Methodenartikel

Erforschung von X-Chromosomen-Aberrationen in Ovarialzellen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung

DOI:

10.3791/64734

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7. April 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Radboudumc, 2Department of Pediatrics, Radboudumc, Amalia Children’s Hospital, 3Department of Reproductive Medicine, Nij Geertgen Center for Fertility

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In diesem Artikel werden zwei Methoden vorgestellt, die auf der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung basieren, um den X-chromosomalen Gehalt von Ovarialzellen in nicht transplantiertem und transplantiertem Ovarialrindengewebe von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu bestimmen.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Millionen von Menschen weltweit beschäftigen sich mit Fragen der Fruchtbarkeit. Eine verminderte Fruchtbarkeit oder sogar Unfruchtbarkeit kann auf viele verschiedene Ursachen zurückzuführen sein, einschließlich genetischer Störungen, von denen Chromosomenanomalien die häufigsten sind. Die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) ist eine bekannte und häufig eingesetzte Methode zum Nachweis von Chromosomenaberrationen beim Menschen. FISH wird hauptsächlich für die Analyse von Chromosomenanomalien in den Spermien von Männern mit numerischen oder strukturellen Chromosomenaberrationen verwendet. Darüber hinaus wird diese Technik auch häufig bei Frauen angewendet, um X-Chromosomenaberrationen zu erkennen, von denen bekannt ist, dass sie eine ovarielle Dysgenesie verursachen. Es fehlen jedoch noch Informationen über den X-Chromosomen-Gehalt von Eierstockzellen von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen in Lymphozyten und/oder Wangenzellen.

Ziel dieser Studie ist es, die Grundlagenforschung zu X-Chromosomenaberrationen bei Frauen voranzutreiben, indem zwei auf FISH basierende Methoden zur Bestimmung des X-chromosomalen Gehalts von Ovarialzellen vorgestellt werden. Zunächst wird eine Methode beschrieben, mit der der X-Chromosomengehalt von isolierten Ovarialzellen (Eizellen, Granulosazellen und Stromazellen) in nicht transplantiertem Ovarialrindengewebe von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen bestimmt werden kann. Die zweite Methode zielt darauf ab, die Wirkung von Chromosomenaberrationen auf die Follikulogenese zu bewerten, indem der X-Chromosomengehalt von Eierstockzellen neu gebildeter sekundärer und antraler Follikel im Eierstockgewebe von Weibchen mit X-Chromosomenaberrationen nach Langzeittransplantation in immungeschwächte Mäuse bestimmt wird. Beide Methoden könnten in der zukünftigen Forschung hilfreich sein, um Einblicke in das Fortpflanzungspotenzial von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu erhalten.

Einleitung

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Unfruchtbarkeit ist ein Gesundheitsproblem des männlichen oder weiblichen Fortpflanzungssystems, von dem weltweit etwa 186 Millionen Menschen im gebärfähigen Alter betroffen sind1. Bei mindestens 35 % der unfruchtbaren Paare wird die Unfruchtbarkeit durch eine Störung des weiblichen Fortpflanzungssystems verursacht2. Es gibt viele Faktoren, die weibliche Unfruchtbarkeit verursachen können, wie z. B. genetische Faktoren, Anomalien des Genitaltrakts, endokrine Dysfunktion, entzündliche Erkrankungen und iatrogene Behandlung3.

Genetische Anomalien liegen bei etwa 10 % der unfruchtbaren Frauen vor 4,5. Von allen genetischen Anomalien sind X-Chromosomen-Aberrationen die häufigste Ursache für die Ovarialdysgenesie2. Mehrere Studien haben berichtet, dass X-Chromosomenaberrationen bei Frauen mit Turner-Syndrom (TS) oder Triple-X-Syndrom mit vorzeitiger Ovarialinsuffizienz aufgrund eines beschleunigten Verlusts von Keimzellen oder einer gestörten Oogenese assoziiert sind 6,7,8.

