Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tüm Hücre Yama-Kelepçe Tekniği ile H9c2 Kardiyomiyositlerine Voltaja Bağlı Potasyum Akımı Kaydı

Published: November 11, 2022 doi: 10.3791/64805
Automatic Translation
*1, *1, 1, 2, 3,4, 5, 1,3,4, 4
1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Bu protokol, tüm hücre yama kelepçesi tekniğini kullanarak H9c2 kardiyomiyositlerinde voltaj kapılı potasyum (Kv) kanal akımlarının gerçek zamanlı ve dinamik olarak elde edilmesi için etkili bir yöntem tanımlamaktadır.

Abstract

Miyokard hücre zarı üzerindeki potasyum kanalları, hücre elektrofizyolojik aktivitelerinin düzenlenmesinde önemli bir rol oynamaktadır. Ana iyon kanallarından biri olan voltaj kapılı potasyum (Kv) kanalları, ilaca bağlı miyokard hasarı ve miyokard enfarktüsü gibi bazı ciddi kalp hastalıkları ile yakından ilişkilidir. Bu çalışmada, H9c2 kardiyomiyositlerinde 1.5 mM 4-aminopiridin (4-AP, geniş spektrumlu potasyum kanal inhibitörü) ve akonitinin (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM ve 200 μM) Kv kanal akımı (IKv) üzerindeki etkilerini belirlemek için tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılmıştır. 4-AP'nin IKv'yi yaklaşık% 54 oranında inhibe ettiği, AC'nin I Kv üzerindeki inhibitör etkisinin doza bağımlı bir eğilim gösterdiği bulunmuştur (25μM için etki yok, 50 μM için% 30 inhibitör oran, 100 μM için% 46 inhibitör oranı ve 200 μM için% 54 inhibitör oranı). Daha yüksek duyarlılık ve hassasiyet özellikleri nedeniyle, bu teknik kardiyotoksisitenin araştırılmasını ve etnotıbbın iyon kanallarını hedeflemesinin farmakolojik etkilerini teşvik edecektir.

Introduction

İyon kanalları, hücre zarının lipit çift katmanına gömülü özel entegre proteinlerdir. Aktivatörlerin varlığında, bu tür özel entegre proteinlerin merkezleri, uygun boyut ve yükteki iyonların pasif bir taşıma yöntemiyle geçmesine izin veren oldukça seçici hidrofilik gözenekler oluşturur1. İyon kanalları, hücre uyarılabilirliğinin ve biyoelektriğin temelidir ve çeşitli hücresel aktivitelerde önemli bir rol oynar2. Kalp, aksiyon potansiyelleri tarafından başlatılan uyarılma-kasılma-birleşmiş bir süreçten kaynaklanan düzenli kasılmalar yoluyla diğer organlara kan sağlar3. Önceki çalışmalar, kardiyomiyositlerde aksiyon potansiyellerinin oluşumunun hücre içi iyon konsantrasyonundaki değişimden kaynaklandığını ve insan kardiyomiyositlerinde Na +, Ca2 + ve K + iyon kanallarının aktivasyonu ve inaktivasyonunun belirli bir sırayla aksiyon potansiyellerinin oluşumuna yol açtığını doğrulamıştır 4,5,6. Bozulmuş voltaj kapılı potasyum (Kv) kanal akımları (IKv) normal kalp ritmini değiştirebilir ve önde gelen ölüm nedenlerinden biri olan aritmilere yol açabilir. Bu nedenle, IKv'nin kaydedilmesi, hayatı tehdit eden aritmilerin tedavisinde kullanılan ilaçların mekanizmalarını anlamak için kritik önemesahiptir 7.

Kv kanalı, potasyum kanalının önemli bir bileşenidir. Kv kanalının koordinasyon fonksiyonu, memeli kalbinin elektriksel aktivitesinde ve miyokard kontraktilitesinde önemli bir rol oynar 8,9,10. Kardiyomiyositlerde, aksiyon potansiyellerinin genliği ve süresi, dışa doğru K + akımlarının çoklu Kv kanalı alt tipleri11 tarafından birlikte iletilmesine bağlıdır. Kv kanal fonksiyonunun düzenlenmesi, kardiyak aksiyon potansiyelinin normal repolarizasyonu için çok önemlidir. Kv iletkenliğindeki en ufak bir değişiklik bile kardiyak repolarizasyonu büyük ölçüde etkiler ve aritmi olasılığını arttırır12,13.

