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Methodenartikel

Prüfung der In-vitro- und In-vivo-Effizienz von mRNA-Lipid-Nanopartikeln, die durch mikrofluidisches Mischen formuliert wurden

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DOI:

10.3791/64810

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20. Januar 2023

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1Department of Bioengineering, University of Pennsylvania

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Hier wird ein Protokoll zur Formulierung von Lipid-Nanopartikeln (LNPs) vorgestellt, die mRNA verkapseln, die für Glühwürmchen-Luziferase kodiert. Diese LNPs wurden in vitro in HepG2-Zellen und in vivo in C57BL/6-Mäusen auf ihre Wirksamkeit getestet.

Zusammenfassung

Lipid-Nanopartikel (LNPs) haben in jüngster Zeit mit der erfolgreichen Entwicklung der COVID-19-mRNA-Impfstoffe von Moderna und Pfizer/BioNTech große Aufmerksamkeit erregt. Diese Impfstoffe haben die Wirksamkeit von mRNA-LNP-Therapeutika nachgewiesen und die Tür für zukünftige klinische Anwendungen geöffnet. In mRNA-LNP-Systemen dienen die LNPs als Verabreichungsplattformen, die die mRNA-Fracht vor dem Abbau durch Nukleasen schützen und ihre intrazelluläre Verabreichung vermitteln. Die LNPs bestehen in der Regel aus vier Komponenten: einem ionisierbaren Lipid, einem Phospholipid, Cholesterin und einem lipidverankerten Polyethylenglykol (PEG)-Konjugat (Lipid-PEG). Hier werden LNPs, die mRNA verkapseln, die für die Glühwürmchen-Luciferase kodieren, durch mikrofluidisches Mischen der organischen Phase, die LNP-Lipidkomponenten enthält, und der wässrigen Phase, die mRNA enthält, formuliert. Diese mRNA-LNPs werden dann in vitro getestet, um ihre Transfektionseffizienz in HepG2-Zellen mit einem biolumineszierenden plattenbasierten Assay zu bewerten. Zusätzlich werden mRNA-LNPs in vivo in C57BL /6-Mäusen nach intravenöser Injektion über die laterale Schwanzvene untersucht. Die Ganzkörper-Biolumineszenz-Bildgebung wird mit einem In-vivo-Bildgebungssystem durchgeführt. Repräsentative Ergebnisse wurden für die mRNA-LNP-Eigenschaften, ihre Transfektionseffizienz in HepG2-Zellen und den gesamten lumineszenten Fluss in C57BL/6-Mäusen gezeigt.

Einleitung

Lipid-Nanopartikel (LNPs) haben sich in den letzten Jahren im Bereich der nicht-viralen Gentherapie als vielversprechend erwiesen. Im Jahr 2018 hat die US-amerikanische Food and Drug Administration (FDA) das allererste RNA-Interferenz-Therapeutikum (RNAi), Onpattro von Alnylam, zur Behandlung der hereditären Transthyretin-Amyloidosezugelassen 1,2,3,4. Dies war ein wichtiger Schritt vorwärts für Lipid-Nanopartikel und RNA-basierte Therapien. Kürzlich erhielten Moderna und Pfizer/BioNTech FDA-Zulassungen für ihre mRNA-LNP-Impfstoffe gegen SARS-CoV-2 4,5. In jeder dieser LNP-basierten Nukleinsäuretherapien dient das LNP dazu, seine Fracht vor dem Abbau durch Nukleasen zu schützen und eine starke intrazelluläre Verabreichung zu erleichtern 6,7. Während LNPs in RNAi-Therapien und Impfstoffanwendungen erfolgreich sind, wurden mRNA-LNPs auch für den Einsatz in Proteinersatztherapien8 sowie für die gleichzeitige Verabreichung von Cas9-mRNA und Leit-RNA für die Verabreichung des CRISPR-Cas9-Systems für dieGeneditierung 9 untersucht. Es gibt jedoch nicht die eine spezifische Formulierung, die für alle Anwendungen gut geeignet ist, und subtile Änderungen der LNP-Formulierungsparameter können die Wirksamkeit und Bioverteilung in vivo stark beeinflussen 8,10,11. Daher müssen individuelle mRNA-LNPs entwickelt und evaluiert werden, um die optimale Formulierung für jede LNP-basierte Therapie zu bestimmen.

