Hier beschreiben wir eine Methode zur Echtzeit-Detektion der Produktion von apoplastischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Reisgeweben in einer pathogen-assoziierten molekularmuster-ausgelösten Immunantwort. Diese Methode ist einfach, standardisiert und erzeugt unter kontrollierten Bedingungen hochreproduzierbare Ergebnisse.
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Methodenartikel
Echtzeit-Detektion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bei der Immunantwort in Reis mit einem Chemilumineszenz-Assay
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich der Wahrnehmung von abiotischen und biotischen Belastungen. Bei einer Infektion mit Krankheitserregern oder einer Herausforderung mit pathogen-assoziierten Chemikalien (Pathogen-assoziierte molekulare Muster [PAMPs]) wird in Pflanzen schnell eine Reihe von Immunantworten, einschließlich eines ROS-Bursts, induziert, was als PAMP-ausgelöste Immunität (PTI) bezeichnet wird. Ein ROS-Burst ist eine charakteristische PTI-Reaktion, die durch eine Gruppe von Plasmamembran-lokalisierten NADPH-Oxidasen - den Proteinen der RBOH-Familie - katalysiert wird. Die überwiegende Mehrheit der ROS besteht aus Wasserstoffperoxid (H2 O2), das durch eine Luminol-basierte Chemilumineszenzmethode leicht und stetig nachgewiesen werden kann. Chemilumineszenz ist eine photonenproduzierende Reaktion, bei der Luminol oder sein Derivat (wie L-012) unter Einwirkung eines Katalysators eine Redoxreaktion mit ROS durchläuft. In diesem Artikel wird eine optimierte L-012-basierte Chemilumineszenzmethode beschrieben, um die Produktion von Apoplast-ROS in Echtzeit bei PAMP-Auslösung in Reisgeweben zu erkennen. Die Methode ist einfach, stabil, standardisiert und unter fest kontrollierten Bedingungen hochgradig reproduzierbar.
Einleitung
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) umfassen eine Reihe von chemisch aktiven Sauerstoffderivaten, einschließlich Superoxidanionenradikalen (O2-) und ihren Derivaten, Hydroxylradikalen (OH-), Wasserstoffperoxid und Produkten von Singulettsauerstoff oder Oxidations-Reduktions-Reaktionen, die ständig in Plastiden und Chloroplasten, Mitochondrien, Peroxisomen und anderen subzellulären Stellen produziert werden1 . ROS spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen und sind für alle Pflanzen essentiell 2,3,4. Das breite Spektrum der ROS-Funktionen reicht von der Regulation von Wachstum und Entwicklung bis hin zur Wahrnehmung von abiotischen und biotischen Belastungen 5,6,7,8.
Im pflanzlichen Immunsystem nehmen die Plasmamembran-lokalisierten Rezeptoren der Pflanzenzellen – sogenannte Mustererkennungsrezeptoren (PRRs) – von Krankheitserregern abgeleitete Chemikalien-Erreger-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) wahr. Diese Erkennung löst eine Reihe schneller Immunreaktionen aus, darunter Kalziumeinstrom, ROS-Burst und MAPK-Kaskade; Daher wird diese Immunitätsschicht als PAMP-getriggerte Immunität (PTI) bezeichnet. ROS-Burst ist eine charakteristische PTI-Reaktion, deren Bestimmung in PTI-bezogenen Studien weit verbreitet ist 9,10. Die durch PAMPs ausgelöste ROS-Produktion wird auf Plasmamembran-residente NADPH-Oxidase oder Proteine der Respiratory Burst Oxidase Homolog (RBOH)-Familie zurückgeführt, die Elektronen von zytosolischem NADPH oder NADH auf extrazellulären Sauerstoff übertragen, um Superoxid (O 2-) zu produzieren, das durch Superoxiddismutasespontan in Wasserstoffperoxid (H 2 O 2) umgewandelt wird 8 . Der PAMP-getriggerte ROS-Burst ist ziemlich schnell, tritt nur wenige Minuten nach der PAMP-Behandlung auf und erreicht seinen Höhepunkt bei ~10-12 min. Die überwiegende Mehrheit der ROS-Moleküle besteht aus Wasserstoffperoxid (H2 O2), das mit einem Chemilumineszenz-Assay leicht und stabil nachgewiesen werden kann.