Hücresel elektrofizyolojik araştırmalarda temel bir yöntemi temsil eden hücre zarının küçük bir alanı ile tüm hücre yama-kelepçe kaydı için pipet ucu arasında negatif basınç uygulanarak yüksek dirençli bir sızdırmazlık oluşturulabilir. Sürekli negatif basınç, hücre zarının pipet ucuyla temas etmesini ve pipetin iç duvarına yapışmasını sağlar. Ortaya çıkan tam elektrik devresi, hücre zarı14'ün yüzeyi boyunca herhangi bir tek iyon kanalı akımının kaydedilmesini sağlar. Bu teknik, hücre zarı iyon kanalı akımı için çok yüksek bir hassasiyete sahiptir ve tüm iyon kanallarındaki akımları tespit etmek için kullanılabilir ve uygulamalar son derece geniştir15. Ayrıca, floresan etiketleme ve radyoaktif etiketleme ile karşılaştırıldığında, yama kelepçesi daha yüksek otorite ve doğruluğa sahiptir16. Şu anda, tüm hücre yama-kelepçe tekniği, Kv kanal akımlarına etki eden geleneksel Çin tıbbı bileşenlerini tespit etmek için kullanılmıştır17,18,19. Örneğin, Wang ve ark. tüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullandılar ve lotus tohumunun etkili bileşeninin, aktif durum kanallarını bloke ederek Kv4.3 kanalının inhibisyonunu sağlayabileceğini doğruladılar19. Aconitine (AC), Aconitum carmichaeli Debx ve Aconitum sarkaç Busch gibi Aconitum türlerinin etkili ve aktif bileşenlerinden biridir. Çok sayıda çalışma, aşırı dozda AC'nin aritmilere ve hatta kalp durmasına neden olabileceğini göstermiştir20. AC ve voltaj kapılı iyon kanalları arasındaki etkileşim, kardiyotoksisitenin anahtar mekanizması olan hücre içi iyon homeostazının bozulmasına yol açar21. Bu nedenle, bu çalışmada, AC'nin kardiyomiyositlerin IKv'si üzerindeki etkilerini belirlemek için tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılmıştır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Ticari olarak elde edilen H9c2 sıçan kardiyomiyositleri ( Malzeme Tablosuna bakınız), %5 CO2 nemlendirilmiş bir atmosferde 37 °C'de %10 ısıl inaktive fetal sığır serumu (FBS) ve %1 penisilin-streptomisin içeren DMEM'de inkübe edildi. Daha sonra normal H9c2 hücrelerinde ve 4-AP veya AC ile tedavi edilen hücrelerde IKv'deki değişiklikleri tespit etmek için tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanıldı (Şekil 1 ve Şekil 2).

1. Çözelti hazırlama

  1. % 10 FBS ve% 1 penisilin-streptomisin içeren DMEM hücre kültürü ortamını hazırlayın (bkz.
  2. 100 μL DMSO çözeltisine 14,1165 mg 4-AP ekleyerek 1,5 M 4-AP çözeltisi hazırlayın (bkz. Hücre dışı çözeltiyi ekleyerek 1,5 M 4-AP'yi 1,5 mM'ye seyreltin (adım 1,5).
  3. 19.36 μL DMSO çözeltisine 5 mg AC ekleyerek 400 mM AC hazırlayın (bkz.
    NOT: Yukarıdaki tüm çözeltiler 4 °C'lik bir buzdolabında saklanmıştır ve DMSO'nun nihai konsantrasyonu %0,1'i (v/d) geçmemelidir.
  4. 50 mL çift damıtılmış suya 0,4100 g KCl (110,0 mM), 0,0120 g MgCl 2 (1,2 mM), 0,1270 g Na2 ATP (5,0 mM), 0,1190 g HEPES (10,0 mM) ve 0,1900 g EGTA (10,0 mM) ekleyerek 50 mL hücre içi çözelti hazırlayın (bakınız Tablo 1 ve Malzeme Tablosu).
    NOT: Hücre içi çözeltinin pH değeri, 1 M KOH kullanılarak 7.2'ye ayarlandı ve küçük hacimlere (1.5-2 mL) aliquoted edildi ve -20 ° C'de saklandı.
  5. 50 mL çift damıtılmış suya 0,0185 g KCl (5,0 mM), 0,3945 g NaCl (135,0 mM), 0,0203 g MgCl 2·6H2O (2,0 mM), 0,0595 g HEPES (5,0 mM) ve 0,0990 g D-glikoz (10,0 mM) ekleyerek 50 mL hücre dışı çözelti hazırlayın (bakınız Tablo 1 ve Malzeme Tablosu).
    NOT: Hücre dışı çözelti hemen kullanım için hazırlanmalı ve pH değeri 1 M NaOH kullanılarak 7,4'e ayarlanmalıdır.

2. Hücre kültürü

  1. H9c2 kültür kabı% 80 birleştiğinde, hücreleri 30 saniye boyunca% 0.25 tripsin ile sindirin.
  2. Normal ortam veya ilaç içeren ortama (25 μM, 50 μM, 100 μM ve 200 μM AC) sahip kültür 2 x 10 5 hücre/mL, 37 °C'de 24 saat boyunca cam plakalarla halı kaplı35 mm'lik bir tabakta, %5 CO2 atmosferi ve %70 ila %80 bağıl nem oranı ile (bkz.

