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Methodenartikel

Methoden zur Untersuchung des Beitrags der Gebärmutter zur Schwangerschaftsbegründung in einem ovariektomierten Mausmodell

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DOI:

10.3791/64763

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7. April 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Biomedicine Discovery Institute, Department of Anatomy and Developmental Biology, Monash University, 2Gynaecology Research Centre, Royal Women’s Hospital and Department of Obstetrics and Gynaecology, University of Melbourne, 3The Ritchie Centre, Hudson Institute for Medical Research and Department of Obstetrics and Gynaecology, Monash University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Die Etablierung einer Schwangerschaft ist ein dynamischer Prozess, bei dem es zu komplexen Wechselwirkungen zwischen Embryo und Gebärmutter kommt. Der genaue Beitrag der mütterlichen Gebärmutterumgebung zu diesen Prozessen ist nach wie vor ein aktives Forschungsgebiet. Hier werden detaillierte Protokolle zur Verfügung gestellt, die bei der Entwicklung von In-vivo-Tiermodellen helfen, um diese Forschungsfragen zu beantworten.

Zusammenfassung

Damit eine Schwangerschaft festgestellt werden kann, muss eine lebensfähige Blastozyste erfolgreich mit einer empfänglichen Gebärmutterschleimhaut (Endometrium) interagieren, um die Einnistung und Plazentabildung zu erleichtern und eine weitere Schwangerschaft zu ermöglichen. Die Einschränkungen des Schwangerschaftserfolgs durch embryonale Defekte sind bekannt und wurden in den letzten Jahrzehnten mit dem Aufkommen der In-vitro-Fertilisation (IVF) und der assistierten Reproduktionstechnologien weitgehend überwunden. Bisher hat das Feld jedoch noch nicht die Einschränkungen überwunden, die durch ein unzureichend empfängliches Endometrium verursacht werden, was zu stagnierenden IVF-Erfolgsraten führt. Die Funktionen der Eierstöcke und des Endometriums sind eng miteinander verflochten, da die vom Eierstock produzierten Hormone für den Menstruationszyklus der Gebärmutterschleimhaut verantwortlich sind. Daher kann es bei der Verwendung von Nagetiermodellen für die Schwangerschaft schwierig sein, festzustellen, ob ein beobachtetes Ergebnis auf ein Defizit der Eierstöcke oder der Gebärmutter zurückzuführen ist. Um dies zu überwinden, wurde ein ovariektomiertes Mausmodell mit Embryotransfer oder künstlicher Dezidualisierung entwickelt, um die Untersuchung der uterinspezifischen Beiträge zur Schwangerschaft zu ermöglichen. Dieser Artikel enthält Anweisungen zur Durchführung einer Ovariektomie und bietet Einblicke in verschiedene Techniken zur Zufuhr exogener Hormone zur Unterstützung einer erfolgreichen künstlichen Dezidualisierung oder Schwangerschaft nach dem Embryotransfer von gesunden Spendern. Zu diesen Techniken gehören subkutane Injektionen, langsam freisetzende Pellets und osmotische Minipumpen. Die wichtigsten Vor- und Nachteile der einzelnen Methoden werden diskutiert, so dass die Forschenden das beste Studiendesign für ihre spezifische Forschungsfrage auswählen können.

Einleitung

Mit dem zunehmenden Einsatz von assistierten Reproduktionstechnologien in den letzten Jahrzehnten wurden viele Hindernisse für die Empfängnis überwunden, so dass viele Paare trotz Fruchtbarkeitsproblemen eine Familie gründen konnten1. Eizell- oder Spermiendefizite können oft durch In-vitro-Fertilisation oder intrazytoplasmatische Spermieninjektion umgangen werden. Probleme im Zusammenhang mit der Gebärmutter und der Empfänglichkeit des Endometriums bleiben jedoch eine schwer fassbare "Black Box" des Fortpflanzungspotenzials2.

Eine Schwangerschaft ist dann gegeben, wenn ein hochwertiger Embryo erfolgreich mit einem empfänglichen Endometrium (Gebärmutterschleimhaut) interagiert. Die Chancen auf eine erfolgreiche Schwangerschaft in einem bestimmten Menstruationszyklus sind mit etwa 30 % gering3,4. Von denen, die erfolgreich sind, kommen nur 50%-60% über die 20. Schwangerschaftswoche hinaus, wobei das Implantationsversagen für 75% der Schwangerschaften verantwortlich ist, die nicht die 20. Schwangerschaftswoche erreichen3. Trotz dieser Zahlen, die bis in die späten 1990er Jahre zurückreichen, hat das Feld noch nicht die Einschränkungen überwunden, die durch ein unzureichend empfängliches Endometrium verursacht werden. Dies hat in den letzten Jahren zu stagnierenden - und manchmal rückläufigen - IVF-Erfolgsraten geführt 5,6.

Frauen mit unerklärlicher Unfruchtbarkeit haben oft ein verschobenes Fenster der Empfänglichkeit oder sind aus unbekannten Gründen nicht in der Lage, Empfänglichkeit zu erreichen. Kürzlich wurde das Endometrium-Rezeptivitäts-Array entwickelt, das die Expression von Hunderten von Genen bewertet, um den Zeitpunkt des Embryotransfers auf das Empfänglichkeitsfenster eines Individuums zuzuschneiden 7,8,9. Allerdings fehlt es noch an Verständnis für die Pathogenese von Schwangerschaftskomplikationen, die sich nach Abschluss des Implantationsprozesses manifestieren.

