Summary
Nous présentons ici le principe, la structure et l’instruction du système intelligent de test de sensibilité antimicrobienne à haut débit / criblage des phages. Son application est illustrée par l’utilisation de Salmonella isolée de volailles dans le Shandong, en Chine, à titre d’exemple. L’indice Lar est calculé, et son importance dans l’évaluation de la résistance aux antimicrobiens est discutée de manière approfondie.
Abstract
Afin d’améliorer l’efficacité des tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) et du criblage à haut débit des phages pour les bactéries résistantes et de réduire le coût de détection, un système intelligent de criblage AST/phages à haut débit, comprenant un inoculateur matriciel à 96 points, un convertisseur d’acquisition d’images et le logiciel correspondant, a été développé selon les critères AST et les points de rupture de résistance (R) formulés par le Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI). L’AST et les statistiques de distribution de la concentration minimale inhibitrice (CMI) (de R/8 à 8R) de 1 500 souches de Salmonella isolées de volailles dans le Shandong, en Chine, contre 10 agents antimicrobiens ont été réalisées par le système intelligent de criblage AST/phages à haut débit. L’indice Lar, qui signifie « moins d’antibiose, moins de résistance et résiduel jusqu’à peu d’antibiose », a été obtenu en calculant la moyenne pondérée de chaque CMI et en divisant par R. Cette approche améliore la précision par rapport à l’utilisation de la prévalence de la résistance pour caractériser le degré de résistance aux antimicrobiens (RAM) des souches hautement résistantes. Pour les souches de Salmonella présentant une résistance aux antimicrobiens élevée, les phages lytiques ont été efficacement criblés à partir de la bibliothèque de phages par ce système, et le spectre de lyse a été calculé et analysé. Les résultats ont montré que le système intelligent de criblage AST/phages à haut débit était opérationnel, précis, très efficace, peu coûteux et facile à entretenir. Combiné au système vétérinaire de surveillance de la résistance aux antimicrobiens du Shandong, le système était adapté à la recherche scientifique et à la détection clinique liée à la résistance aux antimicrobiens.
Introduction
Les agents antimicrobiens ayant été largement utilisés pour prévenir les maladies infectieuses bactériennes, la résistance aux antimicrobiens (RAM) est devenue un problème de santé publique mondial1. La lutte contre la résistance aux antimicrobiens est actuellement la mission principale de surveillance de la résistance aux antimicrobiens des agents pathogènes épidémiologiques et de la thérapie synergique des agents antimicrobiens sensibles et des bactériophages lytiques2.
Les tests de sensibilité aux antimicrobiens (AST) in vitro sont le pilier de la surveillance du traitement et de la détection du niveau de résistance aux antimicrobiens. Il s’agit d’une partie importante de la pharmacologie antimicrobienne et de la base essentielle de la médication clinique. Le Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) des États-Unis et l’European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing (EUCAST) ont formulé et révisé les critères internationaux de l’AST et modifié et complété en permanence les méthodes AST et les points de rupture pour déterminer la CMI d’une certaine combinaison « organisme-agent antimicrobien » comme sensible (S), résistante (R) ou intermédiaire (I)3, 4. Le
Des années 1980 aux années 1990, les instruments automatiques de dilution du micro-bouillon ont été rapidement développés et appliqués à la pratique clinique, avec des exemples tels que Alfred 60AST, VITEK System, PHOENIXTM et Cobasbact 5,6,7. Cependant, ces instruments étaient coûteux, nécessitaient des consommables coûteux et leurs plages de détection étaient conçues pour les médicaments cliniquesdes patients 5,6,7. Pour ces raisons, ils ne sont pas adaptés à l’examen clinique vétérinaire et à la détection de grandes quantités de souches hautement résistantes. Dans cette étude, un système intelligent de criblage AST/phages à haut débit, comprenant un inoculateur matriciel à 96 points (Figure 1), un convertisseur d’acquisition d’images (Figure 2) et le logiciel correspondant8, a été mis au point pour effectuer une AST pour un lot de souches bactériennes contre plusieurs agents antimicrobiens à la fois par la méthode de dilution sur gélose. De plus, le système a également été utilisé pour détecter et analyser les schémas de lyse des phages contre les bactéries résistantes aux antimicrobiens9, et les phages lytiques ont été sélectionnés efficacement dans la bibliothèque de phages. Ce système s’est avéré efficace, abordable et facile à utiliser.