Bei der Chemilumineszenz reagiert das Chemilumineszenz-Reagenz unter Einwirkung eines Katalysators mit aktivem Sauerstoff, um die Zwischenprodukte im angeregten Zustand zu erzeugen. Dann kehren die Elektronen im Produkt durch einen strahlungsfreien Übergang in den Grundzustand zurück und emittieren Photonen. Übliche Chemilumineszenz-Reagenzien umfassen Luminol und L-012, wobei Luminol die Anwendung dominiert11,12,13. Immer mehr Forscher entscheiden sich jedoch für L-012, um die ROS-Produktion nachzuweisen, da L-012 im Vergleich zu Luminol eine viel höhere Lichtemissionseffizienz unter neutralen oder nahezu neutralen pH-Bedingungen aufweist.
Diese Arbeit beschreibt eine optimierte Chemilumineszenzmethode, basierend auf L-012, für die Echtzeit-Detektion der ROS-Produktion nach der Induktion von PAMPs in Reisgewebe (Oryza sativa), Blattscheiben und Scheiden. Die hier bereitgestellte Methode ist einfach, stabil und standardisiert und kann in hohem Maße an unterschiedliche experimentelle Anforderungen angepasst werden. Die mit dieser Methode gewonnenen Daten sind unter fest kontrollierten Bedingungen sehr gut reproduzierbar.
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Protokoll
HINWEIS: Das Protokoll gilt für verschiedene Pflanzengewebe. Reisscheide und Blattscheiben wurden in diesem Protokoll für die ROS-Detektion bei PAMP-Erhebung verwendet. Da sich Unterschiede hauptsächlich aus der Probenahmemethode ergeben, werden im Folgenden nur die üblichen Verfahren beschrieben, wobei gegebenenfalls spezifische Schritte erwähnt werden.
1. Pflanzenkultur
- Sterilisieren Sie die entspelzten Reissamen mit 70% Ethanol für 1 min, dann mit 40% Natriumhypochlorit (NaClO) für 1 h. Spülen Sie die Samen dann 5x mit sterilem Wasser ab, um restliches Chlor zu entfernen.
- Die Samen werden aseptisch auf 1/2 MS-Medium (2,37 g/L Murashige und Skoog (MS) Medium, 30 g/L Saccharose, 2,1 g/L Phytagel, pH 5,7, autoklaviert) aufgetragen.
- Bei der Reisscheidenmethode werden die Samen im sterilen Glasgefäß direkt mit MS-Medium beschichtet.
- Bei der Blattscheibenmethode werden die Samen 5-7 Tage lang auf MS-Platten gelegt und in die Wachstumsmatrix oder den Boden umgepflanzt (Abbildung 1A).
- Züchten Sie die Sämlinge in einem Wachstumsraum mit einer 12 h hellen/12 h dunklen Photoperiode.
2. Gewebevorbereitung und Vorbehandlung
- Reisscheide
- Schneiden Sie die Hülle von 10 Tage alten Reissämlingen 1 Tag vor dem ROS-Test mit einer scharfen Rasierklinge oder einer chirurgischen Klinge zur Vorbehandlung in 3-mm-Segmente (Abbildung 1B).
- Platzieren Sie fünf Mantelsegmente in einer einzelnen Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte mit 100 μl ddH2 O für 10-12 h im Dunkeln bei 25 °C, wodurch wundverletzungsbedingte Ionenleckagen und Abwehrreaktionen nachlassen können (Abbildung 2).
HINWEIS: Es ist ein wichtiger Schritt, darauf zu achten, dass die Schnitte vertikal gehalten werden, um eine gleichmäßige Schnittfläche zu gewährleisten, die der Erhebungslösung ausgesetzt ist, um hochreproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Bewegen Sie die Segmente vorsichtig. Machen Sie keine zusätzlichen Schnitte oder Wunden an den Segmenten, die eine Quelle für Datenvariationen sein könnten. Grundsätzlich muss jeder Test mindestens fünf Replikate enthalten, da die Variation des ROS-Wertes groß ist. Je mehr Replikate gesetzt werden, desto zuverlässiger sind die Daten.
- Blattscheibe
- Schneiden Sie die Blattscheiben (4 mm Durchmesser) von 4-6 Wochen alten Reispflanzen mit einem Biopsienstanz mit einem Kolben ab. Schneiden Sie die Blattscheiben immer aus dem mittleren Drittel des zweiten Blattes (von oben nummeriert) der Hauptdeichsel ab, um die Datenvariation zu verringern (Abbildung 1C).
- Legen Sie eine Blattscheibe für 10-12 h zur Vorbehandlung in eine einzelne Vertiefung einer 96-Well-Mikrotiterplatte, die 100 μl ddH 2 O enthält, wodurch die wundungsbedingten Reaktionen nachlassen können, da diese die Induktion von ROS durch PAMPs beeinträchtigen könnten (Abbildung 2).
