein Endanästhetikum vor. Beispielsweise kann eine Natrium-Pentobarbital-Lösung (≥100 mg/kg) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) hergestellt werden.
2. Transkardiale Perfusionslösung: Bereiten Sie 10 ml (pro Maus) PBS/Heparin-Lösung (mit 0,2 % Heparin) vor, die mit 0,5 % Bromphenolblau ergänzt wird.
   HINWEIS: Wenn es die nachgelagerten Verarbeitungsschritte zulassen (z. B. bei RNA- und Proteinanalysen), kann der Plexus choroideus (CP) über eine transkardiale Perfusion mit Bromphenolblau dargestellt werden. Wenn Bromphenolblau mit den weiteren Verarbeitungsschritten (z. B. für die Bildgebung) nicht verträglich ist, verwenden Sie PBS/Heparin zum Perfundieren.
3. Bereiten Sie die für die REM-Analyse erforderlichen Lösungen vor.
   1. 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer (pH 7,4) herstellen. Bereiten Sie eine Lösung aus 2 % Paraformaldehyd und 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Na-Cacodylatpuffer vor. Stellen Sie 20 ml dieser Lösung pro Probe her.
   2. Bereiten Sie 2%iges Osmiumtetroxid in 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer (5 ml pro Probe) vor.
   3. Bereiten Sie 50 %, 70 %, 85 % und 100 % EtOH-Lösungen vor. Bereiten Sie 5 ml jeder EtOH-Lösung pro Probe vor.

2. Mikrodissektion des Plexus choroideus aus dem lateralen und vierten Ventrikel

HINWEIS: In dieser Studie wurden weibliche, 9 Wochen alte C57BL/6-Mäuse verwendet. Die beschriebene Isolationstechnik ist jedoch unabhängig von der Belastung, dem Geschlecht und dem Alter der erwachsenen Maus.