3. Mikropipet imalatı

  1. Mikropipet çektirme makinesini açın ( bkz. Malzeme Tablosu) ve 30 dakika boyunca ön ısıtın.
  2. Mikropipet çektirme makinesine filamentli (OD: 1,5 mm, ID: 1,10 mm, 10 cm uzunlukta) bir borosilikat cam kılcal damar koyun. Adım 3.3'te ayarlanan programı seçin ve kontrol panelinde Enter tuşuna basın. Cam kılcal damarın "Isı" değerini belirlemek için sağ üst köşedeki Rampa programına tıklayın.
  3. "Rampa" testi ile belirlenen değere göre elektrodu çekme programını yazın ve aşağıdaki adımları kullanın: "Isı" değeri = "Rampa" değeri, Çekme = 0, Vel = çekme çubuğu hareket hızı, Zaman = 200-250. Pipetleri üretmeye başlamak için Çek'e tıklayın.
    NOT: Kullanmadan önce mikropipet çektiricinin kapalı kabındaki kurutuculara dikkat edin. Renk maviden pembeye değişirse, kurutucular değiştirilmelidir. Elektrot ucunun kirlenmesini önlemek için, pipet hazırlığı sırasında cam kılcal damarın orta kısmına dokunmamaya çalışın. Daha sonra, üretilen pipetleri dikkatlice çıkarın ve kapalı ve kapalı bir kaba koyun.

4. Cihaz kurulumu

  1. İlgili cihazları aşağıdaki sırayla açın: dijital-analog dönüştürücü, sinyal amplifikatör, mikromanipülatör, mikroskop ve kamera (bkz.
  2. Görüntüleme uygulamasını, sinyal amplifikatör yazılımını ve veri toplama yazılımını sırayla açın (bkz.
    NOT: Cihaz sırayla açılmalıdır; aksi takdirde, yazılımı açtıktan sonra "Demo Sayısallaştırıcı" durumu görünecektir.

5. IKv parametre ayarı

  1. Aşağıdaki adımları izleyerek IKv'yi kaydetme protokolünü düzenleyin.
    1. Düzenle'ye tıklayın ve veri toplama yazılımında Protokolü Düzenle'yi seçin (bkz.
    2. Programı "Dalga Formu" arayüzünde düzenleyin: Epoch A (İlk seviye = -60 mV, Delta seviyesi = 0 mV, İlk süre = 20 ms ve Delta süresi = 0 ms); B Dönemi (Birinci düzey = -40 mV, Delta düzeyi = 10 mV, İlk süre = 150 ms ve Delta süresi = 0 ms) ve Dönem C (Birinci düzey = -60 mV, Delta düzeyi = 0 mV, İlk süre = 30 ms ve Delta süresi = 0 ms).
    3. Ardından, Mod/Hız arayüzüne tıklayın ve "Deneme Hiyerarşisi" verilerini ayarlayın: Deneme gecikmesi = 0 s, Çalıştırma = 1, Süpürme = 11 ve Süpürme süresi = 0,22 s22,23.
      NOT: IKv kanal akımlarını, kontrol koşulları altında -60 mV'luk bir tutma potansiyelinde 10 mV'luk bir artışla -40 mV'den +60 mV'a kadar 150 ms depolarize edici adımlar uygulayarak elde edin. Protokolün toplam süresi, "Dalga Formu" programında ayarlanan süreden daha büyük olmalıdır.
  2. P / N Sızıntı Çıkarma programını düzenleyin: Uyaran düğmesini seçmek için Protokolü Düzenle'ye tıklayın ve P / N Sızıntı Çıkarma iletişim kutusunda sızıntı çıkarma programını ayarlayın: Alt Süpürme sayısı = 2-8 (bu çalışmada 4), Yerleşme süresi = 100-1.000 ms (bu çalışmada 200), "Polarite" = "Dalga formunun karşısında", tutma seviyesi = -80 mV.
    NOT: P/N Sızıntısı çıkarma işlemi, "İlk tutma"dan (-60 mV) daha düşük bir tutma seviyesine sahip olmalıdır.

