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एक पाल्मिटिक एसिड-प्रेरित इन विट्रो मॉडल में गैर-अल्कोहल फैटी लीवर रोग पर प्लाटिकोडिन डी के सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच

Published: December 2, 2022 doi: 10.3791/64816
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1, 1, 1,2, 2
1Chongqing Academy of Chinese Materia Medica, 2Bioengineering College of Chongqing University
* These authors contributed equally

Summary

यह प्रोटोकॉल एक पामिटिक एसिड-प्रेरित इन विट्रो मॉडल में गैर-मादक फैटी यकृत रोग पर प्लैटिकोडिन डी के सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच करता है।

Abstract

गैर-अल्कोहल फैटी लीवर रोग (एनएएफएलडी) की घटना दुनिया भर में खतरनाक दर से बढ़ रही है। प्लाटीकोडन ग्रैंडिफ्लोरम का व्यापक रूप से विभिन्न बीमारियों के उपचार के लिए एक पारंपरिक नृवंशविज्ञान के रूप में उपयोग किया जाता है और यह एक विशिष्ट कार्यात्मक भोजन है जिसे रोजमर्रा के आहार में शामिल किया जा सकता है। अध्ययनों ने सुझाव दिया है कि प्लाटीकोडन ग्रैंडिफ्लोरम में मुख्य सक्रिय अवयवों में से एक प्लैटिकोडिन डी (पीडी) में उच्च जैव उपलब्धता है और एनएएफएलडी की प्रगति को काफी कम करता है, लेकिन इसका अंतर्निहित तंत्र अभी भी स्पष्ट नहीं है। इस अध्ययन का उद्देश्य विट्रो में एनएएफएलडी के खिलाफ पीडी के चिकित्सीय प्रभाव की जांच करना है। एएमएल -12 कोशिकाओं को विट्रो में एनएएफएलडी मॉडल करने के लिए 24 घंटे के लिए 300 एसएम पामिटिक एसिड (पीए) के साथ इलाज किया गया था। फिर, कोशिकाओं को या तो पीडी के साथ इलाज किया गया था या 24 घंटे के लिए कोई पीडी उपचार नहीं मिला था। प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के स्तर का विश्लेषण 2',7'-डाइक्लोरो-डाइहाइड्रो-फ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए) धुंधला करके किया गया था, और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता जेसी -1 धुंधला विधि द्वारा निर्धारित की गई थी। इसके अलावा, सेल लाइसेट में एलसी 3-II / एलसी 3-आई और पी 62 / एसक्यूएसटीएम 1 के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर का विश्लेषण पश्चिमी सोख्ता द्वारा किया गया था। पीडी को नियंत्रण समूह की तुलना में पीए-उपचारित समूह में आरओएस और माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली संभावित स्तर को काफी कम करने के लिए पाया गया था। इस बीच, पीडी ने एलसी 3-II / एलसी 3-आई स्तरों में वृद्धि की और नियंत्रण समूह की तुलना में पीए-उपचारित समूह में पी 62 / एसक्यूएसटीएम 1 स्तरों को कम कर दिया। परिणामों ने संकेत दिया कि पीडी ने ऑक्सीडेटिव तनाव को कम करके और ऑटोफैगी को उत्तेजित करके विट्रो में एनएएफएलडी को सुधार दिया। यह इन विट्रो मॉडल एनएएफएलडी में पीडी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।