Figure 1 : Schéma structurel de l’inoculateur matriciel à 96 points. 1 : Plaque d’épingle d’inoculation ; 2 : Opérateur mobile ; 3 : Bloc de semences ; 4 : Plaque incubée ; 5 : Base ; 6 : Poignée de commande ; 7 : Goupille de limite. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Schéma structurel du convertisseur d’acquisition d’images. 1 : Coquille ; 2 : Écran d’affichage ; 3 : Salle d’acquisition d’images ; 4 : Base de la carte de détection ; 5 : Panneau de détection à l’intérieur et à l’extérieur de l’entrepôt ; 6 : Panneau de commande ; 7 : Dispositif de conversion d’acquisition d’images ; 8 : Source de lumière ; 9 : Scanner d’images. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Protocol
Les souches de Salmonella utilisées dans cette étude ont été prélevées sur des volailles du Shandong, en Chine, après avoir obtenu l’approbation du Comité de biosécurité de l’Institut des sciences animales et de médecine vétérinaire de l’Académie des sciences agricoles du Shandong, en Chine.
1. Application du système AST intelligent à haut débit8
- Préparation de l’inoculum
- Incuber l’organisme de contrôle de la qualité Escherichia coli et 93 souches de Salmonella à tester pour l’ASAT sur des plaques de gélose Mueller-Hinton (MHA) pendant 16 à 18 h à 37 °C3.
- Préparer l’inoculum de chaque souche pour qu’il corresponde à la norme de turbidité de McFarland de 0,5 selon la méthode spécifiée dans la norme CLSI3, puis diluer 10 fois.
- Placer 200 μL de solution saline normale stérile dans le 1er puits horizontal (A1) de la plaque à 96 puits en tant que témoin négatif, deux suspensions d’organisme de contrôle de la qualité dans les 2e et 3e puits horizontaux (A2 et A3) en tant que témoin positif et contrôle de la qualité, respectivement. Ajouter 200 μL des suspensions d’inoculum diluées de chaque coloration testée dans les 93 puits correspondants du bloc de semences à 96 puits.
- Préparation d’une plaque de gélose antimicrobienne
- Définissez les plages de concentration des différents agents antibactériens testés en fonction de la plage de calcul de l’indice Lar (de 0,125R à 8R). Les concentrations vont de la plage de contrôle de la qualité ou 0,0625R (sous réserve de la plage inférieure) à 8R.
REMARQUE : Si l’indice Lar n’est pas calculé, la plage de concentrations d’antibiotiques peut être réglée en fonction des besoins de l’AST. - Exécuter un schéma de dilution par doublement log2 pour la solution d’antibiotique en commençant par une concentration mère appropriée basée sur la méthode de dilution de la gélose spécifiée dans la norme CLSI3.
- Stériliser les flacons en verre de 50 ml contenant 18 ml de gélose Mueller-Hinton. Ajouter 2 mL des dilutions appropriées de la solution antimicrobienne à 18 mL de milieu fondu refroidi à 45-50 °C, bien mélanger et verser dans les plaques de l’enceinte de sécurité biologique.
- Laissez la gélose se solidifier à température ambiante (RT), laissez un espace sous le couvercle des plaques incubées et soufflez pour sécher la surface de la gélose avant de l’inoculer.
- Étiquetez les types d’agents antimicrobiens et les concentrations au verso des plaques incubées. Disposez les multiples plaques incubées de chaque agent antimicrobien dans une pile dans l’ordre de dilution du doublement log2.
- Préparez deux plaques de gélose sans médicament comme témoins pour chaque agent antimicrobien.
- Définissez les plages de concentration des différents agents antibactériens testés en fonction de la plage de calcul de l’indice Lar (de 0,125R à 8R). Les concentrations vont de la plage de contrôle de la qualité ou 0,0625R (sous réserve de la plage inférieure) à 8R.
- Étapes d’inoculation pour l’inoculateur matriciel à 96 points
- Installez la plaque d’inoculation autoclavée sur le support d’un inoculateur matriciel à 96 points dans l’enceinte de sécurité biologique.