Aberrationen des X-Chromosoms können unterteilt werden in: 1) numerische Aberrationen, bei denen die Anzahl der X-Chromosomen unterschiedlich ist, aber die X-Chromosomen intakt sind; und 2) strukturelle Aberrationen, bei denen das X-Chromosom genetisches Material gewonnen oder verloren hat 3,9. Numerische Aberrationen des X-Chromosoms sind häufiger als strukturelle Anomalien und werden häufig durch spontane Fehler bei der Zellteilung verursacht 3,9. Wenn ein solcher Fehler während der Meiose auftritt, kann er zu aneuploiden Gameten und schließlich zu Nachkommen mit Chromosomenaberrationen in allen Zellen führen. Wenn Chromosomendefekte in somatischen Zellen als Folge von Fehlern während der Mitose in frühen Stadien der Ontogenese auftreten, kann dies zu Mosaizismus führen. Bei diesen Personen sind sowohl Zellen mit normalem X-Chromosomengehalt als auch Zellen mit X-Chromosomenaberrationen vorhanden.

In den 1980er Jahren wurde eine zytogenetische Technik namens Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) entwickelt, um spezifische Nukleinsäuresequenzen auf Metaphase- und Interphase-Chromosomen sichtbar zu machen und zu lokalisieren 10,11. Bei dieser Technik werden fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden verwendet, um an eine bestimmte Sequenz im Chromosom zu binden, die dann mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht werden kann.

Heutzutage ist FISH als klinisches Diagnoseinstrument weit verbreitet und gilt als Goldstandard bei der Erkennung von Chromosomenaberrationen10. Im Bereich der Reproduktionsmedizin wurde die FISH-Analyse an Spermien eingesetzt, um Einblicke in den X-chromosomalen Gehalt von Spermien bei Männern mit numerischen oder strukturellen Chromosomenaberrationen in somatischen Zellen zu erhalten12,13,14. Diese Studien zeigten, dass Männer mit Chromosomenaberrationen mit größerer Wahrscheinlichkeit eine höhere Häufigkeit von aneuploiden Spermien in ihrem Sperma aufwiesen als Männer mit normalen Karyotypen12,13,14.

Im Gegensatz zu den Spermien ist nur sehr wenig über den X-chromosomalen Gehalt von Eierstockzellen (einschließlich Eizellen, Granulosa/Theka-Zellen und Stromazellen) bei Personen mit einer Chromosomenaberration sowie über die möglichen Folgen einer Aneuploidie dieser Zellen auf ihr Fortpflanzungspotenzial bekannt. Ein wichtiger Grund für die geringen Informationen über den Karyotyp von Eierstockzellen im Vergleich zu Spermien ist die Tatsache, dass sich Frauen einem invasiven Eingriff wie einer Follikelpunktion oder einer Operation unterziehen müssen, um Eizellen oder Gewebe der Eierstockrinde zu gewinnen. Weibliche Gameten sind daher für Forschungszwecke nur schwer zu beschaffen.

Derzeit wird in den Niederlanden eine Interventionsstudie durchgeführt, um die Wirksamkeit der Kryokonservierung von Eierstockgewebe bei jungen Frauen mit TS15 zu untersuchen. Ein Fragment des Gewebes der Ovarialrinde der Patientin stand zur Verfügung, um den X-chromosomalen Gehalt der Ovarialzellen zu bestimmen16,17. Im Rahmen der Studie wurde eine neuartige Methode entwickelt, die auf FISH von dissoziiertem Ovarialrindengewebe basiert, um festzustellen, ob Chromosomenaberrationen in Ovarialzellen bei Frauen vorhanden sind, die eine Chromosomenaberration in nicht-ovariellen somatischen Zellen wie Lymphozyten oder Wangenzellen aufweisen. Darüber hinaus wurde auch der Effekt der Aneuploidie in Ovarialzellen auf die Follikulogenese bestimmt. Zu diesem Zweck wurde ein etabliertes FISH-Protokoll modifiziert, das die Analyse histologischer Schnitte von Ovarialrindengewebe nach künstlich induzierter Follikulogenese während der Langzeit-Xenotransplantation bei immungeschwächten Mäusen ermöglicht. In dieser Studie stellen wir zwei auf FISH basierende Methoden vor, um den X-chromosomalen Gehalt in Ovarialzellen in nicht transplantiertem und transplantiertem Ovarialrindengewebe bei Frauen mit X-Chromosomenaberrationen zu bestimmen, mit dem Ziel, die Grundlagenforschung zu diesem Thema zu verbessern.

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Protokoll

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Das Studienprotokoll von TurnerFertility wurde vom Zentralausschuss für Forschung am Menschen genehmigt (NL57738.000.16). In dieser Studie wurde das Gewebe der Ovarialrinde von 93 Frauen mit TS gewonnen. Materialien, für die Sicherheitsvorkehrungen erforderlich sind, sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle 1: Sicherheitsvorkehrungen.