Introduction

प्लैटिकोडोन ग्रैंडिफ्लोरस (पीजी), जो प्लैटिकोडोन ग्रैंडिफ्लोरस (जैक) की सूखी जड़ है। A.DC., पारंपरिक चीनी चिकित्सा (TCM) में प्रयोग किया जाता है। यह मुख्य रूप से चीन के पूर्वोत्तर, उत्तर, पूर्व, मध्य और दक्षिण-पश्चिम क्षेत्रों में उत्पादितहोता है। पीजी घटकों में ट्राइटरपेनोइड सैपोनिन, पॉलीसेकेराइड, फ्लेवोनोइड्स, पॉलीफेनोल्स, पॉलीइथाइलीन ग्लाइकोल्स, वाष्पशील तेल और खनिजशामिल हैं। पीजी का एशिया में भोजन और हर्बल दवा के रूप में उपयोग किए जाने का एक लंबा इतिहास है। परंपरागत रूप से, इस जड़ी बूटी का उपयोग फेफड़ों के रोगों के खिलाफ दवा बनाने के लिए किया जाता था। आधुनिक फार्माकोलॉजी अन्य बीमारियों के इलाज के लिए पीजी की प्रभावकारिता का प्रमाण भी प्रदान करता है। अध्ययनों से पता चला है कि पीजी का विभिन्न प्रकार की दवा-प्रेरित यकृत की चोट मॉडल पर चिकित्सीय प्रभाव पड़ता है। पीजी या प्लैटीकोडिन अर्क के आहार पूरक उच्च वसा वाले आहार-प्रेरित मोटापे और इससे संबंधित चयापचय रोगों को सुधार सकते हैं 3,4,5. पीजी से पॉलीसेकेराइड का उपयोग चूहों में एलपीएस / डी-जीएएलएन के कारण तीव्र यकृत की चोट के उपचार के लिए किया जासकता है। इसके अलावा, पीजी की जड़ों से सैपोनिन उच्च वसा वाले आहार-प्रेरित गैर-मादक स्टीटोहेपेटाइटिस (एनएएसएच) 7 को सुधारते हैं। इसके अलावा, पीजी के सबसे महत्वपूर्ण चिकित्सीय घटकों में से एक, प्लैटिकोडिन डी (पीडी), मानव हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा (हेपजी 2) कोशिकाओं में कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन रिसेप्टर अभिव्यक्ति और कम घनत्व वाले लिपोप्रोटीन अपटेक को बढ़ा सकताहै। इसके अलावा, पीडी एपोप्टोसिस को भी प्रेरित कर सकता है और हेपजी 2 कोशिकाओं 9,10 में आसंजन, प्रवासन और आक्रमण को रोक सकता है। इस प्रकार, इस अध्ययन में, माउस हेपेटोमा एएमएल -12 कोशिकाओं का उपयोग इन विट्रो मॉडल निर्माण के लिए और इस मॉडल में पीडी के औषधीय प्रभावों और अंतर्निहित तंत्र का आगे अध्ययन करने के लिए किया जाता है।

गैर-अल्कोहल फैटी लीवर रोग (एनएएफएलडी) शब्द यकृत रोगों के एक समूह को संदर्भित करता है जिसमें सरल स्टीटोसिस, एनएएसएच, सिरोसिस और हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा11 शामिल हैं। यद्यपि एनएएफएलडी के रोगजनन को पूरी तरह से समझा नहीं गया है, क्लासिक "टू-हिट" सिद्धांत से वर्तमान "मल्टीपल-हिट" सिद्धांत तक, इंसुलिन प्रतिरोध को एनएएफएलडी 12,13,14 के रोगजनन में केंद्रीय माना जाता है। अध्ययनों से पता चला है कि हेपेटोसाइट्स में इंसुलिन प्रतिरोध से मुक्त फैटी एसिड में वृद्धि हो सकती है, जो ट्राइग्लिसराइड्स बनाते हैं जो यकृत में जमा होते हैं और यकृत को फैटी15,16 बनने का कारण बनते हैं। वसा के संचय से लिपोटॉक्सिसिटी, ऑक्सीडेटिव तनाव-प्रेरित माइटोकॉन्ड्रियल डिसफंक्शन, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम तनाव और भड़काऊ साइटोकिन रिलीज हो सकता है, जिसके परिणामस्वरूप एनएएफएलडी17,18 के रोगजनन और प्रगति हो सकती है। इसके अलावा, ऑटोफैगी एनएएफएलडी के रोगजनन में भी एक भूमिका निभाता है, क्योंकि यह सेलुलर इंसुलिन संवेदनशीलता, सेलुलर लिपिड चयापचय, हेपेटोसाइट चोट और जन्मजात प्रतिरक्षा 19,20,21 को विनियमित करने में शामिल है।