- Placez le bloc de semences préparé avec les souches testées et une plaque incubée d’agar sur le support mobile, avec le même angle de positionnement pour les deux plaques.
- Poussez le support mobile de manière à ce que le bloc de semences se trouve directement sous la plaque d’inoculation.
- Appuyez sur la poignée de commande, déplacez la plaque de broches d’inoculation vers le bas et dirigez les 96 broches vers les inocules dans 96 puits du bloc de semences.
- Relâchez la poignée de commande avec la commande, puis réinitialisez la plaque de broches d’inoculation sous l’action du ressort.
- Appuyez 2 à 3 fois sur la poignée de commande pour bien remuer chaque inoculum et trempez-le. Poussez et déplacez la plaque de support de manière à ce que la plaque incubée se trouve directement sous la plaque de broches d’inoculation.
- Appuyez sur la poignée de commande, déplacez la plaque de broches d’inoculation vers le bas et arrêtez-vous pendant 1 à 2 secondes pour que les broches d’inoculation entrent complètement en contact avec la surface de la plaque incubée.
- Relâchez la poignée de commande. Cela complète une inoculation. Remplacez une autre plaque incubée et continuez le cycle jusqu’à ce qu’un groupe de plaques de gélose antimicrobienne soit terminé.
- Remplacez une autre plaque d’inoculation et un bloc de semences, et inoculez un autre groupe de souches testées. Cyclez jusqu’à ce que toutes les inoculations soient terminées.
REMARQUE : Inoculez d’abord une plaque de gélose de contrôle (sans agent antimicrobien), puis la plaque dans l’ordre de concentration du médicament de faible à élevée, et une deuxième plaque de gélose de contrôle en dernier pour vous assurer qu’il n’y a pas de contamination ou de transfert d’agent antimicrobien. Le volume d’inoculation dépend du volume du dépôt naturel de chaque broche d’environ 2 μL.
- Incubation des plaques de gélose antimicrobienne
- Incuber les plaques de gélose antimicrobienne inoculées à RT jusqu’à ce que l’humidité contenue dans les taches d’inoculum soit absorbée par la gélose.
- Retournez les plaques et incubez-les pendant 16 à 20 h à 37 °C pour les souches testées afin de vous assurer que les bactéries non inhibées forment des colonies.
- Acquisition d’images et statistiques de données
- Double-cliquez sur le système d’acquisition d’images AST matricielle à 96 points pour ouvrir le programme.
- Cliquez sur Informations sur le test dans la barre des tâches. Cliquez sur Nouveau pour créer une nouvelle tâche de test et remplissez les informations en fonction des invites, y compris le code, le nom, la source, les bactéries, le nombre de souches, les antibiotiques et le gradient.
- Cliquez sur Collecte de données > Photographier > élément de test pour sélectionner la nouvelle tâche créée. Cliquez sur Antibiotiques pour sélectionner le nom de l’antibiotique, puis cliquez sur Gradient pour sélectionner la concentration initiale de cet antibiotique.
- Cliquez sur Connecter pour vous connecter au convertisseur d’acquisition d’images.
- Placez les plaques incubées correspondantes sur la base de la plaque de détection avec l’angle manquant à l’avant droit pour l’orientation et poussez-les dans le convertisseur d’acquisition d’images.
- Cliquez sur Collection pour obtenir les images. Le gradient d’antibiotiques passera automatiquement au gradient suivant. Placez la plaque suivante à tour de rôle et continuez à cliquer sur Collection jusqu’à ce que les plaques de cet antibiotique aient été collectées.
- Cliquez sur Antibiotiques et sélectionnez le prochain ensemble de plaques incubées. Cliquez sur Dégradé pour sélectionner le dégradé de départ et passer à la prochaine série de collecte d’images.
- Après avoir terminé toutes les collectes, cliquez sur Envoyer. Le programme reconnaîtra automatiquement le nombre de pixels blancs formatés à chaque point d’inoculation dans les images, déterminera s’il y a formation de colonies et convertira les images en valeurs MIC.
- Cliquez sur Interroger pour obtenir tous les résultats de la CMI des souches par rapport aux antibiotiques testés.