6. I Kv'nin voltaj kelepçesi modunda tüm hücre yama kelepçesi kaydı

  1. Veri depolama yolunu oluşturun: Dosya'ya tıklayın ve veri toplama yazılımında Veri Dosyası Adlarını Ayarla'yı seçin. Veri toplama yazılımında Düzenle'yi seçipProtokolü Aç'a tıklayarak oluşturulan I Kv protokolünü (adım 5.1) açın. Son olarak, Araçlar seçeneğine tıklayın ve protokolü çalıştırmaya başlamak için Membran Testi'ni seçin.
  2. Hücre dışı çözeltiyi (adım 1.5) tüm hücre yama kelepçesi aparatı üzerindeki hücre banyosuna ekleyin (bkz. Malzeme Tablosu) ve kapak kaymasını banyodaki H9c2 hücreleri (adım 2.1'de kültürlenmiş) ile yukarı doğru yerleştirin.
  3. Pipetin %30'unu (3. adımda imal edilmiştir) hücre dışı çözelti ile doldurun ve patch-kelepçe aparatına entegre edilmiş kayıt elektrot tutucusuna takın. Pipetleri o-ring kauçuk conta ve plastik rondela sıkın. Ardından, pipeti mikromanipülatör ile banyoya bırakın. IKv akım taban çizgisini 0 pA'da tutmak için sinyal amplifikatör yazılımının Pipet ofset arayüzüne tıklayın (bkz.
    NOT: Hücre içi çözelti (adım 1.4) gümüş telin AgCl/Ag kısmı ile temas halinde olmalı ve gümüş tel pipetin iç duvarına yakın olmamalıdır. Pipetin direnci 2-6 MΩ olmalıdır. Pipet ucunun tıkanmasını önlemek için, plastik boru24 aracılığıyla kayıt elektrot tutucusuna bağlı 1,0 mL'lik bir şırınga kullanılarak pipete sürekli bir pozitif basınç verilmelidir.
  4. Kayıt elektrodu tutucusuna plastik bir tüp aracılığıyla bağlı 1,0 mL'lik bir şırınga ile manuel olarak uygun bir pozitif basınç verin. Mikromanipülatörü hücreyle temas edecek şekilde üç boyutlu olarak manipüle ederek pipeti hafifçe hareket ettirin.
  5. Pipet hücre zarına dokunduktan sonra membran testi kare dalgası 1/3 ila 1/2 oranında düştüğünde, pozitif basıncı çıkarın ve manuel olarak uygun bir negatif basınç verin. Ardından, GΩ mührünü oluşturmak için veri toplama yazılımının Patch arayüzüne tıklayın. Hızlı ve yavaş kapasitansı telafi etmek için hücre sızdırmazlığı sırasında "C p Hızlı" ve "Cp Yavaş" sinyal amplifikatörü yazılımını kullanın.
    NOT: Membran testi ≥1 GΩ olduğunda, pipet ucu ile hücre arasında hücreye bağlı bir konfigürasyon oluşturulur.
  6. Hücre zarının bir yamasını yırtmak için kısa negatif basınç darbeleri uygulayın.
    NOT: Membran direncindeki hızlı bir azalma, başarılı bir tüm hücre kayıt modelini karakterize eder. Erişim direnci (Ra) ≥30 MΩ ise, hücreler 6.3-6.6 adımları için yeniden seçilmelidir. Kaydedilen I Kv verilerinin doğruluğunu sağlamak için, hücre zarı kırıldıktan sonra negatif basınç çıkarılmalıdır.
  7. Sinyal amplifikatör yazılımının Tüm hücre düğmesine tıklayarak tüm hücre membran kapasitans kompanzasyonunu yürütün. Son olarak, Veri kaydı düğmesine tıklayarak verileri kaydedin ve kaydedin .
  8. Kaydedilen I Kv verilerini veri analiz yazılımı ile açın. Akım-gerilim (I−V) ilişkilerini kaydedin: Aşağıdakileri yapmak üzere İstatistikler'i seçmek için Analiz Et'e tıklayın: Veri analizi için Aralığı Kusorlar 1,2 olarak seçin; Tepe Genliği ve Ortalama düğmelerine tıklayın ve ardından Sonuçlar sayfasındaki verileri görüntülemek için Tamam'a tıklayın. Son olarak, daha fazla analiz için IKv ortalama veri sütununu fonksiyon çizim yazılımına kopyalayın (bkz.
  9. Temsilci IKv geçerli izlerini kaydedin: Transfer İzleri'ni seçmek için Düzenle'ye tıklayın; Ardından, aktarılacak Bölgedeki Tam izlemeyi seçin; Ardından, İzleme Seçiminde Seç'e tıklayın ve Sinyaller'de IN 0 (pA) öğesini seçin; Son olarak, "Sonuçlar" sayfasındaki verileri görüntülemek için Tamam'a tıklayın ve mevcut izleri çizmek için toplam verileri işlev çizim yazılımına kopyalayın.
  10. IKv protokolünü kaydedin: Uyaran Dalga Formu Sinyali Oluştur'u seçmek için Düzenle'ye tıklayın ve Tamam'ı seçin. Ardından, "Sinyaller" bölümünde A0 # 0 (mA) seçmek dışında adım 6.9'u yineleyin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol, IKv'nin tüm hücre yama-kelepçe tekniğinde ayarlanan parametrelere göre kaydedilmesine izin verdi. IKv, -60 mV'luk bir tutma potansiyelinde -40 ila +60 mV'luk bir depolarizan darbe uyaranı ile 150 ms depolarizan darbe uyaranı ile tetiklendi (Şekil 3A). H9c2 sıçan kardiyomiyositlerinin IKv'si ilk önce -20 mV civarında ortaya çıktı ve daha sonra genlik daha fazla depolarizasyon ile arttı. IKv ve membran potansiyeli arasındaki ortalama ilişki, ölçülen akım genliklerinden hesaplandı. Sonuçlar, kontrol grubuyla karşılaştırıldığında, I Kv genliğinin 1.5mM 4-AP ile 5 dakikalık tedaviden sonra gözlemlenebilir şekilde azaldığını göstermiştir (Şekil 3B). Ek olarak, IKv, membran potansiyellerinde 24 saatlik AC tedavisinden sonra doza bağımlı bir şekilde 10 mV'den 60 mV'ye önemli ölçüde azalmıştır (Şekil 3C-F).