LNPs werden üblicherweise mit vier Lipidkomponenten formuliert: einem ionisierbaren Lipid, einem Phospholipid, Cholesterin und einem lipidverankerten Polyethylenglykol (PEG)-Konjugat (Lipid-PEG)11,12,13. Die potente intrazelluläre Verabreichung, die durch LNPs ermöglicht wird, beruht zum Teil auf der ionisierbaren Lipidkomponente12. Diese Komponente ist bei physiologischem pH-Wert neutral, wird aber im sauren Milieu des Endosoms11 positiv geladen. Es wird angenommen, dass diese Änderung der Ionenladung einen wichtigen Beitrag zur endosomalen Flucht leistet12,14,15. Zusätzlich zum ionisierbaren Lipid verbessert die Phospholipidkomponente (Helferlipid) die Verkapselung der Fracht und hilft bei der endosomalen Flucht, das Cholesterin bietet Stabilität und verbessert die Membranfusion, und das Lipid-PEG minimiert die LNP-Aggregation und Opsonisierung im Kreislauf10,11,14,16. Um das LNP zu formulieren, werden diese Lipidkomponenten in einer organischen Phase, typischerweise Ethanol, kombiniert und mit einer wässrigen Phase vermischt, die die Nukleinsäurefracht enthält. Das LNP-Formulierungsverfahren ist sehr vielseitig, da es ermöglicht, verschiedene Komponenten leicht zu substituieren und mit unterschiedlichen Molverhältnissen zu kombinieren, um viele LNP-Formulierungen mit einer Vielzahl von physikalisch-chemischen Eigenschaften zu formulieren10,17. Bei der Erforschung dieser großen Vielfalt von LNPs ist es jedoch entscheidend, dass jede Formulierung mit einem standardisierten Verfahren bewertet wird, um die Unterschiede in der Charakterisierung und Leistung genau zu messen.

Hier wird der komplette Workflow für die Formulierung von mRNA-LNPs und die Bewertung ihrer Leistung in Zellen und Tieren skizziert.

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Protokoll

HINWEIS: Halten Sie bei der Formulierung von mRNA-LNPs immer RNase-freie Bedingungen aufrecht, indem Sie die Oberflächen und Geräte mit einem Oberflächendekontaminationsmittel für RNasen und DNA abwischen. Verwenden Sie nur RNase-freie Spitzen und Reagenzien.

Alle Tierbehandlungen wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Labortieren an der University of Pennsylvania und einem Protokoll durchgeführt, das vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Pennsylvania genehmigt wurde.

1. Vorbereitung der Vorformulierung

  1. Füllen Sie ein sauberes 4-Liter-Becherglas mit 200-300 ml frischer 10x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
    1. Verdünnen Sie das 10-fache PBS im Becherglas 10-fach mit Reinstwasser, um ein Becherglas mit 1x PBS zu erhalten. Achten Sie darauf, dass das Endvolumen des 1x PBS zwischen 2-3 L liegt.
    2. Dialysekassetten (20 kDa Molekulargewichts-Cutoff [MWCO]) mit der für die LNP-Formulierung geeigneten Kapazität in das gefüllte Becherglas geben, um sie zu hydratisieren.
      HINWEIS: Dialysekassetten benötigen mindestens 2 Minuten, um vor dem Gebrauch zu hydratisieren.
    3. Legen Sie einen Rührstab in das Becherglas und decken Sie das Becherglas mit Aluminiumfolie ab.
    4. Stellen Sie das abgedeckte Becherglas auf eine magnetische Rührplatte. Schalten Sie die Rührplatte ein und stellen Sie sie auf 300-400 Umdrehungen pro Minute ein.
  2. Verdünnen Sie einen 100 mM Zitronensäure-Pufferstock (pH 3) 10-fach mit Reinstwasser, um den 10 mM Zitronensäurepuffer zu erzeugen, der für die mRNA-Verdünnung verwendet wird.
  3. Stellen Sie ionisierbare C12-200-Lipid-, Hilfslipid-, Cholesterin- und lipidverankerte PEG-Stammlösungen her, indem Sie jedes Lipid in 100%igem Ethanol auflösen. Die Konzentrationen der Lipidkomponenten sind in Tabelle 1 aufgeführt.
    1. Die Stammlösungen werden bei 37 °C erhitzt und gemischt, um sicherzustellen, dass sie vollständig aufgelöst sind.