एनएएफएलडी22,23 के रोगजनन और संभावित चिकित्सीय लक्ष्यों की खोज के लिए एक आधार प्रदान करने के लिए विभिन्न प्रकार के पशु मॉडल और सेलुलर मॉडल स्थापित किए गए हैं। हालांकि, एकल पशु मॉडल एनएएफएलडी24 की सभी रोग प्रक्रियाओं की पूरी तरह से नकल नहीं कर सकते हैं। जानवरों के बीच व्यक्तिगत अंतर विभिन्न रोग संबंधी विशेषताओं को जन्म देते हैं। एनएएफएलडी के इन विट्रो अध्ययनों में यकृत कोशिका लाइनों या प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग प्रयोगात्मक स्थितियों में अधिकतम स्थिरता सुनिश्चित करता है। हेपेटिक लिपिड चयापचय विकृति एनएएफएलडी25 में हेपेटोसाइट लिपिड बूंद संचय के उच्च स्तर को जन्म दे सकती है। उच्च वसा वाले आहार26,27 के कारण एनएएफएलडी की नकल करने के लिए इन विट्रो मॉडल में ओलिक एसिड और ताड़ के तेल जैसे मुक्त फैटी एसिड का उपयोग किया गया है। मानव हेपेटोब्लास्टोमा सेल लाइन हेपजी 2 का उपयोग अक्सर विट्रो में एनएएफएलडी मॉडल के निर्माण में किया जाता है, लेकिन, ट्यूमर सेल लाइन के रूप में, हेपजी 2 कोशिकाओं का चयापचय सामान्यशारीरिक स्थितियों के तहत यकृत कोशिकाओं से काफी अलग है। इसलिए, दवा स्क्रीनिंग के लिए इन विट्रो एनएएफएलडी मॉडल का निर्माण करने के लिए प्राथमिक हेपेटोसाइट्स या माउस प्राथमिक हेपेटोसाइट्स का उपयोग करना ट्यूमर सेल लाइनों का उपयोग करने की तुलना में अधिक फायदेमंद है। पशु मॉडल और इन विट्रो हेपेटोसाइट मॉडल दोनों में दवा प्रभाव और चिकित्सीय लक्ष्यों की सहक्रियात्मक परीक्षा की तुलना करते हुए, ऐसा लगता है कि इन विट्रो एनएएफएलडी मॉडल के निर्माण के लिए माउस हेपेटोसाइट्स का उपयोग करने से बेहतर अनुप्रयोग क्षमता है।

यकृत में प्रवेश करने वाले मुक्त फैटी एसिड को ऊर्जा का उत्पादन करने के लिए ऑक्सीकरण किया जाता है या ट्राइग्लिसराइड्स के रूप में संग्रहीत किया जाता है। गौरतलब है कि मुक्त फैटी एसिड में एक निश्चित लिपोटॉक्सिसिटी होती है और सेलुलर डिसफंक्शन और एपोप्टोसिस12 को प्रेरित कर सकती है। पाल्मिटिक एसिड (पीए) मानव प्लाज्मा29 में सबसे प्रचुर मात्रा में संतृप्त फैटी एसिड है। जब गैर-वसा ऊतक में कोशिकाएं लंबे समय तक पीए की उच्च सांद्रता के संपर्क में आती हैं, तो यह प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के उत्पादन को उत्तेजित करता है और ऑक्सीडेटिव तनाव, लिपिड संचय और यहां तक कि एपोप्टोसिस30 का कारण बनता है। इसलिए, कई शोधकर्ता आरओएस का उत्पादन करने के लिए यकृत कोशिकाओं को उत्तेजित करने के लिए पीए का उपयोग एक प्रेरक के रूप में करते हैं और इस प्रकार, इन विट्रो फैटी यकृत रोग मॉडल का निर्माण करते हैं और कोशिकाओं 31,32,33,34 पर कुछ सक्रिय पदार्थों के सुरक्षात्मक प्रभावों का मूल्यांकन करते हैं। यह अध्ययन पीए द्वारा प्रेरित एनएएफएलडी के सेल मॉडल पर पीडी के सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करता है।