Das weibliche Fortpflanzungssystem ist hochdynamisch und steht unter strenger hormoneller Kontrolle. Die Hypothalamus-Hypophysen-Gonaden-Achse (HPG) steuert die Freisetzung des luteinisierenden Hormons und des follikelstimulierenden Hormons, die Aspekte des Eierstockzyklus regulieren, einschließlich der Follikelreifung und der Östrogen- und Progesteronaktivität. Der Menstruationszyklus der Gebärmutter wiederum wird durch Östrogene und Progesteron reguliert10,11. Daher wird die Untersuchung der biologischen Mechanismen der Gebärmutter durch den Einfluss der Eierstöcke erschwert. Wenn man beispielsweise untersucht, wie sich Krebstherapien auf die Gebärmutter auswirken können, kann es schwierig sein zu unterscheiden, ob ein beobachteter Uterusphänotyp (wie Fehlgeburten oder Menstruationsazyklizität) das Ergebnis einer direkten Schädigung der Gebärmutter oder einer Folgewirkung einer Schädigung der Eierstöcke ist.

Um die Fruchtbarkeit umfassend zu verstehen, müssen die Beiträge der Gebärmutter zur Schwangerschaft charakterisiert werden. Wichtig ist, dass dieses Verständnis über die Gebärmutterfunktion unter ovarieller Kontrolle hinausgeht. Dies kann nicht am Menschen untersucht werden; Daher werden häufig Tiermodelle verwendet. Daher wird die Ovariektomie (OVX) häufig verwendet, um Forschern die Möglichkeit zu geben, den Brunstzyklus von Nagetieren (analog zum Menstruationszyklus) durch exogene Zufuhr von Hormonen zu regulieren. Darüber hinaus ermöglicht OVX die Untersuchung von Uterusreaktionen unabhängig vom Einfluss der Eierstöcke12. Wenn jedoch nach OVX nicht sofort Hormone zugeführt werden, kommt es zu einem Phänotyp in den Wechseljahren, der von den Forschern sorgfältig berücksichtigt werden muss.

OVX wird häufig in den Nagetiermodellen 13,14,15,16,17 verwendet und ist nach angemessenem Training relativ einfach durchzuführen. Die Methoden variieren je nachdem, ob nur der Eierstock oder der Eierstock und der Eileiter entfernt werden, sowie je nach Alter des Tieres (erwachsene, zyklische Tiere haben größere Eierstöcke mit einem sichtbaren Gelbkörper auf ihrer Oberfläche, was bedeutet, dass ihre Eierstöcke leichter sichtbar sind). In ähnlicher Weise gibt es viele Methoden der Hormonergänzung, darunter subkutane Injektionen14, langsam freisetzende Pellets15, osmotische Minipumpen18 und Eierstocktransplantationen.

In diesem Artikel finden Sie detaillierte Anweisungen zur Durchführung einer Ovariektomie und zur Vorbereitung von drei Arten von Hormonergänzungen, darunter subkutane Injektionen, Pellets mit langsamer Freisetzung und osmotische Minipumpen. Es werden zwei detaillierte Protokolle für experimentelle Endpunkte bereitgestellt, die von OVX profitieren, gefolgt von einer exogenen Hormonsupplementierung (Embryotransfer und künstliche Dezidualisierung). Dieser Artikel erörtert die Stärken und Schwächen der einzelnen Ansätze mit dem Ziel, Forscher bei der Durchführung von Studien zur Isolierung der Auswirkungen auf die Gebärmutter zu unterstützen, insbesondere in den Forschungsbereichen Schwangerschaft und Fruchtbarkeit.

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Protokoll

Alle Tiere wurden in temperaturkontrollierten Hochbarriereanlagen (Monash University Animal Research Laboratory) mit freiem Zugang zu Futter und Wasser und einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit der Genehmigung der Ethikkommission der Monash Animal Research Platform (#21908, 17971) und in Übereinstimmung mit dem Verhaltenskodex des National Health and Medical Research Council für die Pflege und Verwendung von Tieren durchgeführt.

1. Chirurgische Vorbereitung

  1. Autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente, Gaze und Papierhandtücher, die für die Eingriffe benötigt werden, in einem Hart-/Trockengutzyklus bei 121 °C mit einer Haltezeit von 30 min und einer Trocknungszeit von 30 min.
  2. Legen Sie eine sterile Tischunterlage für den chirurgischen Arbeitsbereich bereit und bereiten Sie Analgetika vor.
    1. Verdünnen Sie Carprofen in steriler Kochsalzlösung auf 1 mg/ml und verdünnen Sie Bupivacain in steriler Kochsalzlösung zu einer 0,5%igen (w/v) Lösung.
    2. Geben Sie 3,5 ml Meloxicam in eine 400-ml-Käfigwasserflasche.
  3. Wärmen Sie das/die Wärmekissen(s) für die Auffangkäfige vor und stellen Sie Wärmelampen auf, um indirektes Licht auf die sich erholenden Tiere zu werfen.
  4. Stellen Sie sicher, dass die richtige PSA getragen wird, einschließlich Haarnetz, Gesichtsmaske, Kittel und Handschuhe.
  5. Praktizieren Sie eine gute sterile Technik, einschließlich des regelmäßigen Besprühens der Handschuhe mit Ethanol und des Verdunstenlassens vor dem Umgang mit dem Tier oder chirurgischen Werkzeugen, um eine Kontamination mit Ethanol zu vermeiden.