REMARQUE : Le système AST intelligent à haut débit convient à la détermination des CMI de grands lots de souches bactériennes. Le processus de test, y compris la préparation, l’inoculation, l’incubation et la lecture des résultats, prend 3 jours. Les types d’antibiotiques et les plages de détection des CMI peuvent être réglés en fonction des besoins respectifs, et les principaux consommables peuvent être réutilisés.
- Calcul de l’indice Lar
- Déterminez l’indice Lar avec précision à l’aide de la formule : , où :
CMIi : concentration minimale inhibitrice.
La gamme de distributions de CMI de MIC-3 à MIC3 représente des concentrations en série doubles centrées sur R : 0,125R, 0,25R, 0,5R, R, 2R, 4R et 8R.
est de 2 i et l’intervalle dei est compris entre -3 et 3.
R : les points de rupture de résistance des bactéries aux agents antimicrobiens normalisés par le CLSI.
f : la distribution de fréquence du MIC.
NOTE : L’indice Lar général est la moyenne arithmétique de tous les indices Lar. Une fois l’indice Lar calculé, arrondissez la valeur finale à deux chiffres significatifs après la virgule.
- Déterminez l’indice Lar avec précision à l’aide de la formule : , où :
est de 2 i et l’intervalle dei est compris entre -3 et 3.2. Système intelligent de criblage de phages à haut débit9
- Préparation du bloc de graines de phages et des plaques incubées à double couche contenant des bactéries.
- Utilisez la méthode de gélose à double couche10 ou la méthode de culture liquide11 pour fabriquer différents phages. Diluer à une concentration parallèle appropriée avec un titre de 1 x 104-5 pfu/mL, et ajouter 200 μL de l’inoculum de phage dans le bloc de semences à 96 puits.
- Fabriquer des plaques à double couche avec des bactéries (10 mL de gélose inférieure [gélose 12 g/L] et 6 mL de gélose supérieure [6 g/L] avec 100 μL de bactéries [0,5 McFarland]) à tester.
- Fabriquez une plaque incubée à double couche pour chaque souche à tester. Laissez un espace sous le couvercle de la plaque à double couche et soufflez pour sécher la surface de la gélose dans l’enceinte de sécurité biologique.
- Test de dépistage
- Placez le bloc de graines de phage préparé et la plaque à double couche sur le support mobile de l’inoculateur matriciel à 96 points et transférez tous les inocula de phage sur la surface de la gélose semi-agée. Continuez les cycles jusqu’à ce que toutes les souches testées soient terminées.
- Laissez les plaques à double couche inoculées rester à RT jusqu’à ce que l’humidité dans les taches d’inoculum soit complètement absorbée dans la gélose semi-aclé.
- Retournez les plaques et incubez-les dans des conditions appropriées pour les souches testées pendant 4 à 6 h pour vous assurer que des taches lytiques claires se forment.
- Analyse des données
- Obtenir et enregistrer l’image du résultat expérimental de chaque plaque double couche par le convertisseur d’acquisition d’images (étapes 1.5.4-1.5.6).
- Enregistrez le nombre et la morphologie des différentes formes de taches dans une feuille de calcul à partir des images obtenues, et calculez les proportions respectives des différents types de phages.
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Representative Results
Suivant le protocole du système AST intelligent à haut débit, son application a été illustrée par Salmonella provenant de volailles du Shandong, en Chine, à titre d’exemple.
La figure 3 montre la croissance de souches de Salmonella sur des plaques de gélose contenant de l’ampicilline (R de 32 μg/mL) à des concentrations de 2 à 256 μg/mL déterminées par le convertisseur d’acquisition d’images. Le1er puits horizontal A1 était le témoin négatif et n’a montré aucune croissance de colonie ; A2 et A3 étaient les souches de contrôle de la qualité avec une CMI de 4 μg/mL (formant une colonie sur la plaque de gélose avec 2 μg/mL d’ampicilline, mais pas sur celle de 4 μg/mL), à l’intérieur de la plage de contrôle de la qualité normalisée par le CLSI (2-8 μg/mL). La CMI de la souche Salmonella dans A4 était de 64 μg/mL, tandis que celle de A5 était de 16 μg/mL. Les distributions de CMI de 93 souches de Salmonella contre l’ampicilline ont été calculées automatiquement par le logiciel.