1. Isolieren Sie das Gehirn der Maus.
   1. Intraperitoneal wird eine tödliche Dosis eines kurzwirksamen Barbiturats (>100 mg/kg, hergestellt in Schritt 1.1) mit einer 26G-Nadel injiziert, um die Maus terminal zu betäuben. Überprüfe den Fußreflex der Maus, indem du ihre Hinterpfote mit einer Pinzette kneifst.
   2. Wenn kein Fußreflex vorhanden ist, bringen Sie das unheilbar betäubte Tier in die dorsale Dekubitusposition und fixieren Sie die Maus, indem Sie die Gliedmaßen auf eine Platte stecken.
      HINWEIS: Wenn eine transkardiale Perfusion der Mäuse je nach nachgeschalteter Analysemethode (z. B. für die REM-Bildgebung) nicht erforderlich ist, fahren Sie mit Schritt 2.1.7 fort. Wenn jedoch eine Perfusion erforderlich ist, um Blutzellen oder andere Bestandteile im Blut zu entfernen, kann der CP als blaue Struktur dargestellt werden, die durch die Perfusion mit Bromphenolblau in den Hirnventrikeln schwimmt.
   3. Desinfizieren Sie die Brust, indem Sie 70% Ethanol aufsprühen. Legen Sie ein steriles Tuch um den Operationsbereich. Machen Sie einen Schnitt von ~4 cm direkt unter der Membran mit einer chirurgischen Klinge aus Kohlenstoffstahl (siehe Materialtabelle).
   4. Öffnen Sie die Haut und legen Sie den Brustkorb mit einer chirurgischen Schere frei. Schneiden Sie die Membran vollständig auf.
   5. Trennen Sie den Brustkorb, um die Lunge und das schlagende Herz freizulegen.
   6. Die Mäuse werden mit einer Perfusionspumpe transkardialerweise mit 10 ml der Perfusionslösung mit einer Rate von 4,5 ml/min perfundiert (siehe Materialtabelle). Die Perfusion dauert ~2 min. Führen Sie eine 26G-Nadel in die linke Herzkammer ein, um die Lösung in den Systemkreislauf zu pumpen. Machen Sie außerdem mit einer chirurgischen Schere einen Schnitt in den rechten Vorhof, damit das Blut aus dem Kreislauf abfließen kann.
      HINWEIS: Eine Perfusionspumpe wird der manuellen Verabreichung der Flüssigkeit vorgezogen, da sie die Flüssigkeiten mit einer genau programmierten Geschwindigkeit fördert und sicherstellt, dass die durch die Perfusion verursachten Scherkräfte nicht zu stark sind. Übermäßige Scherkräfte beeinträchtigen die Lebensfähigkeit und Struktur der Zellen innerhalb des CP. Darüber hinaus ist die hier empfohlene Perfusionsflussrate optimal, um erwachsene Mäuse ab 7 Wochen zu perfundieren. Wenn jüngere Mäuse verwendet werden, sollte eine geringere Flussrate verwendet werden. Es ist auch wichtig, das Blut, das aus dem rechten Vorhof austritt, abzutupfen, um eine saubere Operationsstelle zu erhalten.
   7. Enthaupte die Maus.
      Anmerkungen: Achten Sie darauf, den Kopf so tief wie möglich zur Schulter abzuschneiden, um die Gehirnstruktur zu erhalten. Ist der Schnitt zu hoch, kann das Kleinhirn geschädigt werden.
   8. Schneiden Sie nach der Enthauptung die Kopfhaut auf, indem Sie einen Schnitt zwischen den Ohren machen, der über den Augen liegt. Ziehe die Haut seitlich heraus, um den Schädel freizulegen. Schneiden Sie dann den Schädel auf, indem Sie den Plattenepithelnähten in Richtung des Nasenteils folgen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, den Schädel vorsichtig zu entfernen, um die Integrität des Gehirns zu erhalten.
   9. Legen Sie das Gehirn in eine eiskalte Petrischale und geben Sie 1 ml eiskaltes 1x PBS auf das Hirngewebe.
      Anmerkungen:Eine Beschichtung der Schale ist nicht erforderlich.
2. Isolieren Sie den CP, der im vierten Ventrikel schwimmt.
   1. Schneiden Sie das Kleinhirn vorsichtig mit einem Skalpell vom Großhirn ab. Das Großhirn ist der größte Teil des Gehirns, während das Kleinhirn ein viel kleinerer Teil im hinteren Teil des Gehirns ist. Falls erforderlich, entfernen Sie verbleibende Teile des Hirnstammgewebes aus dem Kleinhirn.
   2. Drehen Sie das Gehirn so, dass die Schnittlinie nach oben zeigt. Stellen Sie sicher, dass die vierte Ventrikelhöhle nun in der Mitte des Schnitts sichtbar ist und der CP an der dorsalen Stelle schwimmt. Öffne bei Bedarf die Herzkammer ein wenig, indem du das Bindegewebe mit einer scharfen Pinzette aufziehst. Auf diese Weise wird der CP besser sichtbar und leichter zu erreichen.
   3. Reißen Sie den CP vorsichtig mit einer winzigen scharfen Pinzette aus der Ventrikelwand.
      HINWEIS Es ist wichtig, den CP in diesem Schritt nur zu berühren und herauszunehmen, um die Probe nicht mit dem umgebenden Gewebe zu kontaminieren. Das Öffnen der Herzkammern, wie in Schritt 2.2.2 beschrieben, erleichtert Schritt 2.2.3.
3. Isolieren Sie den CP, der aus dem lateralen Ventrikel herausragt.
   1. Verwenden Sie eine winzige scharfe Pinzette, um das Gehirn sagittal in zwei Hemisphären zu schneiden.
   2. Drehen Sie das Gehirn so, dass die Schnittlinie nach oben zeigt. Um den seitlichen Ventrikel freizulegen, ziehen Sie die Hirnrinde vorsichtig vom Thalamus weg.
   3. Ziehen Sie den Hippocampus bis zur mittelsagittalen Schnittlinie zurück. Der laterale Ventrikel ist nun sichtbar, wobei der CP am unteren Ende des Ventrikels liegt. Öffne bei Bedarf die Herzkammer ein wenig, indem du das Bindegewebe mit einer scharfen Pinzette aufziehst. Auf diese Weise wird der CP besser sichtbar und leichter zu erreichen.
   4. Verwenden Sie eine winzige scharfe Pinzette, um den CP vorsichtig aus der Ventrikelwand zu reißen.
      HINWEIS: Es ist wichtig, den CP in diesem Schritt nur zu berühren und herauszunehmen, um die Probe nicht mit dem umgebenden Gewebe zu kontaminieren. Das Öffnen der Herzkammern, wie in Schritt 2.3.4 beschrieben, erleichtert Schritt 2.3.5. Seien Sie in diesem Schritt vorsichtig, um die Struktur des CP so weit wie möglich zu erhalten. Am einfachsten ist es, den CP in rostraler bis kaudaler Richtung zu ziehen.