MaterialGefahr
EssigsäureSchwere Hautverbrennungen und Reizungen der Atemwege
KollagenaseReizt Augen, Atemwege und Haut
DAPIReizt Augen, Atemwege und Haut
DNase IReizt Augen, Atemwege und Haut
EthanolLeichtentzündlich
FormaldehydGiftig nach Einatmen, Verschlucken und Hautkontakt
Formamid
(in Fluoreszenzsonden)		Kann dem ungeborenen Kind schaden
LiberaseReizt Augen, Atemwege und Haut
MethanolLeicht entzündlich, giftig durch Einatmen, Verschlucken und Hautkontakt
Nonidet P40Reizt die Haut oder die Augen
PepsinReizt Augen, Atemwege und Haut
Proteinase KAtembeschwerden nach dem Einatmen
XylolLeicht entzündlich, giftig nach Einatmen und Hautkontakt. Vermeiden Sie den Kontakt mit den Augen.

Tabelle 1: Materialien, die Sicherheitsvorkehrungen erfordern.

1. FISH auf isolierten einzelnen Zellen der Eierstockrinde

  1. Dissoziation von Gewebe der Ovarialrinde, um einzelne Zellen zu erhalten
    1. Schneiden Sie das kryokonservierte/aufgetaute Gewebe der Eierstockrinde mit einem Skalpell in kleine Stücke von ca. 1 mm x 1 mm x 1 mm.
    2. Die Gewebefragmente werden in 4 ml vorgewärmtem (37 °C) L15-Medium, das 0,1 mg/ml Gewebedissoziationsenzymmischung, 10 μg/ml DNase I und 1 mg/ml Kollagenase I aus C. histolyticum enthält, für maximal 75 Minuten bei 37 °C enzymatisch verdaut. Pipetieren Sie die Verdauungsmischung alle 15 Minuten auf und ab.
    3. Stoppen Sie die enzymatische Verdauung, indem Sie 4 ml kaltes L15 hinzufügen, das mit 10 % fötalem Kälberserum (FBS) ergänzt wird. Waschen Sie das dissoziierte Gewebe einmal mit 8 ml kaltem L15-Medium durch Zentrifugation bei 500 x g und resuspendieren Sie es in 500 μl L15-Medium ohne Vortex, um eine Schädigung der Zellen zu vermeiden.
    4. Die Zellsuspension, die größtenteils einzelne Stromazellen und kleine Follikel (Eizellen, die von einer einzigen Schicht von Granulosazellen umgeben sind) enthält, wird in eine Kunststoff-Petrischale überführt und die Zellsuspension unter einem Stereomikroskop (100-fache Vergrößerung) untersucht.
    5. Nehmen Sie die kleinen Follikel (<50 μm) manuell mit einer 75-μm-Kunststoffpipette auf und übertragen Sie die Follikel in ein Tröpfchen L15-Medium, das mit 10 % FBS bei 4 °C angereichert ist, um die Aggregation von Follikeln zu verhindern. Führen Sie die Follikelentnahme für maximal 30 Minuten durch. Um die Ausbreitung der Follikelzellen vor der FISH-Analyse zu verbessern, werden die gereinigten Follikel in eine Lösung aus 0,06 % Trypsin, 1 mg/ml Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 1 mg/ml Glukose überführt und 20 Minuten bei 37 °C inkubiert.
    6. Mit einer 75-μm-Kunststoffpipette werden die ovariellen Stromazellen aus der Suspension der Kortexzellen gewonnen, wobei besonders darauf zu achten ist, dass eine Kontamination mit kleinen Follikeln vermieden wird.
  2. FISH-Analyse einzelner Eierstockzellen
    1. Die behandelten Ovarialfollikel (empfohlen n = 5-20) mit Trypsin/EDTA/Glukose- oder Stromazellen (n > 1.000) werden in Tröpfchen von 5 μl 0,15 mM KCl/15 μl der phosphatgepufferten Kochsalzlösung (DPBS) von Dulbecco auf einen Objektträger übertragen und 20 min bei 37 °C inkubiert.
    2. Trocknen und fixieren Sie die Objektträger in 300 μl 0,05 mM KCl/7,5 % Essigsäure/22,5 % Methanol für 2 min bei Raumtemperatur (RT). Decken Sie die Objektträger 2 Minuten lang bei RT mit Methanol/Essigsäure (3:1) ab, um die Fixierung abzuschließen.
    3. Stellen Sie 20x Standard-Natriumcitrat (SSC) her, indem Sie 876 g Natriumchlorid und 441 g Trinatriumcitrat-Dihydrat in 5 l destilliertes Wasser geben. Als nächstes fügen Sie 100 ml des 20x SSC zu 900 ml demineralisiertem (Demi-)Wasser hinzu, um 2x SSC zu erhalten. Waschen Sie die Probe in 2x SSC bei 73 °C, bedecken Sie sie mit 100 μl 2%iger Proteinase K und verschließen Sie sie mit einem Deckglas. Inkubieren Sie die Objektträger für 10 min bei 37 °C in der Hybridisierungsstation.
    4. Entfernen Sie das Deckglas und waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in DPBS bei RT. Fixieren Sie die Probe 5 Minuten lang mit 1 % Formaldehyd bei RT. Zu diesem Zeitpunkt ist das Material noch nicht vollständig auf den Objektträgern befestigt und sollte daher nicht auf eine Schüttelplattform gelegt werden.