Figure 3 : Morphologie de Salmonella sur une série de plaques de culture avec de l’ampicilline. 8 horizontales : A-H, 12 verticales : 1-12. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Le système AST à haut débit a été appliqué pour déterminer la résistance aux antimicrobiens des souches de Salmonella provenant d’animaux de la province du Shandong. Les données du MIC ont été téléchargées dans la base de données de Varms (http://www.varms.cn/)12. Les résultats statistiques sont présentés dans le tableau 1. Au total, 10 agents antimicrobiens ont été testés contre 300 à 1 500 souches de Salmonella , ce qui montre les avantages de ce système en termes de débit élevé.
Selon les seuils de résistance de la norme CLSI, le taux de résistance (R%) a été calculé en pourcentage des souches avec CMI ≥ R parmi les souches testées (tableau 1). Les valeurs R% de l’ampicilline, de la ciprofloxacine et de l’amoxicilline-acide clavulanique étaient supérieures à 50%, les valeurs R% de la doxycycline, du florfénicol, du céfotaxime et de l’enrofloxacine étaient de 30% à 50% et les valeurs R% de la gentamicine, de l’amikacine et du méropénème étaient inférieures à 30%. Le méropénème n’a pas été utilisé chez les animaux élevés industriellement et a montré un pourcentage R de 7 %.
Le pourcentage R indiquait la proportion de souches bactériennes ayant des CMI supérieures à R, tandis que les distributions de CMI indiquaient le nombre de souches avec chaque CMI pour décrire plus précisément la résistance aux antimicrobiens globale de Salmonella . Par exemple, le pourcentage R d’ampicilline était de 73 % et le nombre maximal d’échantillons (916 souches) était concentré avec une CMI ≥ 256 μg/mL, ce qui indique que la résistance de Salmonella à l’ampicilline était assez grave.
Tableau 1 : Distributions des CMI, R% et valeurs de l’indice Lar de Salmonella provenant d’animaux de la province du Shandong. Les CMI correspondant à la police en gras sont les valeurs R des agents antimicrobiens. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.
Pour des raisons d’uniformité et de comparabilité, 3 gradients ont été étendus vers l’avant et vers l’arrière, centrés sur le R de chaque médicament. D’après les distributions MIC de sept gradients, l’indice Lar a été calculé par la formule suivante :
.
À titre d’exemple pour l’ampicilline, la valeur R était de 32 μg/mL, le nombre d’échantillons était de 1,414 et Lar = (4/32) x (245/1414) + (8/32) × (16/1414) + (16/32) × (117/1414) + (32/32) × (27/1414) + (64/32) × (36/1414) + (128/32) × (57/1414) + (2566) /32) × (916/1414) = 2-3 × (245/1414) + 2-2 × (16/1414) + 2-1 × (117/1414) + 20 × (27/1414) + 21 × (36/1414) + 22 × (57/1414) + 2 3 × (916/1414) = 5,48. À l’aide de cette formule, les indices Lar d’autres agents antimicrobiens ont été calculés et sont présentés dans le tableau 1.
L’importance de l’indice Lar était d’indiquer avec précision le degré de gravité de la RAM. Si l’on prend l’exemple de la ciprofloxacine et de l’amoxicilline-acide clavulanique, leurs valeurs de R% étaient similaires, à 68 % et 65 %, respectivement, mais leurs indices Lar différaient significativement, à 4,57 et 1,76, respectivement. La raison en est clairement illustrée par la distribution des valeurs élevées de CMI dans le tableau 1, dans lequel 71,3 % des souches résistantes à la ciprofloxacine étaient réparties dans 8R (32 μg/mL), tandis que les CMI des souches résistantes à l’amoxicilline-acide clavulanique étaient principalement concentrées sur R et 2R, et la proportion de 8R était faible (8,69 %). Par conséquent, l’indice Lar de la ciprofloxacine était supérieur à celui de l’amoxicilline-acide clavulanique, ce qui indique que la proportion de souches hautement résistantes à la ciprofloxacine était plus élevée que celle des souches résistantes à l’amoxicilline-acide clavulanique. L’indice Lar était un indicateur plus précis du degré de résistance aux antimicrobiens que le taux de résistance.