Figure 1
Şekil 1: I Kv'yi kaydetmek için gerekli ekipman ve aletler. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: H 9c2 hücrelerinde I Kv'nin elektrofizyolojik kaydının akış şeması, tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılarak yapılmıştır. (A) Hücre kültürü. (B) Hücre içi ve hücre dışı çözeltilerin hazırlanması. (C) Tüm hücre kaydının şematik gösterimi. C1: Pipetin hücreye yakın bir yere yakın bir yere taşınması; C2: Pipet ve hücre arasında yüksek dirençli bir conta oluşturun; C3: Hücre zarını yırtın. (D) IKv. D1: K+ akım oluşumunun şematik diyagramı; D2: Tüm hücre voltaj kelepçesi modunda kaydedilen IKv için temsili akım izleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Resim 3: H 9c2 hücrelerinde Temsilci IKv. (A) H9c2 hücrelerinde herhangi bir işlem yapılmadan (kontrol grubu), 24 saat boyunca AC içeren ortamlarla (25 μM, 50 μM, 100 μM ve 200 μM) ve 5 dakika boyunca 1,5 mM 4-AP ile ölçülen IKv için temsili akım izleri. IKv, -60 mV'luk bir tutma potansiyelinde -40 ila +60 mV'luk bir 150 ms depolarizan darbe ile tetiklendi. (B) 1,5 mM 4-AP stimülasyonu için, IKv membran potansiyellerinde 10 mV'den 60 mV'a indi. (C-F) AC işlemi, membran potansiyellerinde konsantrasyona bağlı olarak IKv'yi 10 mV'den 60 mV'a düşürmüştür. *p < kontrol grubuna karşı 0.05 (n = 6). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Hücre dışı çözüm
Kimyasal g/50 mL Kompozisyon (mM)
Arjantin 0.3945 135.0
Kartal 0.1865 5.0
HEPES 0.5958 5.0
mgCl2·6H2O 0.2033 2.0
D-glikoz 0.9900 10.0
Hücre içi çözelti
Kimyasal g/50 mL Kompozisyon (mM)
Kartal 0.4100 110.0
MgCl2 0.0120 1.2
Na2-ATP 0.1270 5.0
HEPES 0.1190 10.0
cesaret 0.1900 10.0

Tablo 1: IKv'yi voltaj kelepçesi modunda kaydetmek için hücre içi ve hücre dışı çözümler.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Yama-kelepçe elektrofizyolojik tekniği esas olarak hücre zarı25 üzerindeki iyon kanallarının elektriksel aktivitesini ve fonksiyonel özelliklerini kaydetmek ve yansıtmak için kullanılır. Şu anda, yama kelepçe tekniğinin ana kayıt yöntemleri arasında tek kanallı kayıt ve tüm hücre kaydı26 bulunmaktadır. Tüm hücre modu için, cam mikroelektrot ve negatif basınç, hücre zarının küçük bir alanı ile pipet ucu27 arasında yüksek dirençli bir conta oluşturmak için kullanılır. Sürekli negatif basınç, pipetin ucunun hücre zarını yırtmasına neden olduğunda ve membran pipetin iç duvarına yapıştığında, pipet ile hücre arasında oluşan tam elektrik devresi, hücre zarı yüzeyindeki bireysel iyon kanallarının akım yoğunluğunun kaydedilmesini sağlar26,27 . Son yıllarda, tüm hücre yama-kelepçe tekniği, iyon kanalı ile ilgili hastalıkları hedef alan ilaç araştırmaları için yaygın olarak kullanılmaktadır. Operatörler için yüksek gereksinimlere sahip olmasına rağmen, bu teknik hala iyon kanalı araştırması için "altın standart" olmaya devam etmektedir28. Ek olarak, delikli yama-kelepçe tekniği, hücre zarında geçirgenlik gözenekleri oluşturmak için antibiyotik kullanarak uzun süreler boyunca nispeten stabil hücre içi ortamlarda hedef iyon kanallarındaki mevcut değişiklikleri de kaydedebilir29,30. Akım kelepçesi veya voltaj kelepçesi modunda tüm hücre yama-kelepçe tekniğini kullanarak iyon kanallarının voltajındaki veya akımındaki dinamik değişiklikleri kaydedebilir ve izleyebilir, bu da şüphesiz ilaçların farmakolojik aktivitesini veya toksisite mekanizmalarını değerlendirmek için güçlü bir platform haline getirir31,32.