2. Durchführung einer Ovariektomie

  1. Füllen Sie die Induktionsbox mit einem Gasanästhesiegerät mit Isofluran für 3-5 Minuten mit 5 % Isofluran vor, wobei die Flussrate auf 4 l/min eingestellt ist.
  2. Legen Sie die Maus in die Induktionsbox und bewegen Sie sie, sobald Sie bewusstlos sind, zum Nasenkegel und reduzieren Sie die Durchflussrate auf 0,4 l/min, wobei der Isofluran-Verdampfer auf ~2,5% eingestellt ist.
    HINWEIS: Der Prozentsatz an Isofluran, der für den Rest des Verfahrens verwendet wird, variiert je nach Mausstamm, Alter und Exposition gegenüber Behandlungen (z. B. Chemotherapie) und sollte auf der Grundlage einer genauen Beurteilung der Atemmuster jedes einzelnen Tieres angepasst werden. Die Atemmuster sollten als normale Bauchatmung beibehalten werden. Schnelle, thorakale Atemzüge können darauf hindeuten, dass eine tiefe Operationsebene nicht erreicht oder aufrechterhalten wurde. Passen Sie in diesem Fall den Prozentsatz des Isofluran-Verdampfers nach Bedarf an.
  3. Tragen Sie das Augengleitmittel großzügig auf, indem Sie die Tube zusammendrücken und das Auge sanft abtupfen.
  4. Rasieren Sie einen kleinen Bereich (2 cm x 2 cm) an und unter der Krümmung der Wirbelsäule.
  5. Verabreichen Sie 5 mg/kg Carprofen aus einer verdünnten Lösung von 1 mg/ml subkutan am Genick.
  6. Testen Sie die Narkosetiefe mit dem Zehenklemmreflex, indem Sie den hinteren Zeh der Maus einklemmen. Wenn es keine Zehenquetschreaktion gibt, befindet sich das Tier in der tiefen Operationsebene, und der Eingriff kann fortgesetzt werden.
  7. Tragen Sie Betadine auf den Operationsbereich auf und bedecken Sie es mit einem chirurgischen Tuch (einer Gaze mit einem 2 cm x 2 cm großen Fensterausschnitt).
  8. Ziehen Sie die Haut mit einer Rattenzahnzange nach oben und machen Sie einen ~5 mm langen Längsschnitt.
    Anmerkungen: Ein Hautschnitt in dieser Höhe auf dem Rücken des Tieres eignet sich am besten für die chirurgische Clipplatzierung, um die Wahrscheinlichkeit zu verringern, dass das Tier die Clips entfernt und Clipreparaturen erforderlich sind.
  9. Fahren Sie mit einer stumpfen Pinzette fort und präparieren Sie die Haut stumpf von der darunter liegenden Muskelschicht weg und bewegen Sie sich nach unten und zur Seite in Richtung Niere.
  10. Identifiziere die Niere, den Eierstock und das Fettpolster der Eierstöcke visuell durch die Muskelwand.
    Anmerkungen: Die Niere erscheint dunkelrot, das Fettpolster erscheint strahlend weiß und wenn es sichtbar ist, sieht der Eierstock wie ein kleiner rosa Punkt im Fettpolster aus.
  11. Greife und hebe die Muskelschicht mit einer Pinzette an. Machen Sie einen Schnitt von ~0,5-1 cm mit einer scharfen chirurgischen Schere. Halten Sie die Muskelwand weiterhin mit einer Pinzette fest und wechseln Sie von der Schere zur stumpfen Pinzette, um das Eierstockfettpolster durch den Schnitt zu ziehen.
  12. Klemmen Sie mit einem gebogenen Nadelhalter unter den Eierstock und den Eileiter am distalen Ende des Gebärmutterhorns.
    HINWEIS: Alternativ kann auch nur der Eierstock entfernt werden, wobei der Eileiter intakt bleibt. Ein Präpariermikroskop ist jedoch erforderlich, um die Unterscheidung zwischen Eierstock und Eileiter genau darzustellen.
  13. Entfernen Sie den Eierstock mit einer Schere oder einem Skalpell. Klemmen Sie 30 s lang weiter, um übermäßige Blutungen zu vermeiden.
  14. Entfernen Sie die Klemme und tupfen Sie sie bei Bedarf mit steriler Gaze ab.
  15. Um den Muskelwandschnitt zu schließen, heben Sie die Oberseite des Schnitts mit einer Pinzette an, so dass sich der Schnitt auf natürliche Weise zusammenzieht.
  16. Verwenden Sie Seidennähte (Größe 3-0), um den Muskelwandschnitt mit einem Chirurgenknoten zu verschließen.
  17. Tragen Sie zwei bis drei Tropfen Bupivacain topisch mit einer 1-ml-Spritze ohne Nadel auf und wiederholen Sie die Schritte 2.9-2.17 auf der anderen Seite.
  18. Um den Hautschnitt zu schließen, tupfen Sie den Bereich mit Gaze von überschüssigem Bupivacain ab und drücken Sie die beiden Seiten der Haut zusammen.
  19. Bringen Sie ein bis zwei chirurgische Clips mit einem Durchmesser von 7 mm an, um im Rahmen des Heilungsprozesses Platz für Schwellungen zu schaffen.
  20. Bewegen Sie die Maus in einen Auffangkäfig und überwachen Sie sie 15 Minuten lang genau.
    HINWEIS: Die Tiere sollten schnell aufwachen; Achten Sie darauf, die Atmung genau auf normale Thoraxatmungsmuster zu überwachen.