Selon la formule de l’indice Lar, si les CMI de toutes les souches d’un médicament donné étaient R, l’indice Lar serait de 1 ; si les CMI de toutes les souches étaient 2R, l’indice Lar serait de 2. Par conséquent, l’indice Lar a montré de multiples relations entre les CMI complets et la valeur R correspondante, à l’exception des concentrations de bord. L’indice Lar a été utilisé pour évaluer le degré de RAM, et l’avantage était plus prononcé si la RAM était plus élevée. Pour des raisons d’uniformité et de comparabilité, la plage de calcul de l’indice Lar était de sept CIM avec les 3 gradients avant et arrière centrés sur la valeur R, et la moyenne pondérée a été obtenue en intégrant les différents agents antimicrobiens, le nombre de souches et les distributions de CMI. Par conséquent, la plage de valeurs de l’indice Lar était de 0,125 à 8. Plus le Lar était proche de 0,125, plus l’AMR était faible, et plus il était proche de 8, plus l’AMR était élevé. Cependant, il n’y avait pas de relation proportionnelle entre Lar et R à la concentration de bord. Lorsque les agents antimicrobiens et la plage de calcul de l’indice Lar ont été définis, le Lar général a été normalisé en une valeur globale intuitive utilisée pour comparer et évaluer directement le degré et la tendance à l’évolution de la résistance aux antimicrobiens dans les différentes conditions de différentes bactéries, utilisateurs, années, régions, etc.
Suivant le protocole du système intelligent de criblage des phages, l’application a été démontrée en prenant 96 phages de Salmonella pour lyser des souches de Salmonella de la résistance aux antimicrobiens à titre d’exemple, et le profil lytique des phages a été analysé.
Quatre-vingt-seize phages ont été transférés sur des plaques à double couche contenant Salmonella par un inoculateur matriciel à 96 points. La morphologie des taches formées est illustrée à la figure 4. Il y avait quatre types principaux (mais pas limités à quatre) : la tache ronde claire (●), la collection de plaques (), la tache lytique trouble () et la tache non lytique (
○).
Figure 4 : Morphologie des taches de Salmonella sur des plaques de gélose à double couche. 1 et 2 : les motifs produits par 96 phages sur différentes souches de Salmonella. « ● » tache claire ronde, « » collection de plaques, « » tache lytique trouble, « ○ » pas de tache lytique) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Sur les plaques à double couche, les taches lytiques de différents phages sur différentes bactéries hôtes étaient de morphologie différente10. La « tache lytique claire et ronde » résultait d’un phage qui pouvait tuer de manière fiable l’hôte sur la plaque, mais qui pouvait ou non se répliquer avec succès aux dépens de cet hôte. Dans ce cas, une dilution supplémentaire a été nécessaire pour déterminer de manière concluante le type. La « collection de plaques » a été formée par de vraies plaques. Chaque zone individuelle de lyse a clairement été produite à partir d’un seul centre infectieux, ce qui a démontré que le phage s’était répliqué aux dépens des bactéries sur la plaque. La « tache lytique trouble » résulte d’un phage qui ne tue pas de manière fiable l’hôte sur la plaque et qui peut ou non se répliquer avec succès aux dépens de cet hôte. Dans ce cas, il y avait plus d’une possibilité, ce qui nécessitait une confirmation basée sur d’autres intérêts de recherche. L’expression « pas de tache lytique » indiquait une nature non lytique.
De plus, l’utilisation de ce système pour les tests préliminaires pourrait essentiellement déterminer si les souches et les bactériophages ont été dupliqués. Si différentes espèces de Salmonella étaient sélectionnées et que les profils de deux bactériophages étaient identiques, cela indiquait que les bactériophages pouvaient être dupliqués. Si des bactériophages non répétitifs ont été sélectionnés pour infecter des espèces inconnues de Salmonella à partir de sources cliniques et que le profil des phages était le même, cela indiquait que les souches de Salmonella pourraient être la même souche. En outre, le nombre et la proportion de doublons avaient des valeurs de référence pour l’enquête épidémiologique.