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Protocol

एएमएल -12 कोशिकाओं (एक सामान्य माउस हेपेटोसाइट सेल लाइन) का उपयोग सेल-आधारित अध्ययनों के लिए किया जाता है। कोशिकाओं को एक वाणिज्यिक स्रोत से प्राप्त किया जाता है ( सामग्री की तालिका देखें)।

1. विट्रो में एनएएफएलडी को मॉडल करने के लिए एएमएल -12 कोशिकाओं का उपचार

  1. सामान्य सेल कल्चर मीडिया (डीएमईएम प्लस हैम के एफ 12 [1: 1] में कोशिकाओं को बनाए रखें जिसमें 0.005 मिलीग्राम / एमएल इंसुलिन, 5 एनजी / एमएल सेलेनियम, 0.005 मिलीग्राम / एमएल ट्रांसफरिन, 40 एनजी / एमएल डेक्सामेथासोन, और 10% भ्रूण गोजातीय सीरम [एफबीएस], सामग्री की तालिका देखें) 5% सीओ2 के साथ आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर।
  2. कोशिकाओं को 12-वेल प्लेटों (1 एमएल / वेल) में 2.8 x 105 कोशिकाओं / अच्छी तरह से घनत्व के साथ बीज दें।
    नोट: कोशिकाओं को दूषित करने से बचने के लिए सभी सेल पाचन और मध्यम विनिमय संचालन एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में किए जाते हैं।
  3. रात भर के इनक्यूबेशन (~ 10 घंटे) के बाद कोशिकाओं के संस्कृति माध्यम को हटा दें, और फिर कोशिकाओं को सीरम-मुक्त मीडिया (प्रति कुएं) के 1 एमएल के साथ दो बार धोएं।
  4. 12-वेल सेल प्लेट को बाएं से दाएं चार अलग-अलग उपचार समूहों में विभाजित करें, जिसमें (1) नियंत्रण समूह, (2) पीडी-उपचारित समूह, (3) पीए-उपचारित समूह और (4) पीए + पीडी-उपचारित समूह शामिल हैं।
    नोट: प्रत्येक प्रयोगात्मक उपचार समूह की तीन प्रतिकृतियां एक ही 12-वेल सेल प्लेट पर ऊपर से नीचे तक व्यवस्थित की जाती हैं।
  5. नियंत्रण समूह और पीडी-उपचारित समूह में सामान्य सेल कल्चर मीडिया (1 एमएल / वेल) जोड़ें, और पीए-उपचारित और पीए + पीडी-उपचारित समूह में पीए के 300 μM के साथ पूरक सामान्य सेल कल्चर मीडिया (1 एमएल / वेल) जोड़ें।
  6. इनक्यूबेशन के 24 घंटे के बाद कोशिकाओं के संस्कृति माध्यम को हटा दें, और फिर कोशिकाओं को 1 एमएल सीरम-मुक्त मीडिया (प्रति कुआं) के साथ दो बार धोएं।
  7. नियंत्रण समूह में एक वाहन (डाइमिथाइल सल्फोक्साइड, डीएमएसओ, 0.1% वी / वी) के साथ पूरक सामान्य सेल कल्चर मीडिया (1 एमएल / वेल) जोड़ें; पीडी-उपचारित समूह में 1 μM PD के साथ पूरक सामान्य सेल कल्चर मीडिया (1 एमएल / वेल) जोड़ें; पीए-उपचारित समूह में 300 μM PA के साथ पूरक सामान्य सेल कल्चर मीडिया (1 एमएल / वेल) जोड़ें; पीए + पीडी-उपचारित समूह में 300 μM PA और 1 μM PD के साथ पूरक सामान्य सेल कल्चर मीडिया (1 एमएल / वेल) जोड़ें।
  8. अतिरिक्त 24 घंटे के लिए इनक्यूबेशन के बाद, 2', 7′-डाइक्लोरो-डाइहाइड्रो-फ्लोरेसिन डायसेटेट (डीसीएफएच-डीए) धुंधला (चरण 2), जेसी -1 धुंधला (चरण 3), और पश्चिमी सोख्ता (चरण 4) का उपयोग करके कोशिकाओं पर पीडी के सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच करें।
    नोट: सभी इनक्यूबेशन संचालन 5% सीओ2 के साथ आर्द्र वातावरण में 37 डिग्री सेल्सियस पर किए जाते हैं।