3. Hormonpräparat: Subkutane Injektion

  1. Stellen Sie eine 1 mg/ml Stammlösung von Östradiol her.
    1. 0,001 g (1 mg) Östradiolpulver in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen einwiegen.
    2. Geben Sie 1 ml 100%iges Ethanol in das Röhrchen und wirbeln Sie einige Sekunden lang.
      Anmerkungen: Das Ethanol bleibt klar mit sichtbaren Flecken von Östradiolpulver.
    3. Wickeln Sie das Röhrchen mit Folie ein, um eine Verdunstung von Ethanol zu verhindern.
    4. Wickeln Sie das Röhrchen in Alufolie ein und legen Sie es über Nacht auf eine Wippe, um das Östradiolpulver vollständig aufzulösen.
    5. Verdünnen Sie diesen Vorrat von 1 mg/ml in Sesamöl auf die gewünschte Endkonzentration.
      HINWEIS: Für das Priming vor der künstlichen Dezidualisierung sind Dosen von 100 ng für 3 Tage erforderlich, und zusätzliche niedrige Dosen von 25 ng sind erforderlich, wenn Progesteron verabreicht wird. Damit soll die Rückkopplungsschleife bekämpft werden, die die Expression von Progesteronrezeptoren steuert. Für den Embryotransfer sind zwei Dosen von 100 ng an Tag 1 und Tag 3 vor dem Embryotransfer am 4. Tag erforderlich. Zum Zeitpunkt des Embryotransfers ist auch eine niedrige Dosis von 25 ng erforderlich.
    6. Ziehen Sie die erforderliche Menge Östradiol in Öl in eine 1-ml-Spritze auf und setzen Sie dann eine 26-g-Nadelspitze auf.
    7. Injizieren Sie die entsprechende Dosis subkutan (entweder am Genick oder an der Flanke; 100 ng/100 μl oder 25 ng/100 μl für das Priming vor dem Embryotransfer oder der künstlichen Dezidualisierung oder zum Zeitpunkt des Embryotransfers) in der erforderlichen Häufigkeit.
      Anmerkungen: Öl ist sehr zähflüssig, daher sollten Sie langsam injizieren und einige Sekunden pausieren, bevor Sie die Nadel entfernen. Dadurch wird die Menge an Öl minimiert, die aus der Einspritzstelle austritt.
  2. Stellen Sie eine 200 mg/ml Stammlösung Progesteron her.
    1. Wiegen Sie 0,4 g (400 mg) Progesteronpulver in ein steriles 5-ml-Röhrchen.
    2. Geben Sie 2 ml 100%iges Ethanol in das Röhrchen und wirbeln Sie einige Sekunden lang.
      Anmerkungen: Das Ethanol wird weiß.
    3. Wiederholen Sie die Schritte 3.1.3-3.1.4.
    4. Verdünnen Sie die 200 mg/ml Brühe in Sesamöl auf die gewünschte Endkonzentration.
      HINWEIS: Dosen von 2 mg täglich sind erforderlich, um den Embryotransfer zu unterstützen.
    5. Injizieren Sie die entsprechende Dosis (z. B. 2 mg/100 μl täglich zur Unterstützung der Schwangerschaft) subkutan wie in den Schritten 3.1.6-3.1.7.

4. Hormonpräparat: Pellets mit langsamer Freisetzung

  1. Legen Sie eine Folie über die Oberfläche einer Laminar-Flow- oder Biosicherheitshaube der Klasse II.
  2. Legen Sie die gesamte Ausrüstung (Handschuhe, Petrischale, 1-ml-Spritzen, feine Pinzette) in die Haube und schalten Sie die UV-Strahlung für 20 Minuten ein.
    Anmerkungen: Schalten Sie die UV-Strahlung nicht mit dem Dichtmittel in der Haube ein, da es aushärtet.
  3. Waschen Sie den silastischen Schlauch in 100 % Ethanol und lassen Sie ihn in der Haube an der Luft trocknen. Markieren Sie nach dem Trocknen ~1 cm lange Längen entlang des Schlauchs und schneiden Sie ihn mit einem Skalpell ab.
  4. Entfernen Sie den Kolben von einer Spritze und drücken Sie ~200 μl Dichtmittel hinein. Setzen Sie den Kolben wieder ein und drücken Sie eine kleine Menge Dichtmittel aus der Spritze.
  5. Tragen Sie eine kleine Menge Dichtmittel auf ein Ende des Schlauchs auf und glätten Sie ihn mit einem behandschuhten Finger.
  6. Über Nacht oder 20-30 Minuten im UV-Licht in der Haube trocknen lassen.
  7. Gießen Sie eine angemessene Menge Progesteron in eine sterilisierte Petrischale. Schöpfen Sie mit einer Pinzette Pellets in das Progesteronpulver, um das Pellet zu füllen.
    1. Klopfen Sie mit dem versiegelten Ende des Pellets auf die Oberfläche der Haube, um das Progesteron nach unten zu kondensieren. Alternativ kannst du auch das Ende einer sterilisierten Pinzette verwenden, um das Progesteron hinunterzustopfen. Lassen Sie genügend Platz für mehr Dichtmasse.
  8. Versiegeln Sie das offene Ende mit Dichtmittel, wie in den Schritten 3.4-3.5 beschrieben.
  9. Wickeln Sie die Petrischale mit den Progesteron-Pellets in Folie ein, um sie vor Licht zu schützen.
  10. Aktivieren Sie die Pellets vor dem subkutanen Einsetzen für mindestens 72 h durch Inkubation in 1% holzkohlegestreiftem FCS (cs-FCS: PBS) bei 37 °C.
    Anmerkungen: Pellets können in loser Schüttung mit einem einzigen versiegelten Ende im Voraus hergestellt werden. Es sollte jedoch jedes Mal frisches Progesteron verwendet werden, um sie zu füllen. Stellen Sie sicher, dass die vorgefertigten Pellets UV-sterilisiert sind, bevor Sie sie mit Progesteron füllen. Die Pellets sezernieren ~500 μg/Tag für 6-10 Tage, was eine ausreichende Unterstützung für künstliche Dezidualisierungs- und Embryotransferverfahren darstellt, obwohl eine zusätzliche niedrig dosierte Östrogeninjektion erforderlich sein kann, um die Aktivität des Progesteronrezeptors über 4-5 Tage hinaus aufrechtzuerhalten. Nach Ablauf von 10 Tagen kann ein Ersatz-Progesteronpellet erforderlich sein.

