Methodenartikel

Prüfung der In-vitro- und In-vivo-Effizienz von mRNA-Lipid-Nanopartikeln, die durch mikrofluidisches Mischen formuliert wurden

DOI:

10.3791/64810

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20. Januar 2023

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1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Hier wird ein Protokoll zur Formulierung von Lipid-Nanopartikeln (LNPs) vorgestellt, die mRNA verkapseln, die für Glühwürmchen-Luziferase kodiert. Diese LNPs wurden in vitro in HepG2-Zellen und in vivo in C57BL/6-Mäusen auf ihre Wirksamkeit getestet.

Zusammenfassung

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Lipid-Nanopartikel (LNPs) haben in jüngster Zeit mit der erfolgreichen Entwicklung der COVID-19-mRNA-Impfstoffe von Moderna und Pfizer/BioNTech große Aufmerksamkeit erregt. Diese Impfstoffe haben die Wirksamkeit von mRNA-LNP-Therapeutika nachgewiesen und die Tür für zukünftige klinische Anwendungen geöffnet. In mRNA-LNP-Systemen dienen die LNPs als Verabreichungsplattformen, die die mRNA-Fracht vor dem Abbau durch Nukleasen schützen und ihre intrazelluläre Verabreichung vermitteln. Die LNPs bestehen in der Regel aus vier Komponenten: einem ionisierbaren Lipid, einem Phospholipid, Cholesterin und einem lipidverankerten Polyethylenglykol (PEG)-Konjugat (Lipid-PEG). Hier werden LNPs, die mRNA verkapseln, die für die Glühwürmchen-Luciferase kodieren, durch mikrofluidisches Mischen der organischen Phase, die LNP-Lipidkomponenten enthält, und der wässrigen Phase, die mRNA enthält, formuliert. Diese mRNA-LNPs werden dann in vitro getestet, um ihre Transfektionseffizienz in HepG2-Zellen mit einem biolumineszierenden plattenbasierten Assay zu bewerten. Zusätzlich werden mRNA-LNPs in vivo in C57BL /6-Mäusen nach intravenöser Injektion über die laterale Schwanzvene untersucht. Die Ganzkörper-Biolumineszenz-Bildgebung wird mit einem In-vivo-Bildgebungssystem durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse wurden für die mRNA-LNP-Eigenschaften, ihre Transfektionseffizienz in HepG2-Zellen und den gesamten lumineszenten Fluss in C57BL/6-Mäusen gezeigt.

Einleitung

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Lipid-Nanopartikel (LNPs) haben sich in den letzten Jahren im Bereich der nicht-viralen Gentherapie als vielversprechend erwiesen. Im Jahr 2018 hat die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) das allererste RNA-Interferenz-Therapeutikum (RNAi), Onpattro von Alnylam, zur Behandlung der hereditären Transthyretin-Amyloidosezugelassen 1,2,3,4. Dies war ein wichtiger Schritt vorwärts für Lipid-Nanopartikel und RNA-basierte Therapien. Kürzlich erhielten Moderna und Pfizer/BioNTech FDA-Zulassungen für ihre mRNA-LNP-Impfstoffe gegen SARS....

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Protokoll

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HINWEIS: Halten Sie bei der Formulierung von mRNA-LNPs immer RNase-freie Bedingungen aufrecht, indem Sie die Oberflächen und Geräte mit einem Oberflächendekontaminationsmittel für RNasen und DNA abwischen. Verwenden Sie nur RNase-freie Spitzen und Reagenzien.

Alle Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren an der University of Pennsylvania und einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Pennsylvania genehmigt wurde.

1. Vorbereitung der Vorformulierung

  1. Füll....

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Ergebnisse

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mRNA-LNPs wurden mit einem mikrofluidischen Instrument formuliert, das einen durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von 76,16 nm und einen Polydispersitätsindex von 0,098 besaß. Der pKa der mRNA-LNPs wurde durch Durchführung eines TNS-Assays18 auf 5,75 ermittelt. Die Verkapselungseffizienz für diese mRNA-LNPs wurde unter Verwendung des modifizierten Fluoreszenzassays und Gleichung 4.4 mit 92,3 % berechnet. Die Gesamt-RNA-Konzentration, die für die Zell.......