2. आरओएस उत्पादन में परिवर्तन का मापन

नोट: कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर आरओएस स्तर का मूल्यांकन डीसीएफएच-डीए धुंधला परख के आधार पर किया जाता है।

  1. उपचार अवधि (चरण 1.8) के अंत में, कोशिकाओं को 1 एमएल फॉस्फेट-बफर्ड खारा प्रति कुएं (1x PBS, pH 7.4) के साथ तीन बार धोएं, और फिर कोशिकाओं को प्रति अच्छी तरह से 10 μM DCFH-DA के 100 μL के साथ दाग दें ( सामग्री की तालिका देखें)। 30 मिनट के लिए अंधेरे में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
    नोट: यदि इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद कोई स्पष्ट हरी प्रतिदीप्ति नहीं देखी जाती है, तो जांच और कोशिकाओं के इनक्यूबेशन समय को उचित रूप से बढ़ाया जा सकता है (30-60 मिनट)। यदि इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद हरे रंग के प्रतिदीप्ति मूल्य का ओवरएक्सपोजर देखा जाता है, तो जांच और कोशिकाओं के इनक्यूबेशन समय को उचित रूप से कम किया जा सकता है (15-30 मिनट)।
  2. कोशिकाओं को 1x PBS (1 mL/ वेल) से तीन बार धोएं। प्रत्येक कुएं में 1 x PBS का 1 एमएल जोड़ें।
  3. माइक्रोस्कोप चरण पर 12-वेल प्लेट रखें ( सामग्री की तालिका देखें), और फिर कोशिकाओं की आकृति विज्ञान (आवर्धन: 200x) का निरीक्षण करने के लिए 20x उद्देश्य का उपयोग करें।
  4. 480 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 530 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ हरे फ्लोरोसेंट चैनल का उपयोग करके फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर प्रत्येक कुएं के लिए तीन प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों (आवर्धन: 200x) को कैप्चर करें।
    नोट: डीसीएफएच-डीए का पता लगाने के लिए 480 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 530 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ हरे फ्लोरोसेंट चैनल की सिफारिश की जाती है। इसके अतिरिक्त, डीसीएफएच-डीए को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप35,36 में जीएफपी और एफआईटीसी के लिए पैरामीटर सेटिंग्स के साथ पता लगाया जा सकता है।
  5. अंत में, छवि-अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ छवियों को संसाधित करें ( सामग्री की तालिका देखें), और फिर प्रत्येक समूह की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता या विभिन्न समूहों के अनुपात की गणना करने के लिए इमेजजे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: इमेजिंग कार्य के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और इमेज जे सॉफ्टवेयर के तकनीकी विवरण पहले37,38 वर्णित किए गए हैं।

3. माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में परिवर्तन का माप

नोट: माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता में परिवर्तन की निगरानी जेसी -1 धुंधला परख द्वारा की जाती है।