    5. Waschen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in DPBS bei RT, gefolgt von einer anschließenden Dehydrierung von 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethanol für jeweils 2 Minuten. Trocknen Sie die dehydrierte Probe an der Luft und hybridisieren Sie sie mit fluoreszenzmarkierten Sonden.
    6. Wählen Sie eine zentromerspezifische Sonde für Chromosom X und eine andere chromosomenspezifische zentromerische Sonde als Kontrolle aus, um den X-Chromosomengehalt von Ovarialzellen zu bestimmen. In diesem Fall werden zentromerspezifische Sonden für Chromosom X (CEP X [DXZ1]) direkt markiert mit Fluorochrom SpectrumGreen und Chromosom 18 (CEP 18 [D18Z1]) direkt markiert mit Fluorochrom SpectrumOrange verwendet.
    7. Geben Sie 1 μl CEP X, 1 μl CEP 18 und 18 μl des Hybridisierungspuffers in die Probe und verschließen Sie sie mit einem Deckglas, das auf die Objektträger geklebt wird, um ein Verdampfen der Sonde während der Hybridisierung zu verhindern. Die Objektträger werden zur Denaturierung bei 73 °C für 3 min in die Hybridisierungsstation überführt, gefolgt von der Hybridisierung während einer Inkubation über Nacht bei 37 °C.
    8. Entfernen Sie das Deckglas und den restlichen Kleber nach der Hybridisierung vom Objektträger. Waschen Sie die Objektträger in 0,4x SSC/0,3% Tween-20 bei 72 °C für 2 min, gefolgt von einer Inkubation für 1 min in 2x SSC/0,1% Tween-20 bei RT.
    9. Dehydrieren Sie die Objektträger durch anschließende 2-minütige Inkubationszeit in 70 %, 80 %, 90 % und 100 % Ethanol und trocknen Sie sie im Dunkeln an der Luft. Decken Sie die Objektträger mit einem Eindeckmedium ab, das 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) enthält. Vor der fluoreszenzmikroskopischen Analyse mindestens 10 Minuten bei -20 °C aufbewahren.
  3. Bildgebung
    1. Untersuchen Sie das/die Signal(e) für das X-Chromosom mit einem Fluoreszenzmikroskop, das mit einer Bildverarbeitungssoftware verbunden ist.
      1. Wählen Sie zunächst Fluorochrom-DAPI aus.
        1. Nehmen Sie ein Bild auf, indem Sie "Neue Zelle" auswählen > Live > Capture bei 630-facher Vergrößerung. Es erscheint ein neues Fenster mit dem Schwellenwert. Setzen Sie den blauen Balken des Schwellenwerts auf 0, um den Hintergrund zu minimieren, und den roten Balken auf Maximum (255), um die Signale heller zu machen. Klicken Sie auf Akzeptieren.
        2. Es erscheint ein neues Fenster mit Verbesserung mit einem Vorschlag für dunkler/heller (12), Radius (3) und Tiefe (1). Verwenden Sie die vorgeschlagenen Werte oder passen Sie sie an, wenn Sie nicht zufrieden sind.
      2. Wählen Sie zweitens Fluorochrome SpectrumOrange und klicken Sie auf Aufnehmen.
        1. Setzen Sie den blauen Balken des Schwellenwerts auf 0, um den Hintergrund zu minimieren, und den roten Balken auf Maximum (255), um die Signale heller zu machen. Klicken Sie auf Akzeptieren.
        2. Das Fenster mit der Verbesserung wird mit einem Vorschlag für dunkler/heller (-11), Radius (2,7) und Tiefe (0,6) angezeigt. Verwenden Sie die vorgeschlagenen Werte oder passen Sie sie an, wenn Sie nicht zufrieden sind.
      3. Wählen Sie abschließend Fluorochrome SpectrumGreen aus und klicken Sie auf Capture.
        1. Setzen Sie den blauen Balken des Schwellenwerts auf 0, um den Hintergrund zu minimieren, und den roten Balken auf Maximum (255), um die Signale heller zu machen. Klicken Sie auf Akzeptieren.
        2. Das Fenster mit der Verbesserung wird mit einem Vorschlag für dunkler/heller (0), Radius (3) und Tiefe (0) angezeigt. Verwenden Sie die vorgeschlagenen Werte oder passen Sie sie an, wenn Sie nicht zufrieden sind. Speichern Sie das Bild in einer neu erstellten Datei.
          HINWEIS: Somatische Zellen wurden nur ausgewertet, wenn zwei Signale des Kontrollchromosoms 18 sichtbar waren. In den meisten Eizellen konnte nur ein Signal für jedes Chromosom nachgewiesen werden.
    2. Lagern Sie die Objektträger nach der Analyse im Dunkeln bei 4 °C, um Signalverluste zu vermeiden.