2. Herstellung der Lipid- und Nukleinsäuremischungen

  1. Berechnen Sie die erforderlichen Volumina von ionisierbarem Lipid, Helferlipid, Cholesterin und Lipid-PEG basierend auf dem gewünschten molaren Verhältnis und dem Verhältnis von ionisierbarem Lipid zu mRNA-Gewicht (Tabelle 1). Bereiten Sie 10 % zusätzliches Volumen der organischen Phase vor, um das Totvolumen in den Spritzen während der Formulierung zu berücksichtigen.
    1. Kombinieren Sie die berechneten Volumina der verschiedenen Lipidkomponenten in einem konischen Röhrchen.
    2. Verdünnen Sie die Lipide mit 100 % Ethanol auf ein Endvolumen V, das 25 % des Endvolumens von LNP ausmacht.
  2. Berechnen Sie die Menge an mRNA, die für die Formulierung erforderlich ist, basierend auf dem Verhältnis von ionisierbarem Lipid zu mRNA-Gewicht und dem Gesamtvolumen des benötigten mRNA-LNP (Tabelle 1).
    1. Tauen Sie die Glühwürmchen-Luciferase-kodierende mRNA auf Eis auf.
    2. Die mRNA wird in 10 mM Zitronensäurepuffer auf ein Endvolumen von 3V, das Dreifache des Volumens der organischen Phase, verdünnt.
      HINWEIS: Jedes Lipidvolumen, V, muss genügend ionisierbares Lipid für die in 3V verdünnte mRNA enthalten. Dies entspricht dem gewünschten Verhältnis von ionisierbarem Lipid zu mRNA-Gewicht.

3. Mikrofluidische Formulierung von mRNA-LNPs

  1. Besprühen Sie ein empfindliches Tuch mit einem Oberflächendekontaminationsmittel für RNasen und DNA und wischen Sie das Innere des mikrofluidischen Instruments gründlich ab.
    1. Öffnen Sie eine neue mikrofluidische Kartusche und setzen Sie sie mit den Einlasskanälen nach unten und weg ein.
    2. Stellen Sie sicher, dass der konische Röhrchenarm zwei konische 15-ml-Röhrchen hält und sich in der Position befindet, die am weitesten rechts liegt.
    3. Konfigurieren Sie zwei sterile konische 15-ml-Röhrchen auf dem Halter mit abgenommenen Kappen.
  2. Füllen Sie eine 5-ml-Spritze mit der mRNA-Lösung, die mRNA enthält, die in 10 mM Zitronensäurepuffer verdünnt ist.
    1. Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit der Lipidlösung, die die Lipide enthält, die in reinem 100%igem Ethanol verdünnt sind.
    2. Klappen Sie den Kartuschenhalter am Mikrofluidik-Gerät hoch.
    3. Führen Sie die 5-ml-Spritze ohne die Nadel, die mRNA enthält, in den linken Einlass der Kartusche ein.
    4. Führen Sie die 3-ml-Spritze ohne die Nadel, die Lipide enthält, in den rechten Einlass der Kartusche ein.
    5. Klappen Sie den Kartuschenhalter wieder nach unten und schließen Sie den Deckel des mikrofluidischen Instruments.
  3. Schalten Sie das Mikrofluidik-Gerät mit dem Schalter auf der Rückseite des Geräts ein.
    1. Wählen Sie Schnellausführung aus.
    2. Wählen Sie die richtigen Spritzentypen für die eingesetzten 5-ml- und 3-ml-Spritzen aus.
    3. Geben Sie die Parameter für die mRNA-LNP-Formulierung mit einem wässrigen zu organischen Flussratenverhältnis von 3:1 ein, wie in Tabelle 2 beschrieben.
    4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Weiter , um zum nächsten Bildschirm zu gelangen.
    5. Vergewissern Sie sich, dass die richtigen Parameter eingegeben wurden.
    6. Drücken Sie die Start-Taste , um die mRNA-LNPs zu formulieren.