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Diskussion

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Mit diesem Arbeitsablauf kann eine Vielzahl von mRNA-LNPs formuliert und auf ihre In-vitro- und In-vivo-Effizienz getestet werden. Ionisierbare Lipide und Hilfsstoffe können ausgetauscht und mit unterschiedlichen molaren Verhältnissen und unterschiedlichen Gewichten von ionisierbaren Lipiden zu mRNA kombiniert werden, um mRNA-LNPs mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften herzustellen22. Hier formulierten wir C12-200 mRNA-LNPs mit einem molaren Verhältnis von 35.......

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Offenlegungen

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Es sind keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Danksagungen

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M.J.M. bedankt sich für die Unterstützung durch einen New Innovator Award (DP2 TR002776 des Direktors der US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH), einen Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), einen CAREER-Preis der US-amerikanischen National Science Foundation (CBET-2145491) und zusätzliche Mittel der National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 und NIDDK R01 DK123049).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,1 M SalzsäureSigma7647-01-0
0,22 μ m SpritzenfilterGenesee25-243
1 mL BD Slip Tip SpritzeBD309659
1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(Polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz) (C14-PEG2000)Avanti Polare Lipide880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE)Avanti Polare Lipide850725P
1,5 mL Eppendorf RöhrchenFisher Scientific05-408-129
15 mL Konische RöhrchenFisher Scientific14-959-70C
200 proof EthanolDecon Labs2716
23G NadelnFisher Scientific14-826-6C
3 mL BD Einwegspritzen mit Luer-LokSpitzen Fisher Scientific14-823-435
3 mL Dialyse KassettenThermo ScientificA52976
96 Well Black Wall Black BodenplatteFisher Scientific07-000-135
96 Well White/Clear Bodenplatte, TC SurfaceThermo Scientific165306
Ammoniumacetat, 1 KilogrammResearch Products International  631-61-8
Ammoniumcitrat dibasischSIgma3012-65-5
BD Luer-Lok Spritze steril, Einmalgebrauch, 5 mLBD309646
C12-200 Ionisierbares LipidCayman Chemical36699
C57BL/6 MäuseJackson Laboratory000664
CholesterinSigma57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU)TriLink BiotechnologiesL-7202
EinwegküvettenFisher Scientific14955129
D-Luciferin, KaliumsalzThermo ScientificL2916
DMEM, hoher GlukosegehaltThermofisher Scientific11965-084
Exel Insulinspritzen - 0,5 mLFisher Scientific1484132
Fötales RinderserumCorning35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HyPure Wasser in MolekularbiologiequalitätCytivaSH30538.03
Infinite 200 PRO Plate ReaderTecanN/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkin ElmerN/A
Large KimwipesFisher Scientific06-666-11D
Luciferase Assay KitPromegaE4550
NanoAssemblr Ignite Kartuschen - Classic - 100er PackPräzisions-NanosystemeNIN0065
NanoAssemblr Ignite InstrumentPräzisions-NanosystemeNIN0001
PBS - Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x) pH 7,4, RNase-freiThermo ScientificAM9624
Penicillin-StreptomycinThermofisher Scientific15140122
QB Citrat Puffer, (Citrat 100 mM) pH 3,0TeknovaQ2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay KitThermo ScientificR11490
Reporter Lyse 5x PufferPromegaE3971
RNase Away OberflächendekontaminationsmittelThermofisher Scientific7000TS1
NatriumchloridSigma7647-14-5
NatriumhydroxidSigma1310-73-2
NatriumphosphatSigma7601-54-9
TNS Reagenz (6-(p-Toluidino)-2-naphthalinsulfonsäure Natriumsalz)SigmaT9792
Triton X-100Sigma9036-19-5
ZetasizerMalvern PanalyticalNanoZS

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, Q., et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR-Cas gene editing. Nature Nanotechnology. 15 (4), 313-320 (2020).
  2. Wood, H. FDA approves patisiran ....

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Schlagwörter

mRNA DeliveryIn vitro TransfektionIn vivo ImagingHepG2 ZellenBiolumineszenz AssayVerkapselungseffizienzintraven se InjektionLuciferase Expression

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