  1. उपचार अवधि (चरण 1.8) के अंत में, कोशिकाओं को 1x PBS के 1 mL से तीन बार धोएं, और फिर अंधेरे में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए 5 μg / mL JC-1 के 100 μL के साथ कोशिकाओं को दाग दें ( सामग्री की तालिका देखें)।
    नोट: यदि इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद कोई स्पष्ट हरी प्रतिदीप्ति नहीं देखी जाती है, तो जांच और कोशिकाओं के इनक्यूबेशन समय को उचित रूप से बढ़ाया जा सकता है (30-60 मिनट)। यदि इनक्यूबेशन के 30 मिनट के बाद हरे रंग के प्रतिदीप्ति मूल्य का ओवरएक्सपोजर देखा जाता है, तो जांच और कोशिकाओं के इनक्यूबेशन समय को उचित रूप से कम किया जा सकता है (15-30 मिनट)।
  2. कोशिकाओं को 1x PBS (1 mL/ वेल) से तीन बार धोएं। प्रत्येक कुएं में 1 x PBS का 1 एमएल जोड़ें।
  3. माइक्रोस्कोप चरण पर 12-वेल प्लेट रखें, और फिर कोशिकाओं की आकृति विज्ञान (आवर्धन: 200x) का निरीक्षण करने के लिए 20x उद्देश्य का उपयोग करें।
  4. क्रमशः 485 एनएम और 535 एनएम के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ हरे फ्लोरोसेंट चैनल का उपयोग करके फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोप पर प्रत्येक कुएं के लिए तीन प्रतिनिधि प्रतिदीप्ति छवियों (आवर्धन: 200x) को कैप्चर करें, और क्रमशः 550 एनएम और 600 एनएम के उत्तेजना और उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ लाल फ्लोरोसेंट चैनल।
    नोट: 485 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 535 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ हरे फ्लोरोसेंट चैनल का उपयोग जेसी -1 मोनोमर का पता लगाने के लिए किया जाता है, जिसे विध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया 39,40,41 के रूप में माना जाता है, और 550 एनएम की उत्तेजना तरंग दैर्ध्य और 600 एनएम के उत्सर्जन तरंग दैर्ध्य के साथ लाल फ्लोरोसेंट चैनल का उपयोग जेसी -1 डिमर का पता लगाने के लिए किया जाता है। जिसे ध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया 39,40,41 के रूप में माना जाता है।
  5. अंत में, छवि-अधिग्रहण सॉफ्टवेयर के साथ छवियों को संसाधित करें, और फिर प्रत्येक समूह की औसत प्रतिदीप्ति तीव्रता या विभिन्न समूहों के अनुपात की गणना करने के लिए इमेज जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: इमेजिंग कार्य के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप और इमेज जे सॉफ्टवेयर के तकनीकी विवरण पहले37,38 वर्णित किए गए हैं।