4. Post-Formulation-Prozessierung und Charakterisierung der mRNA-LNPs

  1. Laden Sie die mRNA-LNPs, die im rechten konischen Röhrchen gesammelt wurden, in die zuvor hydratisierten Dialysekassetten.
    HINWEIS: Die Membran der Kassette darf beim Laden der mRNA-LNPs nicht durchstochen oder beschädigt werden. Wenn die Membran beschädigt ist, gehen mRNA-LNPs bei der Belastung verloren.
    1. Die Dialysekassetten mit den mRNA-LNPs wieder in das Becherglas mit 1x PBS geben und mindestens 2 h dialysieren lassen.
    2. Nach der Dialyse werden die Dialysekassetten mit den mRNA-LNPs in eine sterile Biosicherheitswerkbank gebracht und die mRNA-LNPs mit einer Spritze mit einer Nadel entfernt.
    3. Sterilfiltrieren Sie die mRNA-LNPs mit einem 0,22-μm-Spritzenvorsatzfilter und sammeln Sie sie in einem sterilen konischen Röhrchen.
    4. Geben Sie 65 μl der mRNA-LNP-Lösung zur Charakterisierung in ein 1,5-ml-Mikroröhrchen.
  2. Verdünnen Sie 10 μl mRNA-LNPs 1:100 in 990 μl 1x PBS in einer Küvette zur Messung der hydrodynamischen Größe und des Polydispersitätsindex mittels dynamischer Lichtstreuung.
  3. Beurteilen Sie die Konzentration und Verkapselungseffizienz der mRNA-LNPs mit einem Fluoreszenzassay (z. B. RiboGreen).
    1. Bereiten Sie eine Stammlösung von 1x TE-Puffer vor, indem Sie 20x TE-Puffer mit molekularbiologischem Wasser verdünnen.
    2. Bereiten Sie eine Stammlösung aus 1%igem Triton X-100-Puffer vor, indem Sie Triton X-100 mit 1x TE-Puffer verdünnen.
    3. Bereiten Sie das fluoreszierende Reagenz vor, indem Sie das Reagenzmaterial 1:200 mit 1x TE-Puffer verdünnen.
    4. Verdünnen Sie die mRNA-LNPs 1:100 in 1x TE-Puffer und 1 % Triton X-100-Puffer in einer 96-Well-Platte mit schwarzer Wand und schwarzem Boden in 100 μl.
    5. Bereiten Sie eine Standardkurve für den unteren Bereich vor, indem Sie den RNA-Standard gemäß den Anweisungen des Herstellers verdünnen, und legen Sie die Standardkurve in die 96-Well-Platte.
    6. Geben Sie 100 μl verdünntes fluoreszierendes Reagenz in jede Vertiefung, die verdünntes mRNA-LNP oder verdünnten Standard enthält.
    7. Legen Sie die 96-Well-Platte in ein Plattenlesegerät und schütteln Sie sie 1 Minute lang, gefolgt von einer Wartezeit von 4 Minuten.
    8. Messen Sie die Fluoreszenzintensität jedes Wells gemäß dem Protokoll des Herstellers bei einer Anregung/Emission von 480 nm/520 nm.
  4. Verwenden Sie die Standardkurve, um die Fluoreszenzwerte in Konzentrationen umzurechnen.
    1. Berechnen Sie die Verkapselungseffizienz, indem Sie den Wert, der durch die Verdünnung von LNPs in TE-Puffer (nicht verkapselte mRNA) erhalten wird, von dem Wert subtrahieren, der durch die Verdünnung von LNPs in 1 % Triton X-100 (Gesamt-mRNA) erhalten wird, und durch den Wert dividieren, der durch die Verdünnung von LNPs in 1 % Triton X-100 gemäß Gleichung 4.4 erhalten wird.
    2. Berechnen Sie die mRNA-LNP-Konzentration, die für Zell- und Tierstudien verwendet wird, indem Sie den Wert, der durch die Verdünnung von LNPs im TE-Puffer (nicht verkapselte mRNA) erhalten wird, von dem Wert subtrahieren, der durch die Verdünnung von LNPs in 1 % Triton X-100 (Gesamt-mRNA) erhalten wird.
  5. Messen Sie den pKa der mRNA-LNPs durch einen 6-(p-Toluidino)-2-Naphthalinsulfonylchlorid (TNS)-Assay.
    1. Bereiten Sie das TNS-Reagenz vor, indem Sie eine 0,16 mM TNS-Lösung in Reinstwasser herstellen.
      HINWEIS: Wenn Sie das Reagenz verwenden, achten Sie darauf, es auf Eis und vor Licht geschützt aufzubewahren, um eine Verschlechterung zu vermeiden.
    2. Es werden gepufferte Lösungen von 150 mM Natriumchlorid, 20 mM Natriumphosphat, 25 mM Ammoniumcitrat und 20 mM Ammoniumacetat hergestellt, die auf verschiedene pH-Werte von 2 bis 12 in Schritten von 0,5 eingestellt sind.
    3. Geben Sie 2,5 μl LNP zu jeder pH-angepassten Pufferlösung in eine 96-Well-Platte mit schwarzer Wand, schwarzem Boden.
    4. Geben Sie das TNS-Reagenz in jede Vertiefung, so dass die endgültige TNS-Konzentration 6 μM beträgt.
    5. Inkubieren Sie die 96-Well-Platte 5 Minuten lang an einem dunklen Ort.
    6. Messen Sie die Fluoreszenz bei einer Anregung/Emission von 322 nm/431 nm mit einem Fluoreszenzplatten-Reader.
    7. Passen Sie die Daten an eine sigmoidale Kurve an und berechnen Sie pKa , indem Sie die angepasste Gleichung verwenden, um den pH-Wert zu ermitteln, bei dem 50 % der maximalen Intensität beobachtet wurden.
  6. Repräsentative Ergebnisse für die hydrodynamische mRNA-LNP-Größe, PDI, Verkapselungseffizienz und pKa sind in Tabelle 3 dargestellt.