AC, Aconitum türlerinin ana toksik bileşenlerinden biridir, diester-diterpenoid alkaloidler grubuna aittir ve oldukça toksiktir20,33. Kanıtlar AC'nin kardiyovasküler toksisiteye neden olabileceğini göstermiştir34,35. Seçici olmayan bir K+ kanal blokeri olarak, AC'nin geçici dışa doğru K + akımını, ultra hızlı gecikmeli doğrultucu K + akımını ve hızlı gecikmeli doğrultucu dışa doğru K + akımını bloke edebileceği ve aritmilere neden olabileceği bildirilmiştir21,36,37. Bugüne kadar, voltaja bağımlı potasyum akımlarının AC'nin kardiyotoksisitesine dahil olduğuna dair güçlü bir kanıt yoktur. Bu nedenle, bu çalışmada, sıçan H9c2 kardiyomiyositlerinde AC'nin IKv üzerindeki inhibitör etkisi, tüm hücre yama-kelepçe tekniği kullanılarak incelenmiştir. Na+ kanallarının aktivasyonu, AC'nin farmakolojik veya toksikolojik etkiler gösterdiği yaygın olarak bilinen bir mekanizmadır38. İlginç bir şekilde, AC'nin doğrudan IKv 21,36,37 üzerinde hareket edebileceğine dair kanıtlar vardır. Bununla birlikte, bu makalede sunulan veriler, AC'nin IKv'yi doğrudan inhibe edebileceğine dair yeterli kanıt sağlamamaktadır. AC'nin IKv inhibitör etkisi, daha fazla araştırma gerektiren Na + kanallarının doğrudan aktivasyonuna bağlı olabilir.

Başlangıcından ve gelişmesinden bu yana, bu çalışmada kullanılan tüm hücre yama-kelepçe tekniği, ilaçların iyon kanalları açısından kardiyotoksisitesini araştırmak için geleneksel bir yöntem haline gelmiştir. Bu deney, AC'nin H9c2 hücrelerinin IKv'sini voltaj kelepçesi modunda konsantrasyona bağlı bir şekilde etkili bir şekilde inhibe ettiğini doğruladı. Bununla birlikte, K + kanalları da dahil olmak üzere her iyon kanalı tipi birkaç alt tip içerir ve bu çalışmada sadece toplam voltaja bağımlı K + kanal akımı kaydedilmiştir. Sonraki çalışmalar, spesifik iyon kanalı alt tiplerinin yüksek ekspresyonuna sahip model hücre hatları aracılığıyla AC'nin farmakolojik ve toksikolojik mekanizmalarını araştırabilir37. Alternatif olarak, AC'nin miyokard toksisitesini görsel olarak araştırmak için floresan proteinlerle etiketlenmiş spesifik iyon kanalları dahil edilebilir39. Bu protokoldeki kritik adımlar 6.4-6.6 numaralı adımlardır; Bu üç adımın tamamlanması, IKv'nin sonraki kaydının başarılı olup olmadığını doğrudan belirler. Diğer teknolojilerle karşılaştırıldığında, tüm hücre yama-kelepçe tekniği, yüksek teknik gereksinimler ve düşük verimli kayıt40 özellikleri ile hücre zarındaki veya organel zarındaki tek iyon kanallarındaki akımı kaydetmek için altın standart ve kabul görmüş bir yöntemdir. Özetle, bu teknik sadece hücre elektrofizyolojisi araştırması için temel bir yöntem değil, aynı zamanda sinirbilim, kardiyovasküler bilim ve diğer alanlarda da yaygın olarak kullanılmaktadır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.