2. FISH auf Paraffinschnitten von transplantiertem Gewebe der Eierstockrinde

HINWEIS: Ein Fragment des kryokonservierten/aufgetauten Gewebes der Ovarialrinde von 18 Frauen mit TS wurde 5 Monate lang in schwer kombinierte immundefiziente (SCID) Mäuse xenotransplantiert. Das Verfahren der Xenotransplantation wurde bereits beschrieben und an der Université Catholique de Louvain (Brüssel, Belgien) gemäß den lokalen Richtlinien des Ausschusses für Tierversuche zum Tierschutz durchgeführt (Referenz 2014/UCL/MD/007)18,19.

  1. Selektion von Abschnitten des xenotransplantierten Gewebes der Eierstockrinde, das Follikel enthält
    1. Fixieren Sie xenotransplantiertes Gewebe der Eierstockrinde in 4% Formaldehyd und betten Sie das Gewebe in Paraffin ein. Schneiden Sie die Blöcke mit einem Skalpell ab, um überschüssiges Paraffin zu entfernen, und schneiden Sie den Paraffinblock auf einem Rotationsmikrotom auf eine Dicke von 4 μm.
    2. Wählen Sie jeden siebten Abschnitt des Paraffinbandes für die Hämatoxylin- und Eosinfärbung (HE) aus, um zu bestimmen, welche Abschnitte Follikel enthalten. Legen Sie den Schnitt in ein Wasserbad bei 40-45 °C und montieren Sie ihn auf immunhistochemische Objektträger.
  2. Entparaffinierung und HE-Färbung
    1. Stellen Sie die Objektträger für 10 Minuten bei 60 °C auf einen Herd und tauchen Sie die Objektträger anschließend 5 Minuten lang in 100%iges Xylol. Es ist nicht notwendig, die Objektträger direkt auf den Herd zu legen. Hydratisieren Sie die Abschnitte 15 s lang in 100 % Ethanol, gefolgt von 2 x 15 s in 96 % Ethanol. Spülen Sie die Objektträger 2 Minuten lang mit Leitungswasser ab.
    2. Färben Sie die Objektträger 10 Minuten lang in Hämatoxylin und spülen Sie die Objektträger anschließend kurz in Leitungswasser ab. Tauchen Sie die Objektträger kurz in eine Bikarbonatlösung (100 g Magnesiumsulfat und 10 g Natriumbicarbonat in 5 l destilliertem Wasser). Spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang mit Leitungswasser ab.
    3. Die Objektträger 4 Minuten lang mit Eosin gegenfärben und die Objektträger dreimal mit 100 % Ethanol dehydrieren, gefolgt von Xylol. Deckglas der HE-Färbungen auf den Objektträgern und bewerten Sie die HE-Schnitte unter einem Lichtmikroskop, um die Schnitte mit Follikeln auszuwählen (100-fache Vergrößerung).
  3. Vorbehandlung und Hybridisierung von Paraffinschnitten für DNA-FISH
    1. Wählen Sie neue Schnitte aus, die vor oder nach dem Schnitt liegen, der Follikel aus dem Paraffinband enthielt. Montieren Sie einen Abschnitt auf einem Glasobjektträger. Trocknen Sie die Paraffinabschnitte mindestens 45 Minuten lang auf einem Herd bei 56 °C. Es ist nicht notwendig, die Objektträger direkt auf den Herd zu legen.
    2. Die Abschnitte 10 Minuten lang in Xylol entparaffinieren. Tauchen Sie die Objektträger in 99,5%iges Ethanol und spülen Sie sie 5 Minuten lang mit Leitungswasser ab. Behandeln Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei 96 °C mit Ziel-Rückhollösung (niedriger pH-Wert) vor. Spülen Sie die Objektträger nach dem Abkühlen in destilliertem Wasser ab.