3. Morphologische Analyse von CP-Gewebe mittels Rasterelektronenmikroskopie (REM)

ACHTUNG: In den folgenden Verarbeitungsschritten werden toxische Lösungen verwendet. Es wird empfohlen, die Probenvorbereitung in einem Abzug durchzuführen.

1. Führen Sie die Probenvorbereitung für das REM wie unten beschrieben durch.
   1. Das frisch isolierte CP wird in eine frisch hergestellte Fixierungslösung mit 2 % Paraformaldehyd und 2,5 % Glutaraldehyd in 0,1 M Na-Cacodylatpuffer (pH 7,4) überführt. Über Nacht bei 4 °C inkubieren.
      Anmerkungen: Da das CP-Gewebe sehr zerbrechlich und dünn ist, sollte das Gewebe in kleine Probenkörbe (siehe Materialtabelle) gegeben werden, um es zwischen den Puffern zu transferieren. Auf diese Weise wird die Struktur des Gewebes besser erhalten. Ein Fixiermittel auf Cacodylatbasis wird einem Fixiermittel auf PBS-Basis vorgezogen, da der starke Cacodylatpuffer dem niedrigen pH-Wert von Glutaraldehyd im EM-Fixiermittel entgegenwirken kann.
   2. Waschen Sie die Probe 3x für je 5 min mit 3-5 mL 0,1 M Na-Cacodylatpuffer (pH 7,4).
   3. Die Proben werden in 3-5 ml 2%igem Osmiumtetroxid in 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer für 30 min fixiert. Waschen Sie die Proben 3x für jeweils 5 min mit 3-5 ml Reinstwasser.
   4. Die Proben werden in einer Reihe von eiskalten Lösungen mit steigenden EtOH-Konzentrationen (50 %, 70 %, 85 %, 100 %) für 15 Minuten pro EtOH-Lösung dehydriert. Verwenden Sie einen Trockner an kritischen Punkten, um die Probe ordnungsgemäß zu trocknen.
      HINWEIS Der Wechsel von der flüssigen zur gasförmigen Phase wirkt sich auf die Oberflächenspannung aus und verursacht Schäden an der Oberflächenstruktur. Der Trocknungsschritt am kritischen Punkt ermöglicht die Erhaltung der Oberflächenstruktur.
   5. Positionieren Sie die Probe vorsichtig auf einer Probenhalterung, die mit einem Kohleaufkleber versehen ist (siehe Materialtabelle).
   6. Beschichten Sie die Proben mit einer dünnen Schicht (2-5 nm) Platin. Montieren Sie dazu eine Platinquelle in einem Vakuumsystem zwischen zwei elektrischen Hochstromklemmen und erhitzen Sie das Platin auf seine Verdampfungstemperatur. Ein feiner Platinstrahl wird auf der Probe abgeschieden.
      HINWEIS: Ein detaillierteres Protokoll für diesen Schritt finden Sie in Referenz³⁰. Neben Platin kann auch Gold oder Gold/Palladium verwendet werden.
2. Visualisieren Sie die CP-Proben mit REM (siehe Materialtabelle). Die Visualisierung von CP-Gewebe mittels REM ähnelt der anderer Gewebetypen und ist abhängig von der verwendeten Software und den Instrumenten. Ein Schritt-für-Schritt-REM-Protokoll mit begleitendem Video ist in Referenz³¹ oder^{Referenz 30} verfügbar.