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Discussion
La méthode de dilution de la gélose est bien établie et largement utilisée. Le principe du système AST à haut débit était celui de la méthode de dilution sur gélose. L’une des étapes critiques du protocole a été le transfert précis à haut débit de 96 inocula en une seule fois, qui a été effectué plusieurs fois de suite. Pour compléter cette étape critique, les broches de l’inoculateur matriciel à 96 points étaient uniformes et très lisses. Le dépôt naturel de chaque broche était d’un volume d’environ 2 μL, qui s’est agrégé en petites gouttelettes à la surface de la gélose pour être rapidement absorbée dans la gélose, sans s’écouler ni éclabousser pour provoquer une contamination croisée. La deuxième étape critique a été le traitement statistique de grandes quantités de données AST. Avec l’inoculation à haut débit, les données de test devaient être déterminées et la charge de travail était énorme. L’analyse intelligente et les résultats statistiques produits par le convertisseur d’acquisition d’images intelligent et le logiciel de support ont été une solution parfaite à ce problème. Les résultats de l’AST ont été automatiquement téléchargés directement dans la base de données Varms. L’efficacité et la précision de l’interprétation des résultats ont été améliorées, et les erreurs causées par les facteurs humains ont été réduites13.
La troisième étape cruciale a consisté à proposer l’indice Lar de la résistance aux antimicrobiens. À l’heure actuelle, il existe peu d’indices d’évaluation complets de la résistance aux antimicrobiens dans le monde. Selon la littérature, un indice de résistance aux médicaments (ANREF) a été décrit par Laxminarayan et Klugman pour mesurer les changements dans l’efficacité des antibiotiques14,15. Il a combiné la prévalence de la résistance et la fréquence relative des prescriptions, mais n’a pas pu caractériser le degré de résistance aux antimicrobiens et évaluer les changements dans les niveaux élevés de résistance aux médicaments. L’indice d’efficacité des médicaments (DEI)16, un autre indice dérivé de l’ANREF, présente le même désavantage que l’ANREF. Ainsi, l’indice Lar a été proposé, qui consistait en trois étapes : (1) Les CMI des souches bactériennes ont été normalisées en fonction de la valeur R respective, éliminant ainsi les différences d’agents antimicrobiens causées par les différentes valeurs R de l’étalon AST ; (2) D’après les distributions de la CMI, les valeurs moyennes pondérées ont été calculées de manière à refléter le degré de résistance aux antimicrobiens plus précisément que le taux de résistance ; (3) La moyenne arithmétique des indices Lar de plusieurs agents antimicrobiens, c’est-à-dire le Lar général, pourrait refléter la situation globale de la RAM, ce qui faciliterait l’évaluation et la comparaison de la RAM à différents niveaux.
La conception matérielle de ces appareils était raisonnable et simple à utiliser, et toutes les pièces fonctionnaient sans problème. Il n’y a pas eu de problème de brouillage ou de défaut. La conception du logiciel de prise en charge répondait aux exigences personnalisées de l’AST et du criblage des phages et était facile à utiliser et à utiliser. Un instrument a été équipé de 4 à 5 boîtes de broches d’inoculation pour de multiples scénarios applicables de transfert bactérien par lots. Les composants principaux de cet instrument étaient la plaque d’inoculation et les broches en acier inoxydable, qui s’adaptaient à une variété d’environnements et pouvaient être autoclavées, démontées et remplacées. Les broches d’inoculation ont été conçues pour être combinées de n’importe quelle manière.
Il était impératif de mettre en place un système de surveillance de la résistance aux antimicrobiens en raison de la prévalence d’agents pathogènes résistants causés par l’utilisation abusive d’antibiotiques. Depuis 2008, l’équipe de santé publique de l’Institut des sciences animales et de médecine vétérinaire de l’Académie des sciences agricoles du Shandong effectue un suivi de la résistance aux antimicrobiens sur les animaux successivement dans la province du Shandong1 2,13,17. Il était nécessaire de détecter efficacement les CMI des agents pathogènes pour réguler l’utilisation d’agents antimicrobiens en raison du niveau élevé de résistance vétérinaire et du grand volume de surveillance. Cependant, les instruments pertinents pour l’AST sont coûteux, et le coût de l’exploitation et des consommables est élevé et ne convient pas à un large éventail d’exploitations à grande échelle. Pour cette raison, la mise au point du système AST intelligent à haut débit et la standardisation de son application ont favorisé la mise en place d’un système solide pour la technologie de surveillance de la résistance aux antimicrobiens. Selon des recherches antérieures12,13, le système AST intelligent à haut débit a atteint une bonne répétabilité et une bonne stabilité pour correspondre à la norme CLSI et a été appliqué à l’AST et à l’analyse des bactéries pathogènes cliniques chez les animaux. À ce jour, des données complètes sur la résistance aux antimicrobiens pour plus de 20 000 souches épidémiques ont été accumulées12. Pour les bactéries résistantes présentes dans le processus de surveillance, ce système pourrait également être utilisé pour le criblage rapide à haut débit des phages lytiques afin de coopérer avec des agents antimicrobiens afin de réduire la résistance aux antimicrobiens. L’application de l’inoculateur matriciel à 96 points et du convertisseur d’acquisition d’images pour le criblage de la lyse des phages était une fonction étendue, et aucun autre instrument n’avait été appliqué auparavant dans ce domaine.