    3. Behandeln Sie die Objektträger 5 min lang mit 0,01 M Salzsäure, gefolgt von einem Pepsinaufschluss (200 U/ml) für 15 min bei 37 °C. Spülen Sie die Objektträger erneut in 0,01 M Salzsäure und anschließend in PBS.
    4. Fixieren Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 1% Formaldehyd/PBS. Spülen Sie die Objektträger kurz in PBS und dann wieder in Halbwasser ab. Die Objektträger in 99,5%igem Ethanol dehydrieren und an der Luft trocknen lassen.
    5. Wählen Sie eine zentromerspezifische Sonde für Chromosom X und eine andere chromosomenspezifische zentromerische Sonde als Kontrolle, um den X-Chromosomengehalt von Granulosazellen zu bestimmen. Dabei wird das Chromosom 18 als Kontrolle verwendet.
    6. Tragen Sie 5 μl der Sonde CEP 18 (D18Z1), die direkt mit Fluorochrom SpectrumGreen markiert ist, und die Sonde CEP X (DXZ1), die direkt mit Fluorochrom SpectrumRed markiert ist, auf die vorbehandelten Objektträger auf. Bringen Sie ein Deckglas an und versiegeln Sie die Stelle mit Fotokleber. Legen Sie die Objektträger zur Denaturierung bei 80 °C für 10 Minuten und zur Hybridisierung über Nacht bei 37 °C in einen Hybridisator.
    7. Am nächsten Tag spülen Sie die Objektträger 5 Minuten lang in 2x SSC bei 42 °C aus, gefolgt von einer 2-minütigen und einer 1-minütigen Spülung in 0,3 % Nonidet P40 bei 73 °C. Frischen Sie die 2x SSC auf und spülen Sie die Objektträger erneut 5 Minuten lang bei Raumtemperatur aus. Decken Sie die Küvette so ab, dass die Abschnitte im Dunkeln bleiben.
    8. Spülen Sie die Objektträger kurz in destilliertem Wasser ab. Die Objektträger in 99,5%igem Ethanol dehydrieren und erneut an der Luft trocknen lassen. Montieren Sie die Objektträger abschließend mit einer Lösung, die DAPI und Eindeckmedium enthält.
  4. Bildgebung
    1. Analysieren Sie die Ergebnisse unter einem Fluoreszenzmikroskop bei 630-facher Vergrößerung. Öffnen Sie die Bildbearbeitungssoftware auf dem Computer. Wählen Sie FISH als Profil aus.
    2. Überprüfen Sie, ob die DAPI-Emission auf 431 nm und die Anregung auf 359 nm, die Texas-Rot-Emission auf 613 nm und die Anregung auf 595 nm und die FITC-Emission auf 519 nm und die Anregung auf 495 nm eingestellt ist.
    3. Erfassen Sie ein Bild, indem Sie Live > Einzelbild aufnehmen auswählen. Optimieren Sie die Bildqualität, indem Sie die Belichtung und Verstärkung anpassen, indem Sie den Belichtungsregler und den Verstärkungsregler im Bildmenü auf der linken Seite verschieben (z. B. Belichtung: 212 ms und Verstärkung: 7,9). Die erforderliche Belichtung und Verstärkung kann je nach Bild variieren. Beobachten Sie die Veränderungen während dieses Prozesses, um ein optimiertes Bild zu erhalten. Speichern Sie das Bild in einer neu erstellten Datei.
    4. Lagern Sie die Objektträger nach der Analyse im Dunkeln bei 4 °C, um Signalverluste zu vermeiden.