5. Hormonpräparation: Osmotische Minipumpen

  1. Bereiten Sie Progesteron in der gewünschten Konzentration in einer wässrigen Lösung her und wählen Sie das entsprechende Mini-Osmopumpenmodell aus (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Für Abschnitt 7 (Versuchsverfahren: Embryotransfer) ist die Lieferung von 2 mg/Tag für 12 Tage erforderlich. Lösen Sie daher 28 mg Progesteron in ~100 μl sterilem Wasser pro Tier auf (befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für das spezifische Volumen). Serielle Verdünnungen können erforderlich sein. Für Abschnitt 8 (Versuchsverfahren: künstliche Dezidualisierung) ist die Abgabe von 500 μg pro Tag für 3 Tage erforderlich. Lösen Sie daher pro Tier 1.500 μg Progesteron in ~100 μl sterilem Wasser auf. Bereiten Sie eine zusätzliche Lösung vor, um den Volumenverlust während des Füllvorgangs zu berücksichtigen.
  2. Stellen Sie die Ausrüstung (Handschuhe, fusselarme Tücher, Petrischale, sterile Kochsalzlösung, 1-ml-Spritzen, kleine Wägeschiffchen, Folie und Waage mit einer Genauigkeit von 0,01 g) in einer Biosicherheitshaube der Klasse II auf und schalten Sie dann die UV-Strahlung für 20 Minuten ein.
  3. Ziehen Sie die Hormonlösung in eine 1-ml-Spritze und schließen Sie dann ein steriles Füllröhrchen an, wobei Sie sorgfältig darauf achten, dass keine Luftblasen vorhanden sind.
  4. Wiegen Sie die Pumpe und ihren Durchflussmoderator in einer sterilen Wägekabine.
  5. Führen Sie das Füllrohr durch die Öffnung an der Oberseite der Pumpe, bis es nicht mehr weitergeht.
  6. Halten Sie die Pumpe aufrecht und drücken Sie langsam auf den Kolben der Spritze, um den Schlauch zu füllen.
    Anmerkungen: Eine schnelle Befüllung sollte vermieden werden, da dadurch Luftblasen in die Pumpe gelangen können.
  7. Wenn die Lösung von der Oberseite der Pumpe überläuft, entfernen Sie vorsichtig das Füllrohr und wischen Sie die überschüssige Lösung mit einem sterilen, flusenarmen Tuch ab.
  8. Führen Sie den Strömungsmoderator durch die Öffnung an der Oberseite der Pumpe ein, bis er nicht mehr weiterläuft. Sobald Sie vollständig drin sind, drücken Sie die Pumpe und den Strömungsmoderator fest zusammen.
  9. Wiegen Sie die gefüllte Pumpe mit eingesetztem Durchflussgeber.
    ANMERKUNG: Der Gewichtsunterschied, der sich aus Schritt 5.3 und Schritt 5.8 ergibt, ergibt das Nettogewicht der geladenen Lösung (d. h. eine Zunahme von 0,1 g = 100 μl der hinzugefügten Lösung).
  10. Stellen Sie die gefüllte Pumpe in eine sterile Petrischale, die mit steriler Kochsalzlösung gefüllt ist.
  11. Sobald alle Pumpen gefüllt sind, wickeln Sie die Petrischale in Folie ein und legen Sie sie in einen 37 °C-Inkubator, um sie mindestens 4-6 Stunden lang (oder bis zur Verwendung) zu entlüften.

6. Chirurgischer Eingriff: Einsetzen von subkutanen Hormonpellets und Minipumpen

  1. Bereiten Sie den Bereich gemäß Abschnitt 1 (chirurgische Vorbereitung) vor.
  2. Betäuben Sie die Tiere gemäß den Schritten 2.1-2.3.
  3. Rasieren Sie einen kleinen Bereich am Genick (~1 cm x 1 cm).
  4. 5 mg/kg Carprofen aus einer verdünnten Lösung von 1 mg/ml subkutan in die Beinflanke verabreichen.
  5. Testen Sie den Zehenklemmreflex. Wenn kein Reflex vorhanden ist, befindet sich das Tier in der tiefen Operationsebene und der Eingriff kann beginnen.
  6. Tragen Sie Betadine auf den Operationsbereich auf und bedecken Sie ihn mit einem OP-Tuch (einer Gaze mit einem 2 cm x 2 cm großen Fensterausschnitt).
  7. Ziehen Sie mit einer Rattenzahnzange die Haut am Genick des Halses (auf halbem Weg zwischen dem echten Genick und dem Buckel des Rückens) nach oben und machen Sie einen ~5 mm langen Schnitt.
  8. Mit einer stumpfen Pinzette wird die Haut mit einer stumpfen Pinzette nach unten von der darunter liegenden Muskelschicht wegpräpariert.
    Anmerkungen: Schaffen Sie für das Einsetzen der osmotischen Minipumpe eine Tasche entlang einer Seite des Tieres, damit die Pumpe die Bewegung des Tieres nicht einschränkt oder gegen die Einschnittstelle drückt.
  9. Sobald genügend Platz für das Hormonpellet oder die Minipumpe geschaffen wurde, nehmen Sie das Pellet oder die Minipumpe mit einer sterilen Pinzette auf und führen Sie sie in die subkutane Tasche ein, die mit stumpfer Dissektion hergestellt wurde.
  10. Um den Hautschnitt zu schließen, stellen Sie sicher, dass sich das Pellet oder die Minipumpe weit genug in der Tasche befindet, damit chirurgische Clips sie nicht beschädigen können.
  11. Tragen Sie Bupivacain gemäß Schritt 2.17 topisch auf.
  12. Verschließen Sie die Wunde mit einem chirurgischen Clip. Bewegen Sie die Maus in einen Auffangkäfig und überwachen Sie sie 15 Minuten lang genau. Da es sich um einen kurzen Eingriff handelt, sollten die Tiere innerhalb weniger Minuten gehfähig sein.