HINWEIS: Bedienen Sie die Blattscheiben vorsichtig. Machen Sie im Experiment keine zusätzlichen Schnitte oder Wunden an den Bandscheiben, die zu Datenabweichungen führen könnten. Die Induktion von ROS erfolgt meist aus den Zellen der Schnittkante, da die Oberflächen von Reisgewebe (Blätter oder Scheiden) mit hydrophoben Schichten bedeckt sind. Nur die Zellen der Schnittkanten kommen mit der Erhebungslösung in Kontakt (siehe Abschnitt Diskussion). - Lassen Sie alle Blattscheiben mit der abaxialen Oberfläche nach oben in den Vertiefungen einer Mikrotiterplatte zur Wasservorbehandlung schwimmen, um blattseitige Variationen zu vermeiden.
Abbildung 1: Die Wachstumsbedingungen und Stadien der Reissämlinge für die Scheidenprobenahme und Teile der Reisscheide und der Reisblätter, die im Assay verwendet wurden. (A) Reissämlinge, die 10 Tage lang unter sterilen Bedingungen auf 1/2 MS-Medium gezüchtet wurden, können für den ROS-Test entnommen werden. Sterilisierte Reissamen wurden auf 1/2 MS-Medium kultiviert und in einer 12 h hellen/12 h dunklen Photoperiode in einem Klarglasfläschchen mit einem Durchmesser von 8,5 cm und einer Höhe von 15 cm gezüchtet. (B) Schematische Darstellung der Probenahmeteile der Blattscheiden. Blattscheiden wurden von 10 Tage alten Reissämlingen geschnitten. Die Positionen der Blattscheiden befanden sich über den Wurzeln und unter dem ersten Blatt. (C) Schematische Darstellung der Probenahmeposition der Blattscheiben. Die Blattscheiben können in jedem Wachstumsstadium aus dem mittleren Drittel des zweiten Blattes (Zählung von oben) der Hauptfräse gesunder Reispflanzen geschnitten werden. Abkürzungen: ROS = reaktive Sauerstoffspezies; MS = Murashige und Skoog. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Schematische Darstellung des Plattenaufbaus zur Messung der ROS-Produktion mit verschiedenen Linien von Oryza sativa. Vorbehandlung und Test von Reisgewebe mit einer 96-Well-Platte. Linie 1, Linie 2 und Linie 3 (bis zu acht Linien auf einer Platte) können beliebiges Material von Interesse, verschiedene Sorten, Mutanten oder transgene Linien sein. Die Gewebe wurden mit Eilitierlösungen mit PAMP (PAMP, weiß) oder ohne PAMP (ddH2O, grau) stimuliert, um die ROS-Reaktion zu messen. Es ist zu beachten, dass das Zeitintervall zwischen den Messwerten umso länger ist, je mehr Proben getestet werden sollen. Abkürzungen: ROS = reaktive Sauerstoffspezies; PAMP = Pathogen-assoziiertes molekulares Muster; ddH2O = doppelt destilliertes Wasser. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
3. Vorbereiten der Erhebungslösung
- L-012-Pulver wird in 20 mM (6,23 mg/ml) wässriger Lösung mitddH2Ogelöst, um die Stammlösung herzustellen. Anschließend wird die Stammlösung mit 50 mM Tris HCl-Puffer (pH 7,5) verdünnt, um die Arbeitslösung in der Endkonzentration von 500 μM L-012 herzustellen. Halten Sie die Stammlösung gefroren und verdünnen Sie sie vor Gebrauch auf die Arbeitslösung.
- Bereiten Sie die Auslöselösung vor, die PAMP, L-012 und Meerrettichperoxidase (HRP; 10 mg/ml in ddH2O) enthält. Für eine 10-ml-Auslöserlösung mischen Sie 9,4 ml 50 mM Tris HCl-Lösung (pH 7,5), 400 μl der L-012-Lösung, 100 μl HRP und 100 μl flg22 (PAMP; 10 mM in ddH2O). Für die Negativkontrolle werden anstelle von PAMP 100 μl ddH2O zugegeben.
HINWEIS: Bewahren Sie die vorbereiteten Auslöserlösungen bei Raumtemperatur auf, um Kältestress für Reisgewebe zu vermeiden. Bei Bedarf können auch andere PAMPs zur Behandlung verwendet werden, wie z. B. Chitin (20 ng/ml in der Endkonzentration). Da L-012 lichtempfindlich ist, decken Sie alle Röhrchen mit L-012-Lösung mit Aluminiumfolie ab.
4. Starten der Software und Einrichten des Protokolls mit dem referenzierten Mikroplatten-Reader (siehe Materialtabelle)
HINWEIS: Es dauert einige Zeit, die Parameter der Mikroplatten-Reader-Software einzurichten. Es wird empfohlen, die Maschine und das Protokoll vorzubereiten (ein Klick, um fortzufahren), bevor Sie die Erhebungslösung hinzufügen.
- Starten Sie die Software. Klicken Sie auf die Schaltfläche Experimente , um ein neues Protokoll zu erstellen oder ein vorhandenes Protokoll zu verwenden.
- Klicken Sie im Popup-Fenster auf Prozedur , um die Platte einzurichten. Wählen Sie die zu überwachenden Vertiefungen aus der Platte aus.
- Klicken Sie auf Kinetic starten , um die Gesamtlaufzeit und das Leseintervall festzulegen. Stellen Sie die Laufzeit auf 35 Minuten oder länger ein, abhängig von den experimentellen Anforderungen. Um die Messwerte so oft wie möglich zu erhalten, wählen Sie Minimales Intervall aus. Wählen Sie für die Integrationszeit je nach Signalintensität 1 s oder länger.
HINWEIS: Das Leseintervall hängt von der Anzahl der Abtastungen und der Dauer der Signalintegration ab. - Klicken Sie auf Validieren | OK , um die Einstellungen zu bestätigen.
- Klicken Sie im Popup-Fenster auf Neue Platte erkennen und warten Sie, bis die Software das Dialogfeld mit der Ladeplatte auffordert. Legen Sie die zu prüfende Platte auf den Träger.
- Halten Sie hier an, um zu warten, bis das Erhebungssystem eingerichtet wurde (im nächsten Abschnitt). Sobald das Erhebungssystem bereit ist, klicken Sie auf Ausführen , um den Messwert zu starten.
5. Etablierung des Erhebungssystems und Messung der ROS-Produktion in Echtzeit
- Entfernen Sie das ddH2O vorsichtig aus den Vertiefungen, die das vorbehandelte Gewebe enthalten, und vermeiden Sie Gewebeschäden oder Austrocknung.
- Verwenden Sie eine Mehrkanalpipette, um 200 μl der Auslöselösung in die Vertiefungen mit den Geweben zu geben.
- Zum Mischen vorsichtig schütteln. Klicken Sie auf Ausführen , um mit der Erkennung zu beginnen.
HINWEIS: Bei der PAMP-Behandlung reagiert das Pflanzengewebe sehr schnell und produziert ROS. Daher wird empfohlen, zuerst die Negativkontrolle ohne PAMP zu behandeln, um die Operationszeit zu verkürzen, wenn mehrere Behandlungen durchgeführt werden. Arbeiten Sie so schnell wie möglich, um die Verzögerung zwischen den Behandlungen zu reduzieren. Je kürzer die Zeit zwischen der Zugabe der Erhebungslösung und dem Beginn der Detektion ist, desto besser ist die Erfassung wichtiger experimenteller Daten.
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Ergebnisse
Hier nehmen wir Reismaterial als Beispiel, um die ROS zu bestimmen, die mit der flg22-Behandlung produziert werden. Die Erzeugung von ROS nach der Erhebung ist vorübergehend. Bei Reis wurde der Anstieg der ROS-Produktion erstmals in 1-2 Minuten festgestellt, erreichte seinen Höhepunkt bei 10-12 Minuten und kehrte in ~30-35 Minuten zum Ausgangswert zurück (Abbildung 3). Im Vergleich zum Kontrolltest, bei dem PAMP in der Auslöselösung fehlte, was zu keiner offensichtlichen ROS-Induktion führte...
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Diskussion
Ziel dieser Studie war es, eine hocheffiziente Methode zur Quantifizierung der frühen ROS-Produktion als Reaktion auf PAMP in Reisgeweben zu etablieren. Diese Methode bietet ein standardisiertes Verfahren zur Echtzeitbestimmung von Apoplasten-ROS, die aus behandeltem Reisgewebe hergestellt werden. Diese Methode ist einfach in der Bedienung, kostengünstig, klar in der Zusammensetzung und unabhängig von kommerziellen Kits. Mit dieser Methode können Forscher die Echtzeitproduktion von Apoplast-ROS untersuchen, wenn Pflanzen...
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Shanghai Natural Science Foundation (Fördernummer: 21ZR1429300/BS1500016), der Shanghai Jiao Tong University (Agri-X-Programm, Fördernummer: AF1500088/002), des Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (Fördernummer: ZXWH2150201/001) an Jiangbo Fan und durch das Medical-Engineering Collaboration Project der Shanghai Jiao Tong University (Fördernummer: 21X010301734) an Can Li unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 96-Well-Mikrotiterplatte | WHB WHB-96-01 | ||
| Ethanol absolut | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-Amino-5-chlor-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazin-1,4-dion, CAS #:143556-24-5 |
| Mikroplatten-Reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase aus Meerrettich (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Saccharose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