5. In-vitro-Transfektion von HepG2-Zellen

HINWEIS: Verschiedene andere Zelllinien, wie z. B. HeLa-Zellen oder HEK-293T-Zellen, können zur Beurteilung der Transfektionseffizienz von LNPs in vitro verwendet werden. Alle Zellen sollten vor den LNP-Transfektionsstudien negativ auf Mykoplasmen getestet werden.

  1. Platte mit 5.000 HepG2-Zellen in jeder Vertiefung einer weißwandigen 96-Well-Platte mit klarem Boden in 100 μl vollständigem Zellkulturmedium (DMEM ergänzt mit 10 % fötalem Kälberserum und 1 % Penicillin-Streptomycin)
    1. Lassen Sie die Zellen über Nacht in einem kontrollierten CO 2- Inkubator bei 37 °C und 5 % CO2 anhaften.
  2. Verdünnen Sie die mRNA-LNPs in vollständigem Zellkulturmedium, so dass die Gesamtdosis in 100 μl abgegeben wird.
    1. Entnehmen Sie das komplette Medium aus den Vertiefungen.
    2. Behandeln Sie die Zellen entweder mit mRNA-LNPs, die in vollständigem Zellkulturmedium in den gewünschten Dosen verdünnt sind, oder mit vollständigem Medium (Kontrolle).
    3. Legen Sie die 96-Well-Platte mit den behandelten Zellen für 24 Stunden zurück in den kontrollierten CO2 - Inkubator.
  3. Beurteilen Sie die Transfektionseffizienz, indem Sie einen Luciferase-Assay durchführen.
    1. Bereiten Sie das Luciferase-Reagenz und 1x Zelllysepuffer gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.
    2. Nehmen Sie die 96-Well-Platte mit den Zellen aus dem Inkubator und bringen Sie sie in eine Biosicherheitswerkbank.
    3. Entfernen Sie das Zellkulturmedium aus jeder Vertiefung der 96-Well-Platte.
    4. Geben Sie 20 μl 1x Lysepuffer in jede Vertiefung, gefolgt von 100 μl des zuvor hergestellten Luciferase-Assay-Reagenz.
    5. Schützen Sie die Platte vor Licht und legen Sie die Platte in ein Plattenlesegerät, um das biolumineszierende Signal jeder Vertiefung zu messen.
      HINWEIS: Repräsentative Ergebnisse, die die Behandlung von HepG2-Zellen mit zuvor formulierten C12-200 mRNA-LNPs zeigen, sind in Abbildung 1 dargestellt.