7. Experimentelles Verfahren: Embryotransfer

  1. Bei ovariektomierten Tieren 3 Tage vor dem Embryotransfer durch eine subkutane Injektion von 100 ng/100 μL Estradiol (Schritt 3.1).
  2. Einen Tag vor dem Embryotransfer werden die Tiere mit einer subkutanen Injektion von 2 mg/100 μl Medroxyprogesteronacetat hormonell geprimt (Schritt 3.2).
  3. Bereiten Sie den Bereich gemäß Abschnitt 1 (chirurgische Vorbereitung) vor.
  4. Betäuben Sie die Tiere gemäß den Schritten 2.1-2.3.
  5. Beginnen Sie den Vorgang gemäß den Schritten 2.4-2.10.
  6. Legen Sie unter einem Präpariermikroskop mit einer 26-g-Nadelspitze eine intrauterine Injektionsstelle an.
  7. Pipettieren Sie fünf Blastozysten in einen M2-Medientropfen und übertragen Sie diese dann in das Gebärmutterhorn.
  8. Um den Muskelwandschnitt zu schließen, heben Sie die Oberseite des Schnitts mit einer Pinzette an, so dass sich der Schnitt auf natürliche Weise zusammenzieht.
  9. Verschließen Sie die Muskelwandstelle mit Seidennähten mit einem Chirurgenknoten. Tragen Sie Tropfen Bupivacain topisch auf.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 7.5-7.8 auf der anderen Seite.
  11. Um den Hautschnitt zu schließen, tupfen Sie den Bereich mit Gaze von überschüssigem Bupivacain ab und drücken Sie die beiden Seiten der Haut zusammen.
  12. Bringen Sie ein bis zwei chirurgische Clips an, um im Rahmen des Heilungsprozesses Raum für Schwellungen zu schaffen.
    HINWEIS: Wenn die Tiere ovariektomiert sind, sind zum Zeitpunkt des Embryotransfers exogene Hormone erforderlich. Progesteron (2 mg) entweder subkutan injizieren oder ein subkutanes Progesteronpellet oder eine osmotische Minipumpe einführen. Um einen Überschuss an Progesteron zu bekämpfen, ist zum Zeitpunkt des Embryotransfers eine subkutane Injektion von niedrig dosiertem (25 ng/100 μl) Östrogen erforderlich.
  13. Tragen Sie die Maus vorsichtig in einen Auffangkäfig und überwachen Sie sie 15 Minuten lang genau.
    HINWEIS: Die Tiere sollten schnell aufwachen; Achten Sie darauf, die Atmung genau auf normale Thoraxatmungsmuster zu überwachen.

8. Experimentelles Vorgehen: Künstliche Dezidualisierung

  1. Die Tiere werden an Tag 1, Tag 2 und Tag 3 gemäß Abschnitt 3 (Hormonpräparat: subkutane Injektion) 8 Tage vor der künstlichen Dezidualisierung mit 100 ng/100 μL Östradiol mit 100 ng/100 μL Östradiol gefüttert.
  2. Die Tiere werden an Tag 7, Tag 8 und Tag 9 gemäß Abschnitt 3 (Hormonpräparat: subkutane Injektion) 2 Tage vor der künstlichen Dezidualisierung mit 5 ng/100 μL Östradiol hormonell geprimt.
    HINWEIS: Die endgültige Injektion muss mindestens 3 h (und maximal 4 h) vor dem künstlichen Dezidualisierungsverfahren erfolgen.
  3. Tiere, die 2 Tage vor der künstlichen Dezidualisierung mit einem subkutanen Progesteronpellet oder einer osmotischen Minipumpe (500 μg/Tag) gemäß Abschnitt 4, Abschnitt 5 und Abschnitt 8 mit Hormonen versorgt werden.
  4. Bereiten Sie den Bereich gemäß Abschnitt 1 (chirurgische Vorbereitung) vor.
  5. Betäuben Sie die Tiere gemäß den Schritten 2.1-2.2.
  6. Testen Sie die Narkosetiefe mit dem Zehenklemmreflex. Wenn es keine Zehenquetschreaktion gibt, befindet sich das Tier in der tiefen Operationsebene, und der Eingriff kann fortgesetzt werden.
  7. Legen Sie die Maus in eine Bauchlage, heben Sie den Schwanz an und führen Sie langsam ein Spekulum mit einem Durchmesser von 6 mm in die Vagina ein.
  8. Während Sie die Nase des Tieres im Anästhesienasenkegel halten, legen Sie den Unterkörper des Tieres zwischen den ersten und zweiten Finger der nicht dominanten Hand. Schieben Sie den Schwanz mit dem Daumen sanft nach oben, um die Vaginalöffnung im Blick zu behalten.
  9. Übertragen Sie 20 μl Sesamöl mit einer nicht-chirurgischen Embryotransferspitze (an einer 20-μl-Pipette befestigt) in ein Gebärmutterhorn.
    1. Halten Sie die Pipette auf Höhe der Vaginalöffnung und führen Sie die Spitze in die Vagina und durch den Gebärmutterhals in das Gebärmutterhorn ein. Sobald sich die Spitze im Gebärmutterhorn befindet, drücken Sie die Spitze sanft gegen die Endometriumoberfläche (wenn Sie die oben beschriebene Handhabungstechnik anwenden, ist diese Bewegung gegen den zweiten Finger zu spüren) und stoßen Sie das Öl langsam aus.
      Anmerkungen: Halten Sie den Pipettenkolben gedrückt, warten Sie 10 s, um sicherzustellen, dass sich das gesamte Öl verteilt hat, und entfernen Sie langsam die Transferspitze, während Sie den Kolben gedrückt halten.
  10. Entfernen Sie das Spekulum aus der Scheide.
  11. Tragen Sie die Maus vorsichtig in den Auffangkäfig und überwachen Sie sie 15 Minuten lang genau.
    HINWEIS: Die Tiere sollten schnell aufwachen. Beobachte ihre Atmung engmaschig auf normale thorakale Atemmuster.
  12. Schränken Sie den Umgang mit den Tieren ein und halten Sie sie nach dem Eingriff 96 Stunden lang in einer ruhigen Umgebung.
    HINWEIS: Laute Geräusche oder abrupte Änderungen des Hell-Dunkel-Zyklus beeinträchtigen den Erfolg des Eingriffs. Zum Zeitpunkt der Gewebedissektion kann das Ausmaß des Dezidualisierungserfolgs im Verhältnis von Uterusgewicht zu Körpergewicht gemessen werden. Das Verfahren der künstlichen Dezidualisierung hat eine Erfolgsquote von 80%. Schließen Sie daher Tiere aus, die nicht dezidualisieren können, und berücksichtigen Sie dies bei der Auswahl der Stichprobengrößen für die Experimente.