Acknowledgments

Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı'nın (82130113) ve Qinghai Eyaleti Bilim ve Teknoloji Departmanının Anahtar Ar-Ge ve Dönüşüm Programı'nın (2020-SF-C33) finansal desteğini takdir ediyoruz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4-Aminopyridine Sigma MKCJ2184
Aconitine Chengdu Lemetian Medical Technology Co., Ltd DSTDW000602
Amplifier Axon Instrument MultiClamp 700B
Analytical Balance Sartorius 124S-CW
ATP Na2 Solarbio 416O022
Borosilicate glass with filament (O.D.: 1.5 mm, I.D.: 1.10 mm, 10 cm length)  Sutter Instrument 163225-5
Cell culture dish (100 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 1192022
Cell culture dish (35 mm) Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd 3012022
Clampex software Molecular Devices, LLC. Version 10. 5
Clampfit software Molecular Devices, LLC. Version 10. 6. 0. 13 data acqusition software
D-(+)-glucose Rhawn RH289133
Digital camera Hamamatsu C11440
Digitizer Axon Instrument Axon digidata 1550B
DMSO Boster Biological Technology Co., Ltd PYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x) Gibco 8121587
EGTA Biofroxx EZ6789D115
Fetal bovine serum Gibco 2166090RP
Flaming/brown micropipette puller Sutter Instrument Model P-1000
H9c2 cells Hunan Fenghui Biotechnology Co., Ltd CL0111
HCImageLive Hamamatsu 4.5.0.0
HCl Sichuan Xilong Scientific Co., Ltd 2106081
HEPES Xiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd 20210221
KCl Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020082501
KOH Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2020112601
MgCl2 Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute 20160408
MgCl2·6H2O Chengdu Colon Chemical Co., Ltd 2021020101
Micromanipulator Sutter Instrument MP-285A
Microscope Olympus IX73
Microscope cover glass (20 × 20 mm) Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd 80340-0630
Milli-Q Chengdu Bioscience Technology Co., Ltd Milli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commander Axon Instrument MultiClamp commander 2.0 signal-amplifier software 
OriginPro 8 software OriginLab Corporation v8.0724(B724)
Penicillin-Streptomycin (100x) Boster Biological Technology Co., Ltd 17C18B16
PH meter  Mettler Toledo S201K
Phosphate buffered saline (1x) Gibco 8120485
Trypsin 0.25% (1x) HyClone J210045