6. In-vivo-Evaluierung von mRNA-LNPs in Mäusen nach Schwanzveneninjektion

  1. Verdünnen Sie die mRNA-LNP-Lösung mit sterilem 1x PBS, so dass 2 μg Gesamt-mRNA in einem 100-μl-Schwanzvenen-Injektionsvolumen vorhanden sind, was einer Körpergewichtsdosis von etwa 0,1 mg/kg für eine 20-g-Maus entspricht.
  2. Halten Sie jede Maus mit einer zugelassenen Methode zurück und wischen Sie den Schwanz mit einem Pad ab, das mit 70%igem Alkohol angefeuchtet ist.
    1. Füllen Sie eine 29-g-Insulinspritze entweder mit 100 μl mRNA-LNP (2 μg) oder 100 μl 1x PBS. Entfernen Sie alle Blasen aus der Spritze.
    2. Führen Sie die Nadel mit der Fase nach oben in die seitliche Schwanzvene der Maus ein und injizieren Sie langsam die 100 μl mRNA-LNP oder 1x PBS.
    3. Entfernen Sie die Nadel und üben Sie Druck aus, bis die Hämostase erreicht ist.
  3. Bereiten Sie 6 Stunden nach der Injektion eine Stammlösung von 15 mg/ml d-Luciferin-Kaliumsalz in sterilem 1x PBS vor.
    1. Schalten Sie das In-vivo-Bildgebungssystem (IVIS) ein und öffnen Sie die Bildgebungssoftware.
    2. Drücken Sie auf Initialisieren , um das Gerät für die Datenerfassung vorzubereiten.
    3. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen neben Lumineszenz und stellen Sie die Belichtungszeit auf Auto ein. Stellen Sie sicher, dass das richtige Sichtfeld für die Anzahl der Mäuse ausgewählt ist, die abgebildet werden.
    4. Den zuvor behandelten Mäusen werden 200 μl d-Luciferin intraperitoneal (150 mg Luciferin pro kg Körpergewicht) verabreicht.
    5. Legen Sie die Mäuse in eine Anästhesiekammer, die auf 2,5 % Isofluran und eine Sauerstoffflussrate von 2,0 l/min eingestellt ist.
    6. Warten Sie 10 Minuten, bis sich das Luciferase-Signal stabilisiert hat, bevor Sie die mit mRNA-LNP behandelten Mäuse abbilden.
    7. Stellen Sie sicher, dass die Mäuse vollständig betäubt sind, und leiten Sie die Anästhesieleitung um, um Isofluran über Nasenkegel in der Bildgebungskammer zu verabreichen.
    8. Setzen Sie die Mäuse auf die Nasenkegel und stellen Sie sicher, dass sie auf dem Rücken liegen und ihr Hinterleib freiliegt.
    9. Schließen Sie die Kammertür und klicken Sie in der Software auf die Schaltfläche Erfassen , um Biolumineszenzbilder zu erhalten.
      HINWEIS: Repräsentative Ergebnisse für die Ganzkörperbildgebung von Mäusen nach mRNA-LNP- oder 1X-PBS-Behandlung sind in Abbildung 2 dargestellt.

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Ergebnisse

mRNA-LNPs wurden mit einem mikrofluidischen Instrument formuliert, das einen durchschnittlichen hydrodynamischen Durchmesser von 76,16 nm und einen Polydispersitätsindex von 0,098 besaß. Der pKa der mRNA-LNPs wurde durch Durchführung eines TNS-Assays18 auf 5,75 ermittelt. Die Verkapselungseffizienz für diese mRNA-LNPs wurde unter Verwendung des modifizierten Fluoreszenzassays und Gleichung 4.4 mit 92,3 % berechnet. Die Gesamt-RNA-Konzentration, die für die Zell...