9. Chirurgischer Eingriff: Genesung, Überwachung und Clipreparaturen nach der Operation

  1. Lassen Sie die Tiere sich über Nacht halb ein, halb ohne Wärmekissen erholen, bevor Sie sie in ihren Heimatkäfig zurückbringen.
  2. Überwachen Sie die Tiere 5 Tage nach der Operation täglich und achten Sie genau auf Anzeichen einer Infektion.
  3. Führen Sie bei Bedarf eine Clipreparatur durch.
    1. Bereiten Sie den Bereich gemäß Abschnitt 1 (chirurgische Vorbereitung) vor.
    2. Betäuben Sie die Tiere gemäß den Schritten 2.1-2.3.
    3. Entfernen Sie den vorhandenen Clip mit einem Clip-Entferner, wenn der Clip noch vorhanden ist.
    4. Bringen Sie einen neuen chirurgischen Clip gemäß den Schritten 2.19-2.21 an.
  4. Entfernen Sie die chirurgischen Clips 7 Tage nach der Operation gemäß den Schritten 9.3.1-9.3.3 oder wenn das Tier das nächste Mal unter Narkose steht (z. B. für einen Embryotransfer, das Verfahren der künstlichen Dezidualisierung oder eine subkutane Injektion nach der Operation).

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Ergebnisse

Ein gut charakterisiertes Modell der künstlichen Dezidualisierung wird in diesem Protokollpapier beschrieben (Abbildung 1A). Hier wurden junge erwachsene weibliche Mäuse (8 Wochen alt) einer chirurgischen Ovariektomie unterzogen, wie in Abschnitt 1 und Abschnitt 2 beschrieben. Die Mäuse wurden dann 2 Wochen lang ausgeruht, um sicherzustellen, dass sich die endogenen Ovarialhormone auflösten, bevor sie mit exogenen Hormonen unterstützt wurden, wie in den Abschnitten 3-7 ...

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Diskussion

Dieser Artikel enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung zur Durchführung von OVX und zur Bereitstellung exogener Hormone für Studien, die sich auf das Verständnis der Beiträge der Gebärmutter zu Schwangerschaft und Fruchtbarkeit konzentrieren. Es werden zwei detaillierte Protokolle zu zwei experimentellen Anwendungen dieser Methoden zur Verfügung gestellt, einschließlich der Durchführung des Embryotransfers und der künstlichen Induktion der Dezidualisierung.

Während die Durchführung von OVX ...

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Offenlegungen

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen oder sonstigen Interessen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch die Unterstützung der operativen Infrastruktur der Regierung des Bundesstaates Victoria und den National Health and Medical Research Council (NHMRC) der australischen Regierung IRIRIS ermöglicht. Diese Arbeit wurde von der Monash University Faculty of Medicine, Nursing and Health Science Platform Access Grant to A.L.W. (Winship-PAG18-0343) unterstützt, um Zugang zur Monash Reproductive Services Platform zu erhalten. A.L.W. wird durch die DECRA-Förderung DE21010037 des Australian Research Council (ARC) unterstützt. J.N.H. und L.R.A. werden durch ein Stipendium des Australian Government Research Training Program unterstützt. L.R.A. wird durch ein Monash Graduate Excellence Stipendium unterstützt. K.J.H. wird durch ein ARC Future Fellowship FT190100265 unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
ALZET 1002 Mini-OsmosepumpenBioScientific1002Liefert 0,25 &μ; L/h für 14 Tage. Verwendung für Abschnitt 7 (Experimentelles Verfahren - Embryotransfer).
ALZET 1003D Mini-Osmotische PumpenBioScientific1003DLiefert 1 & Mikro; L/h für 14 Tage. Verwendung für Abschnitt 8 (Experimentelles Verfahren - Künstliche Dezidualisierung).
ALZET Reflex 7 mm ClipsBioScientific0009971nach Vorliebe können entweder Reflex-Clips oder Michel-Clips für den Wundverschluss verwendet werden
ALZET Reflex Clip-ApplikatorBioScientific0009974Je nach Vorliebe können entweder Reflex-Clips oder Michel-Clips für den Wundverschluss verwendet werden
ALZET Reflex Clip-EntfernerBioScientific0009976Für den Wundverschluss können entweder Reflex-Clips oder Michel-Clips verwendet werden, je nach Präferenz
Bupivicain-InjektionPfizerNAStock 0,5%. Bei 0,05 % Kochsalzlösung
verwenden EstradiolSigmaE8875
MeloxicamIliumNAWirkstoff 0,5 mg/ml. Verwenden Sie 3,5 ml pro 400-ml-Wasserflasche für einen Käfig oder wie vom Tierarzt Ihrer Einrichtung verschrieben.
Michel ClipsDanielsNS-000242
Mehrzweck-DichtstoffDow Corning732
Nicht-chirurgisches Embryotransfergerät (NSET)ParaTechs60010Enthält 6 mm Spekulum. Nur zum einmaligen Gebrauch.
ProgesteronSigmaP0130Löslich in Ethanol. Verwenden für  Abschnitt 3 (Hormonpräparation - subkutane Injektion) und  Abschnitt 4 (Hormonpräparat - Pellets mit langsamer Freisetzung)
ProgesteronSigmaP7556Wasserlöslich. Anwendung für Abschnitt 5 (Hormonpräparat - osmotische Minipumpen)
Auffrischung AugensalbeAllerganNA42,5% w/v flüssiges Paraffin, 57,3% w/v weiches weißes Paraffin
Rimadyl CarprofenZoetisNAStock 50 mg/mL. Bei 1 mg/ml (für eine Dosis von 5 mg/kg)
GummischlauchDow Corning508-008In 100 % Ethanol gewaschen und in 1 cm große Stücke geschnitten. Innendurchmesser 1,57 mm ±   0,23 mm; Außendurchmesser 3,18 mm &plusMN; 0,23 mm; Wandstärke 0,81 mm.
SesamölSigmaS3547
Sofsilk Seidennähte Gr. 3-0CovidienGS-832
Je