4. LC3-II/LC3-I और p62/SQSTM1 के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तरों का मापन

  1. उपचार (चरण 1.8) के बाद, कोशिकाओं को 1x PBS (1 mL / कुएं) के साथ तीन बार धोएं, जिसे 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रीकूल किया गया है।
  2. 12-वेल प्लेट में प्रोटीज और फॉस्फेट इनहिबिटर कॉकटेल (1x) ( सामग्री की तालिका देखें) के साथ पूरक आरआईपीए लाइसिस बफर (100 μL / वेल) जोड़ें, और 5 मिनट के लिए बर्फ पर लाइस जोड़ें।
  3. सेल लाइसेट को 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में इकट्ठा करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए 12,000 x g पर सेंट्रीफ्यूज करें। मानक प्रक्रियाओं42 का पालन करते हुए बीसीए विधि द्वारा सतह पर तैरने वाले की प्रोटीन सांद्रता निर्धारित करें।
  4. सेल लाइसेट सुपरनैटेंट (वॉल्यूम अनुपात = 1: 4) में एसडीएस-पेज नमूना लोडिंग बफर (5x, सामग्री की तालिका देखें) जोड़ें।
  5. भंवर द्वारा मिलाएं (~ 15 सेकंड के लिए उच्च गति पर), और प्रोटीन को विकृत करने के लिए 5 मिनट के लिए 100 डिग्री सेल्सियस पर मिश्रित नमूने गर्म करें।
  6. 12-अच्छी तरह से तैयार 12% एसडीएस-पेज जेल को वैद्युतकणसंचलन टैंक में डालें, और फिर ऊंचाई सीमा की स्थिति में अल्ट्रा-शुद्ध पानी से पतला एसडीएस अप-सैंपल बफर (1x) जोड़ें।
    नोट: एसडीएस-पेज जेल निर्माता के निर्देशों के अनुसार एक वाणिज्यिक किट ( सामग्री की तालिका देखें) का उपयोग करके तैयार किया गया है।
  7. एसडीएस-पेज जेल के विभिन्न कुओं में प्रोटीन मार्कर (5 μL / well) और नमूने (20 μg / वेल) जोड़ें।
  8. 100 वी पर स्थिर वोल्टेज मोड सेट करें, और 80 मिनट के लिए वैद्युतकणसंचलन करें।
  9. एसडीएस-पेज वैद्युतकणसंचलन के बाद, प्रोटीन के इलेक्ट्रोट्रांसफर को पॉलीविनाइलिडेन फ्लोराइड (पीवीडीएफ) झिल्ली (0.45 μM, सामग्री की तालिका देखें) में पहले प्रकाशित रिपोर्ट43,44 के बाद करें।
  10. प्रोटीन के इलेक्ट्रोट्रांसफर के बाद, पीवीडीएफ झिल्ली को कमरे के तापमान पर शेकर में 10 एमएल टीबीएसटी (1x TBS, 0.1% ट्वीन 20) के साथ दो बार (5 मिनट / समय) धोएं।
  11. 1 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर शेकर में 5 एमएल गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए, 5%) के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को अवरुद्ध करें।
  12. पीवीडीएफ झिल्ली को 10 एमएल टीबीएसटी के साथ तीन बार (10 मिनट / समय) धोएं। फिर, पीवीडीएफ झिल्ली को एलसी 3 (माउस एमएबी, 1: 2,000), पी 62 / एसक्यूएसटीएम 1 (इसके बाद पी 62, माउस एमएबी, 1: 2,000 के रूप में संदर्भित) और β-एक्टिन (माउस एमएबी, 1: 2,000) के लिए ब्लॉकिंग बफर में पतला विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के 5 एमएल में रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  13. कमरे के तापमान पर 10 एमएल टीबीएसटी के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को तीन बार (10 मिनट / समय) धोएं। फिर, कमरे के तापमान पर ब्लॉकिंग बफर (1: 10,000) ( सामग्री की तालिका देखें) में पतला खरगोश एंटी-माउस आईजीजी (एचआरपी) द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को इनक्यूबेट करें और 2 घंटे के लिए प्रकाश से आश्रय लें।
  14. कमरे के तापमान पर 10 एमएल टीबीएसटी के साथ पीवीडीएफ झिल्ली को तीन बार (10 मिनट / समय) धोएं। फिर, प्लास्टिक रैप पर पीवीडीएफ झिल्ली रखें, उचित मात्रा में ईसीएल वर्किंग सॉल्यूशन (200 μL / झिल्ली) जोड़ें ( सामग्री की तालिका देखें), और 2 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  15. इनक्यूबेशन के बाद, ईसीएल कामकाजी समाधान को हटा दें, और छवि विकास के लिए इमेजिंग सिस्टम में पीवीडीएफ झिल्ली को उजागर करें। अंत में, प्रत्येक बैंड के ग्रे मूल्यों का विश्लेषण करने के लिए छवि जे सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    नोट: इमेजिंग कार्य के लिए उपयोग किए जाने वाले पश्चिमी सोख्ता और इमेज जे सॉफ्टवेयर के तकनीकी विवरण पहले45,46 वर्णित किए गए हैं।