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Diskussion

Mit diesem Arbeitsablauf kann eine Vielzahl von mRNA-LNPs formuliert und auf ihre In-vitro- und In-vivo-Effizienz getestet werden. Ionisierbare Lipide und Hilfsstoffe können ausgetauscht und mit unterschiedlichen molaren Verhältnissen und unterschiedlichen Gewichten von ionisierbaren Lipiden zu mRNA kombiniert werden, um mRNA-LNPs mit unterschiedlichen physikalisch-chemischen Eigenschaften herzustellen22. Hier formulierten wir C12-200 mRNA-LNPs mit einem molaren Verhältnis von 35...

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Offenlegungen

Es sind keine Interessenkonflikte zu deklarieren.

Danksagungen

M.J.M. bedankt sich für die Unterstützung durch einen New Innovator Award (DP2 TR002776 des Direktors der US-amerikanischen National Institutes of Health (NIH), einen Burroughs Wellcome Fund Career Award at the Scientific Interface (CASI), einen CAREER-Preis der US-amerikanischen National Science Foundation (CBET-2145491) und zusätzliche Mittel der National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 und NIDDK R01 DK123049).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,1 M SalzsäureSigma7647-01-0
0,22 μ m SpritzenfilterGenesee25-243
1 mL BD Slip Tip SpritzeBD309659
1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(Polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz) (C14-PEG2000)Avanti Polare Lipide880150P
1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin (DOPE)Avanti Polare Lipide850725P
1,5 mL Eppendorf RöhrchenFisher Scientific05-408-129
15 mL Konische RöhrchenFisher Scientific14-959-70C
200 proof EthanolDecon Labs2716
23G NadelnFisher Scientific14-826-6C
3 mL BD Einwegspritzen mit Luer-LokSpitzen Fisher Scientific14-823-435
3 mL Dialyse KassettenThermo ScientificA52976
96 Well Black Wall Black BodenplatteFisher Scientific07-000-135
96 Well White/Clear Bodenplatte, TC SurfaceThermo Scientific165306
Ammoniumacetat, 1 KilogrammResearch Products International  631-61-8
Ammoniumcitrat dibasischSIgma3012-65-5
BD Luer-Lok Spritze steril, Einmalgebrauch, 5 mLBD309646
C12-200 Ionisierbares LipidCayman Chemical36699
C57BL/6 MäuseJackson Laboratory000664
CholesterinSigma57-88-5
CleanCap FLuc mRNA (5moU)TriLink BiotechnologiesL-7202
EinwegküvettenFisher Scientific14955129
D-Luciferin, KaliumsalzThermo ScientificL2916
DMEM, hoher GlukosegehaltThermofisher Scientific11965-084
Exel Insulinspritzen - 0,5 mLFisher Scientific1484132
Fötales RinderserumCorning35-010-CV
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HyPure Wasser in MolekularbiologiequalitätCytivaSH30538.03
Infinite 200 PRO Plate ReaderTecanN/A
IVIS Spectrum In Vivo Imaging SystemPerkin ElmerN/A
Large KimwipesFisher Scientific06-666-11D
Luciferase Assay KitPromegaE4550
NanoAssemblr Ignite Kartuschen - Classic - 100er PackPräzisions-NanosystemeNIN0065
NanoAssemblr Ignite InstrumentPräzisions-NanosystemeNIN0001
PBS - Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x) pH 7,4, RNase-freiThermo ScientificAM9624
Penicillin-StreptomycinThermofisher Scientific15140122
QB Citrat Puffer, (Citrat 100 mM) pH 3,0TeknovaQ2442
Quant-it RiboGreen RNA Assay KitThermo ScientificR11490
Reporter Lyse 5x PufferPromegaE3971
RNase Away OberflächendekontaminationsmittelThermofisher Scientific7000TS1
NatriumchloridSigma7647-14-5
NatriumhydroxidSigma1310-73-2
NatriumphosphatSigma7601-54-9
TNS Reagenz (6-(p-Toluidino)-2-naphthalinsulfonsäure Natriumsalz)SigmaT9792
Triton X-100Sigma9036-19-5
ZetasizerMalvern PanalyticalNanoZS

Referenzen

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