Le système intelligent de criblage AST/phages à haut débit a combiné l’AST avec des bactériophages lytiques pour assurer la surveillance, le contrôle et la réduction de la résistance aux antimicrobiens. Dans le même temps, l’indice Lar a été utilisé de manière plus intuitive et concise pour évaluer les contributions de divers facteurs et de nouvelles technologies antibactériennes à la réduction de la résistance aux antimicrobiens.
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Disclosures
Yuqing Liu et al. ont déposé des brevets chinois pour l’inoculateur matriciel à 96 points et le convertisseur d’acquisition d’images et leurs applications (numéro de brevet ZL 201610942866.3 et numéro de brevet ZL 201910968255.X).
Acknowledgments
Ces travaux ont été financés par le Projet national de recherche et de développement clé (2019YFA0904003) ; Système industriel agricole moderne dans la province du Shandong (SDAIT-011-09) ; Projet d’optimisation de la plate-forme de coopération internationale (CXGC2023G15) ; Principales tâches d’innovation du projet d’innovation en sciences et technologies agricoles de l’Académie des sciences agricoles du Shandong, Chine (CXGC2023G03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well culture plate | Beijing lanjieke Technology Co., Ltd | 11510 | |
| 96-dot matrix AST image acquisition system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| 96-dot matrix inoculator | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB8274-1 | |
| Amikacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A857053 | |
| Amoxicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A822839 | |
| Ampicillin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | A830931 | |
| Analytical balance | Sartorius | BSA224S | |
| Automated calculation software for Lar index of AMR | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Bacteria Salmonella strains | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Animal origin |
| Bacterial resistance Lar index certification management system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Ceftiofur | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C873619 | |
| Ciprofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824343 | |
| Clavulanic acid | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C824181 | |
| Clean worktable | Suzhou purification equipment Co., Ltd | SW-CJ-2D | |
| Colistin sulfate | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | C805491 | |
| Culture plate | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Doxycycline | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | D832390 | |
| Enrofloxacin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | E809130 | |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SLGP033RB | |
| Florfenicol | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | F809685 | |
| Gentamicin | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | G810322 | |
| Glass bottle 50 mL | Xuzhou Qianxing Glass Technology Co., Ltd | QX-7 | |
| High-throughput resistance detection system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Image acquisition converter | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | Patented product |
| Meropenem | Shanghai McLean Biochemical Technology Co., Ltd | M861173 | |
| Mueller-Hinton agar | Qingdao hi tech Industrial Park Haibo Biotechnology Co., Ltd | HB6232 | |
| Petri dish 60 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16021-1 | |
| Petri dish 90 mm x 15 mm | Qingdao Jindian biochemical equipment Co., Ltd | 16001-1 | |
| Salmonella phages | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | N/A | |
| Shaker incubator | Shanghai Minquan Instrument Co., Ltd | MQD-S2R | |
| Turbidimeter | Shanghai XingBai Biotechnology Co., Ltd | F-TC2015 | |
| Varms base type library system V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Vertical high-pressure steam sterilizer | Shanghai Shen'an medical instrument factory | LDZX-75L | |
| Veterinary pathogen resistance testing management system | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright | |
| Veterinary resistance cloud monitoring and phage control platform V1.0 | Institute of Animal Science and Veterinary Medicine, Shandong Academy of Agricultural Sciences | In-house software copyright |
References
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