Das beschriebene Protokoll ermöglicht die effiziente Isolierung des CP aus dem lateralen (Abbildung 2A-C) und vierten (Abbildung 2D-F) Ventrikel des Maushirns. Nach der Isolierung des gesamten Gehirns wird eine Pinzette verwendet, um das Gehirn sagittal zu hemisectieren und die in den Seitenventrikeln schwimmenden CPs zu identifizieren. Der CP aus dem vierten Ventrikel kann von der Kleinhirnseite des Gehirns isoliert werden. Die Perfusion mit Bromphenolblau kann zur Visualisierung des CP verwendet werden (Abbildung 2A,D); Wenn Bromphenolblau jedoch in den weiteren Verarbeitungsschritten nicht zugelassen ist, kann eine Perfusion mit PBS/Heparin (Abbildung 2C,F) oder keine Perfusion (Abbildung 2B,E) durchgeführt werden. Nach der Isolierung des CP aus den Hirnventrikeln kann ein ganzes Repertoire an Analysen am Gewebe durchgeführt werden. Dazu gehören die Erstellung von Genexpressionsprofilen (RT-qPCR)28, die Erstellung von Zelltypprofilen (Durchflusszytometrie32, Einzelzell-RNA-Sequenzierung26,27) und der Nachweis von Zytokinen und Chemokinen 28mittels ELISA, Immunoblot oder Multiplex-Immunoassays. Darüber hinaus kann das mikrodissektierte CP in Kultur gebracht werden, um CP-Explantaten herzustellen, um die Funktion weiter aufzuklären und beispielsweise sein Sekretom als Reaktion auf einen spezifischen Stimulus zu untersuchen23,28,29. In diesem Manuskript beschreiben wir, wie man Rasterelektronenmikroskopie (REM) durchführt, um die Oberfläche von Epithelzellen des Plexus choroideus (CPE) morphologisch zu analysieren. Abbildung 3 zeigt Übersichtsbilder des aus dem vierten Ventrikel isolierten CP (Abbildung 3A) und des aus dem lateralen Ventrikel isolierten CP (Abbildung 3B), die mittels REM aufgenommen wurden. Diese Bilder zeigen deutlich die typische C-förmige Form des lateralen CP und die zweiarmige Struktur des vierten Ventrikels CP. 

Abbildung 3: Übersicht über die Rasterelektronenmikroskopie (REM) des präparierten Gewebes des Plexus choroideus (CP). (A,B) Repräsentatives REM-Bild des CP, isoliert aus dem (A) vierten und (B) lateralen Ventrikel des Mäusegehirns. Maßstabsleiste = 100 μm. Einstellungen: Elektronenhochspannung (EHT) = 5,00 kV; Arbeitsabstand (WD) = 4,8 mm Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Durch Heranzoomen an die CPE-Zellen können andere Zellen auf der apikalen Seite der CPE-Zellen erkannt werden (Abbildung 4A). Bei der auf dem Bild eingefangenen Zelle handelt es sich möglicherweise um eine Epiplexuszelle, eine makrophagenähnliche Zelle, die sich auf der apikalen Oberfläche des CP befindet. Es ist jedoch nicht möglich, die spezifische Beschaffenheit dieser Zelle mittels REM zu identifizieren. Zusätzlich zur REM-Bildgebung ist es möglich, eine Zwei-Photonen-Bildgebung des Epithels des Plexus choroideus in lebenden Explantaten durchzuführen, wie Shipley et al.29 gezeigt haben. Während das REM die Visualisierung von Oberflächenstrukturen des CP erleichtert, kann die Zwei-Photonen-Bildgebung die Visualisierung eines breiten Spektrums von Zellen und zellulären Prozessen ermöglichen, solange diese fluoreszenzüberwacht werden können. Dazu gehört die Visualisierung von Gefäß- und Immunzellen sowie der sekretorischen Ereignisse im CP-Explantat29.

Eine höhere REM-Vergrößerung zeigte vesikelartige Strukturen auf der apikalen Seite von CPE-Zellen (Abbildung 4B) sowie Mikrovilli (Abbildung 4C). Diese Mikrovilli ragen in den Liquor cerebrospinalis (CSF) und vergrößern die CPE-Zelloberfläche zwischen den Zellen und dem Liquor. Diese Ergebnisse zeigen, dass die morphologischen Veränderungen der CPE-Zellen unter Krankheitsbedingungen mit Hilfe von REM untersucht werden können.

Abbildung 4: Detaillierte Rasterelektronenmikroskopie (REM)-Aufnahmen von Gewebe des Plexus choroideus (CP ). (A) Eine Zelle auf der apikalen Seite von CPE-Zellen (Aderhautplexus-Epithelzellen). Maßstabsbalken = 2 μm. (B) Vesikelartige Strukturen auf der apikalen Seite von CPE-Zellen. Maßstabsbalken = 10 μm. (C) Visualisierung einer CPE-Zelloberfläche mit ihren Mikrovilli. Maßstabsleiste = 1 μm. Einstellungen: Elektronenhochspannung (EHT) = 5,00 kV; Arbeitsabstand (WD) = 4,9 mm; 3.000-fache Vergrößerung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Autoren haben nichts zu verraten.