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Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

FISH auf isolierten Eierstockzellen vor der Transplantation
Kryokonserviertes Ovarialrindengewebe von Frauen mit 45,X/46,XX (Patientin A) oder 45,X/46,XX/47,XXX (Patientin B) TS wurde verwendet, um die Ergebnisse mit diesem Protokoll zu veranschaulichen. Bei Patient A wiesen 50% der Lymphozyten einen 45,X-Karyotyp und 50% einen 46,XX-Karyotyp auf. Bei Patient B waren 38% der Lymphozyten 45,X, 28% 46,XX und 34% 47,XXX. Zentromerspezifische Sonden für Chromosom X (grün) und Chromosom 18 als Kontrolle (r...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die FISH-Analyse ist eine bekannte Technik zum Nachweis von X-Chromosomenaberrationen in Lymphozyten oder Wangenzellen sowohl von Männern als auch von Frauen10. Mehrere Studien haben FISH an Gameten von Männern mit X-Chromosomenaberrationen beschrieben, aber es fehlen noch detaillierte Informationen, die FISH an Eierstockzellen von Frauen mit X-Chromosomenaberrationen gewonnen hat14. In diesem Artikel werden neue Methoden vorgestellt, die auf FISH basieren, um festzustellen...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren danken Marjo van Brakel, Dominique Smeets, Guillaume van de Zande, Patricia van Cleef und Milan Intezar für ihr Fachwissen und ihre technische Unterstützung. Finanzierungsquellen: Merck Serono (A16-1395), Goodlife und Ferring.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
EssigsäureBiosolve BV0001070602BS
Zentrifuge 1200Hettich Universal4140
Kollagenase ISigma131470
DeckglasVWR0631-0146
DAPIVectorH-1200
DNase IRoche10104159001
Dulbecco' s Phosphatgepufferte KochsalzlösungLonzaBE17-513Q
EDTAMerck108421
Eosin-YSigma1159350100
EthanolEMSURE1009832500
Fetal Bovine Serum (FBS)Life Technology10100147
Fluoreszenzmikroskop für Schnitte DM4 BLeica Microsystems 
Fluoreszenzmikroskop Zielfernrohr A1Zeiss AXIO
Fluoreszenzmarkierte Sonden für dissoziierte ZellenAbbott DiagnosticsCEPX (DXZ1) 05J1023
CEP18 (D18Z1) 05J0818
Fluoreszenzmarkierte Sonden für GewebeschnitteAbbott DiagnosticsCEP X (DXZ1 05J08-023
CEP 18 (D18Z1)  05J10-028
FormaldehydSigma252549
GlukoseMerck108337
Kleber (Fixogum)Leica MicrosystemsLK071A
HämatoxylinSigma1159380025
HybridisierungspufferAbott Diagnostics32-804826/06J67-001
Hybridisierungsstation DakoS2451
SalzsäureMerck1003171000
Bildverarbeitungssoftware für einzelne Zellen der Eierstockrinde (Cytovision 7.7)Leica Biosystems
Bildverarbeitungssoftware für Paraffineschnitte Leica Application Suitex (3.7.5.24914)
Immunochemie ObjektträgerDakoK802021-2
L15Lonza12-700Q
Liberase DHRoche05 401 151 001
LichtmikroskopZeiss Westdeutschland
MagnesiumsulfatMerckA335586
MethanolHoneywell14262-1L
EindeckmediumVectashield, VectorH-1000
Nonidet P40Sigma7385-1L
ParaffinPoth Hile2712.20.10
PepsinSigmaP7000-25G
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)Gibco11530546
PipetteCooperSurgical7-72-4075/1
Kaliumchlorid Merck1049361000
Proteinase KQiagen19131
Rotationsmikrotom HM 355SThermo sceintific
ScalpelDahlhausen11.000.00.515
Objektträger für FISH auf dissoziierten ZellenThermo scientificJ1810AM1JZ
NatriumbicarbonatSigma55761-500G
Standard-Natriumcitrat (SSC)Fisher Scientific, Invitrogen10515203
Stereomikroskop IX 70Olympus
Target Retrieval Solution    DakoGV80511-2
TrypsinSigmaT4799
Tween-20ThermoFisher85113
XylolBOOM760518191000
Kunststoff

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vander Borght, M., Wyns, C. Fertility and infertility: Definition and epidemiology. Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).
  2. Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. Genetics of human female infertility. Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).
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