Referenzen

  1. Szamatowicz, M. Assisted reproductive technology in reproductive medicine - Possibilities and limitations. Ginekologia Polska. 87 (12), 820-823 (2016).
  2. Evans, J., et al. Fertile ground: Human endometrial programming and lessons in health and disease. Nature Reviews. Endocrinology. 12 (11), 654-667 (2016).
  3. Norwitz, E. R., Schust, D. J., Fisher, S. J. Implantation and the survival of early pregnancy. The New England Journal of Medicine. 345 (19), 1400-1408 (2001).
  4. Zinaman, M. J., Clegg, E. D., Brown, C. C., O'Connor, J., Selevan, S. G. Estimates of human fertility and pregnancy loss. Fertility & Sterility. 65 (3), 503-509 (1996).
  5. Kupka, M. S., et al. Assisted reproductive technology in Europe, 2010: Results generated from European registers by ESHRE†. Human Reproduction. 29 (10), 2099-2113 (2014).
  6. Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Worldwide decline of IVF birth rates and its probable causes. Human Reproduction Open. 2019 (3), (2019).
  7. Diaz-Gimeno, P., et al. A genomic diagnostic tool for human endometrial receptivity based on the transcriptomic signature. Fertility & Sterility. 95 (1), 50-60 (2011).
  8. Amin, J., et al. Personalized embryo transfer outcomes in recurrent implantation failure patients following endometrial receptivity array with pre-implantation genetic testing. Cureus. 14 (6), e26248(2022).
  9. Patel, J. A., Patel, A. J., Banker, J. M., Shah, S. I., Banker, M. R. Personalized embryo transfer helps in improving in vitro fertilization/ICSI outcomes in patients with recurrent implantation failure. Journal of Human Reproductive Sciences. 12 (1), 59-66 (2019).
  10. Khan, K. N., et al. Biological differences between functionalis and basalis endometria in women with and without adenomyosis. European Journal of Obstetrics, Gynecology, and Reproductive Biology. 203, 49-55 (2016).
  11. Richards, J. S., Ren, Y. A., Candelaria, N., Adams, J. E., Rajkovic, A. Ovarian follicular theca cell recruitment, differentiation, and impact on fertility: 2017 update. Endocrine Reviews. 39 (1), 1-20 (2018).
  12. Corciulo, C., et al. Pulsed administration for physiological estrogen replacement in mice. F1000Research. 10, 809(2021).
  13. Greaves, E., et al. A novel mouse model of endometriosis mimics human phenotype and reveals insights into the inflammatory contribution of shed endometrium. The American Journal of Pathology. 184 (7), 1930-1939 (2014).
  14. Griffiths, M. J., Alesi, L. R., Winship, A. L., Hutt, K. J. Development of an embryo transfer model to study uterine contributions to pregnancy in vivo in mice. Reproduction & Fertility. 3 (1), 10-18 (2022).
  15. Cousins, F. L., et al. Evidence from a mouse model that epithelial cell migration and mesenchymal-epithelial transition contribute to rapid restoration of uterine tissue integrity during menstruation. PLoS One. 9 (1), e86378(2014).
  16. Cousins, F. L., et al. Androgens regulate scarless repair of the endometrial "wound" in a mouse model of menstruation. FASEB Journal. 30 (8), 2802-2811 (2016).
  17. Fullerton, P. T., Monsivais, D., Kommagani, R., Matzuk, M. M. Follistatin is critical for mouse uterine receptivity and decidualization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (24), E4772-E4781 (2017).
  18. Rowland, R. R., Reyes, E., Chukwuocha, R., Tokuda, S. Corticosteroid and immune responses of mice following mini-osmotic pump implantation. Immunopharmacology. 20 (3), 187-190 (1990).
  19. Barton, B. E., et al. Roles of steroid hormones in oviductal function. Reproduction. 159 (3), R125-R137 (2020).
  20. Lee, J. E., et al. Autophagy regulates embryonic survival during delayed implantation. Endocrinology. 152 (5), 2067-2075 (2011).
  21. Hamatani, T., et al. Global gene expression analysis identifies molecular pathways distinguishing blastocyst dormancy and activation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (28), 10326-10331 (2004).
  22. Cui, L., et al. Transcervical embryo transfer in mice. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 53 (3), 228-231 (2014).

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Schlagwörter

K nstliche DezidualisierungEmbryotransferexogene Hormonzufuhrsubkutane InjektionProgesteron Pelletsendometriale Rezeptivit tUterushorn
Methoden zur Untersuchung des Beitrags der Gebärmutter zur Schwangerschaftsbegründung in einem ovariektomierten Mausmodell
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