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. Journal of Clinical Cardiology. 21 (4), 246-248 (2005).
  3. Varró, A., et al. Cardiac transmembrane ion channels and action potentials: Cellular physiology and arrhythmogenic behavior. Physiological Reviews. 101 (3), 1083-1176 (2021).
  4. Campuzano, O., et al. Negative autopsy and sudden cardiac death. International Journal of Legal Medicine. 128 (4), 599-606 (2014).
  5. Amin, A. S., Asghari-Roodsari, A., Tan, H. L. Cardiac sodium channelopathies. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 460 (2), 223-237 (2010).
  6. Benitah, J. P., et al. Voltage gated Ca2+ currents in the human pathophysiologic heart: A review. Basic Research in Cardiology. 97 (1), 111-118 (2002).
  7. Banyasz, T., Horvath, B., Jian, Z., Izu, L. T., Chen-Izu, Y. Sequential dissection of multiple ionic currents in single cardiac myocytes under action potential-clamp. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 50 (3), 578-581 (2011).
  8. Nerbonne, J. M. Molecular basis of functional myocardial potassium channel diversity. Cardiac Electrophysiology Clinics. 8 (2), 257-273 (2016).
  9. Grant, A. O. Cardiac ion channels. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 2 (2), 185-194 (2009).
  10. Olson, T. M., et al. Kv1.5 channelopathy due to KCNA5 loss-of-function mutation causes human atrial fibrillation. Human Molecular Genetics. 15 (14), 2185-2191 (2006).
  11. Christophersen, I. E., et al. Genetic variation in KCNA5: impact on the atrial-specific potassium current IKur in patients with lone atrial fibrillation. European Heart Journal. 34 (20), 1517-1525 (2013).
  12. Barry, D. M., Xu, H., Schuessler, R. B., Nerbonne, J. M. Functional knockout of the transient outward current, long-QT syndrome, and cardiac remodeling in mice expressing a dominant-negative Kv4 alpha subunit. Circulation Research. 83 (5), 560-567 (1998).
  13. Abbott, G. W., Xu, X., Roepke, T. K. Impact of ancillary subunits on ventricular repolarization. Journal of Electrocardiology. 40, 6 Suppl 42-46 (2007).
  14. Jia, W. J., et al. Recent studies on the application of patch-clamp technique in cellular electrophysiology. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities. 32 (4), 767-778 (2018).
  15. Leuthardt, E. C., et al. Using the electrocorticographic speech network to control a brain-computer interface in humans. Journal of Neural Engineering. 8 (3), 1-3 (2011).
  16. Tian, J. The applying progress of patch-clamp technique. Journal of Jilin Medical University. 4, 227-229 (2008).
  17. Wang, Z. Q., et al. Effects of shensong yangxin capsule on c-type Kv1.4 potassium channel. Chinese Heart Journal. 21 (6), 782-785 (2009).
  18. Huang, X. Y. The effect of resveratrol on Kv2.1 potassium channels in cardiac myocytes. Chinese Journal of Cardiac Pacing and Electrophysiology. 34 (5), 484-487 (2020).
  19. Wang, C., et al. Effects of neferine on Kv4.3 channels expressed in HEK293 cells and ex vivo electrophysiology of rabbit hearts. Acta Pharmacologica Sinica. 36 (12), 1451-1461 (2005).
  20. Gao, Y., et al. Aconitine: A review of its pharmacokinetics, pharmacology, toxicology and detoxification. Journal of Ethnopharmacology. 293, 115270 (2022).
  21. Zhou, W., et al. Cardiac efficacy and toxicity of aconitine: A new frontier for the ancient poison. Medicinal Research Reviews. 41 (3), 1798-1811 (2021).
  22. An, J. R., et al. The effects of tegaserod, a gastrokinetic agent, on voltage-gated K+ channels in rabbit coronary arterial smooth muscle cells. Clinical and Experimental Pharmacology & Physiology. 48 (5), 748-756 (2021).
  23. Sun, Q., Liu, F., Zhao, J., Wang, P., Sun, X. Cleavage of Kv2.1 by BACE1 decreases potassium current and reduces neuronal apoptosis. Neurochemistry International. 155, 105310 (2022).
  24. Manz, K. M., Siemann, J. K., McMahon, D. G., Grueter, B. A. Patch-clamp and multi-electrode array electrophysiological analysis in acute mouse brain slices. STAR Protocols. 2 (2), 100442 (2021).
  25. Kanda, H., Tonomura, S., Dai, Y., Gu, J. G. Protocol for pressure-clamped patch-clamp recording at the node of Ranvier of rat myelinated nerves. STAR Protocols. 2 (1), 100266 (2021).
  26. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  27. Yoshimura, M., et al. Application of in vivo patch-clamp technique to pharmacological analysis of synaptic transmission in the CNS. Nihon Yakurigaku Zasshi. Folia Pharmacologica Japonica. 124 (2), 111-118 (2004).
  28. Aziz, Q., Nobles, M., Tinker, A. Whole-cell and perforated patch-clamp recordings from acutely-isolated murine sinoatrial node cells. Bio-protocol. 10 (1), 3478 (2020).
  29. Witchel, H. J., Milnes, J. T., Mitcheson, J. S., Hancox, J. C. Troubleshooting problems with in vitro screening of drugs for QT interval prolongation using HERG K+ channels expressed in mammalian cell lines and Xenopus oocytes. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 48 (2), 65-80 (2002).
  30. Rodriguez-Menchaca, A. A., Ferrer, T., Navarro-Polanco, R. A., Sanchez-Chapula, J. A., Moreno-Galindo, E. G. Impact of the whole-cell patch-clamp configuration on the pharmacological assessment of the hERG channel: Trazodone as a case example. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 69 (3), 237-244 (2014).
  31. Yang, S., Liu, Z. W., Zhang, Y. X. The development of in vivo patch clamp technique. Chinese Remedies & Clinics. 5, 399-401 (2003).
  32. Lin, Y. F., Ouyang, S. Research progress and application of patch clamp technique. Strait Pharmaceutical Journal. 9, 8-11 (2008).
  33. Li, S., et al. An insight into current advances on pharmacology, pharmacokinetics, toxicity and detoxification of aconitine. Biomedicine & Pharmacotherapy. 151, 113115 (2022).
  34. Chan, T., Chan, J., Tomlinson, B., Critchley, J. Chinese herbal medicines revisited: A Hong Kong perspective. Lancet. 342 (8886-8887), 1532-1534 (1993).
  35. Jiang, H., Zhang, Y. T., Zhang, Y., Wang, X. B., Meng, X. L. An updated meta-analysis based on the preclinical evidence of mechanism of aconitine-induced cardiotoxicity. Frontiers in Pharmacology. 13, 900842 (2022).
  36. Liu, Y. Myocardial toxicity of aconite alkaloids. Shenyang Pharmaceutical University. , Shenyang, China. Master's thesis (2007).
  37. Li, Y., et al. Aconitine blocks HERG and Kv1.5 potassium channels. Journal of Ethnopharmacology. 131 (1), 187-195 (2010).
  38. Campbell, D. T. Modified kinetics and selectivity of sodium channels in frog skeletal muscle fibers treated with aconitine. The Journal of General Physiology. 80 (5), 713-731 (1982).
  39. Huang, X. Y., Ying, Y. C. The effect of specific protein 1 on Kv2.1 potassium channel in cardiac myocytes. Journal of Electrocardiology and Circulation. 39 (4), 338-341 (2020).
  40. Cao, J. B. Development and application of patch clamp technique. Journal of Yuncheng University. 27 (2), 53-55 (2009).

Tags

Tıp Sayı 189
Tüm Hücre Yama-Kelepçe Tekniği <em>ile</em> H9c2 Kardiyomiyositlerine Voltaja Bağlı Potasyum Akımı Kaydı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li,… More

Jiang, H., Zhang, Y., Hou, Y., Li, L., Zhang, S., Zhang, Y., Meng, X., Wang, X. Voltage-Dependent Potassium Current Recording on H9c2 Cardiomyocytes via the Whole-Cell Patch-Clamp Technique. J. Vis. Exp. (189), e64805, doi:10.3791/64805 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter