Hier beschreiben wir eine Methode zur Echtzeit-Detektion der Produktion von apoplastischen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) in Reisgeweben in einer pathogen-assoziierten molekularmuster-ausgelösten Immunantwort. Diese Methode ist einfach, standardisiert und erzeugt unter kontrollierten Bedingungen hochreproduzierbare Ergebnisse.
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Methodenartikel
Echtzeit-Detektion der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies bei der Immunantwort in Reis mit einem Chemilumineszenz-Assay
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) spielen eine wichtige Rolle in einer Vielzahl von biologischen Prozessen, einschließlich der Wahrnehmung von abiotischen und biotischen Belastungen. Bei einer Infektion mit Krankheitserregern oder einer Herausforderung mit pathogen-assoziierten Chemikalien (Pathogen-assoziierte molekulare Muster [PAMPs]) wird in Pflanzen schnell eine Reihe von Immunantworten, einschließlich eines ROS-Bursts, induziert, was als PAMP-ausgelöste Immunität (PTI) bezeichnet wird. Ein ROS-Burst ist eine charakteristische PTI-Reaktion, die durch eine Gruppe von Plasmamembran-lokalisierten NADPH-Oxidasen - den Proteinen der RBOH-Familie - katalysiert wird. Die überwiegende Mehrheit der ROS besteht aus Wasserstoffperoxid (H2 O2), das durch eine Luminol-basierte Chemilumineszenzmethode leicht und stetig nachgewiesen werden kann. Chemilumineszenz ist eine photonenproduzierende Reaktion, bei der Luminol oder sein Derivat (wie L-012) unter Einwirkung eines Katalysators eine Redoxreaktion mit ROS durchläuft. In diesem Artikel wird eine optimierte L-012-basierte Chemilumineszenzmethode beschrieben, um die Produktion von Apoplast-ROS in Echtzeit bei PAMP-Auslösung in Reisgeweben zu erkennen. Die Methode ist einfach, stabil, standardisiert und unter fest kontrollierten Bedingungen hochgradig reproduzierbar.
Einleitung
Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) umfassen eine Reihe von chemisch aktiven Sauerstoffderivaten, einschließlich Superoxidanionenradikalen (O2-) und ihren Derivaten, Hydroxylradikalen (OH-), Wasserstoffperoxid und Produkten von Singulettsauerstoff oder Oxidations-Reduktions-Reaktionen, die ständig in Plastiden und Chloroplasten, Mitochondrien, Peroxisomen und anderen subzellulären Stellen produziert werden1 . ROS spielen eine wichtige Rolle in vielen biologischen Prozessen und sind für alle Pflanzen essentiell 2,3,4
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Protokoll
HINWEIS: Das Protokoll gilt für verschiedene Pflanzengewebe. Reisscheide und Blattscheiben wurden in diesem Protokoll für die ROS-Detektion bei PAMP-Erhebung verwendet. Da sich Unterschiede hauptsächlich aus der Probenahmemethode ergeben, werden im Folgenden nur die üblichen Verfahren beschrieben, wobei gegebenenfalls spezifische Schritte erwähnt werden.
1. Pflanzenkultur
- Sterilisieren Sie die entspelzten Reissamen mit 70% Ethanol für 1 min, dann mit 40% Natriumhypochlorit (NaClO) für 1 h. Spülen Sie die Samen dann 5x mit sterilem Wasser ab, um restliches Chlor zu entfernen.
- Die Samen werden aseptisch au....
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Ergebnisse
Hier nehmen wir Reismaterial als Beispiel, um die ROS zu bestimmen, die mit der flg22-Behandlung produziert werden. Die Erzeugung von ROS nach der Erhebung ist vorübergehend. Bei Reis wurde der Anstieg der ROS-Produktion erstmals in 1-2 Minuten festgestellt, erreichte seinen Höhepunkt bei 10-12 Minuten und kehrte in ~30-35 Minuten zum Ausgangswert zurück (Abbildung 3). Im Vergleich zum Kontrolltest, bei dem PAMP in der Auslöselösung fehlte, was zu keiner offensichtlichen ROS-Induktion führte.......
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Diskussion
Ziel dieser Studie war es, eine hocheffiziente Methode zur Quantifizierung der frühen ROS-Produktion als Reaktion auf PAMP in Reisgeweben zu etablieren. Diese Methode bietet ein standardisiertes Verfahren zur Echtzeitbestimmung von Apoplasten-ROS, die aus behandeltem Reisgewebe hergestellt werden. Diese Methode ist einfach in der Bedienung, kostengünstig, klar in der Zusammensetzung und unabhängig von kommerziellen Kits. Mit dieser Methode können Forscher die Echtzeitproduktion von Apoplast-ROS untersuchen, wenn Pflanzen.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Shanghai Natural Science Foundation (Fördernummer: 21ZR1429300/BS1500016), der Shanghai Jiao Tong University (Agri-X-Programm, Fördernummer: AF1500088/002), des Shanghai Collaborative Innovation Center of Agri-Seeds (Fördernummer: ZXWH2150201/001) an Jiangbo Fan und durch das Medical-Engineering Collaboration Project der Shanghai Jiao Tong University (Fördernummer: 21X010301734) an Can Li unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 96-Well-Mikrotiterplatte | WHB WHB-96-01 | ||
| Ethanol absolut | Innochem | A43543 | |
| flg22 | Sangon Biotech | p20973 | PAMP |
| Gen5 | BioTek | software | |
| L-012 | FUJIFILM | 120-04891 | 8-Amino-5-chlor-7-phenyl-2,3-dihydropyrido [3,4-d] pyridazin-1,4-dion, CAS #:143556-24-5 |
| Mikroplatten-Reader | BioTek | Synergy 2 | |
| MS Medium | Solarbio | M8521 | |
| NaCLO | Aladdin | S101636 | |
| Peroxidase aus Meerrettich (HRP) | Sigma | P8375 | |
| Phytagel | Sigma | P8169 | |
| Sampler | Miltex | 15110-40 | |
| Saccharose | Sangon Biotech | A502792 | |
| Tris | Sangon Biotech | A610195 |
Referenzen
- Gechev, T. S., Van Breusegem, F., Stone, J. M., Denev, I., Laloi, C. Reactive oxygen species as signals that modulate plant stress responses and programmed cell death. Bioessays. 28 (11), 1091-1101 (2006).
- Mittler, R. ROS are good. Trends in Plant Science. 22 (1), 11-19....
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Nachdrucke und Genehmigungen