5. सांख्यिकीय विश्लेषण

  1. प्रयोगों से डेटा को मानक विचलन (एसडी) के औसत ± रूप में प्रस्तुत करें।
  2. पहले वर्णित सांख्यिकीय सॉफ़्टवेयर टूल के साथ महत्व का विश्लेषण करें।
  3. टी-टेस्ट का उपयोग करके दो समूहों के बीच सांख्यिकीय अंतर की गणना करें। 0.05 से नीचे के पी-मान को सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण माना जाता है: * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.005।

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Representative Results

कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर आरओएस
एएमएल -12 कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए 300 एसएम पीए के साथ प्रेरित किया गया था, और एक एनएएफएलडी सेल मॉडल स्थापित किया गया था। इसके बाद, कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए पीडी के साथ इलाज किया गया था। कोशिकाओं को डीसीएफएच-डीए फ्लोरोसेंट जांच के साथ लेबल किया गया था, और आरओएस उत्पादन को प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था। कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर आरओएस के डीसीएफएच-डीए धुंधला होने के परिणाम चित्रा 1 में दिखाए गए हैं। परिणामों से पता चला है कि पीडी 300 μM पीए (पी < 0.01) के साथ इनक्यूबेट कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर आरओएस के स्तर को काफी कम कर सकता है, यह दर्शाता है कि पीडी सेलुलर ऑक्सीडेटिव तनाव को कम कर सकता है।

कोशिकाओं की माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता
माइटोकॉन्ड्रियन केंद्रीय अंग है जो आंतरिक एपोप्टोसिस मार्ग 48,49,50 द्वारा नियंत्रित होता है। इसलिए, एएमएल -12 कोशिकाओं की माइटोकॉन्ड्रियल झिल्ली क्षमता (एमएमपी) जिसे 24 घंटे के लिए पीडी के साथ इनक्यूबेट किया गया था, जेसी -1 धुंधला होने के बाद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत देखा गया था। जैसा कि चित्र 2 में दिखाया गया है, पीए-उपचारित कोशिकाओं में हरे रंग की प्रतिदीप्ति (जेसी -1 मोनोमर्स, जिसे विध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया 39,40,41 के रूप में माना जाता है) अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में अधिक था। दूसरी ओर, पीए-उपचारित कोशिकाओं में लाल प्रतिदीप्ति (जेसी -1 डिमर, ध्रुवीकृत माइटोकॉन्ड्रिया 39,40,41 के रूप में माना जाता है) अनुपचारित कोशिकाओं की तुलना में कम था, जो कोशिकाओं में पीए-प्रेरित एमएमपी विध्रुवण का संकेत देता है। इसके अलावा, मॉडल समूह की तुलना में, पीडी उपचार समूह (पी < 0.01) में जेसी -1 मोनोमर्स: डिमर का अनुपात कम हो गया, यह दर्शाता है कि पीडी पीए-प्रेरित एमएमपी विध्रुवण को सुधार सकता है।

LC3-II/LC3-I और p62 के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर
इस अध्ययन ने पश्चिमी सोख्ता द्वारा कोशिकाओं में ऑटोफैगी से संबंधित प्रोटीन एलसी 3 और पी 62 के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर की जांच करके ऑटोफैगी मार्ग पर पीडी की संभावित भूमिका की भी जांच की। जैसा कि चित्र 3 में दिखाया गया है, LC3-II: LC3-I का अनुपात काफी कम हो गया (P < 0.005), और 48 घंटे (P < 0.01) के लिए PA के साथ इलाज किए जाने के बाद P62 का प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर बढ़ गया। दूसरी ओर, पीडी पी 62 (पी < 0.01) के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर को काफी कम कर सकता है और एलसी 3-II: एलसी 3-आई (पी < 0.05) के अनुपात को बढ़ा सकता है, यह दर्शाता है कि पीडी पीए द्वारा बाधित ऑटोफैजिक फ्लक्स को बहाल कर सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: डीसीएफएच-डीए स्टेनिंग द्वारा मूल्यांकन के अनुसार कोशिकाओं में इंट्रासेल्युलर आरओएस पर पीडी का प्रभाव। स्केल बार: 20 μm. (B) विभिन्न समूहों में ROS स्तरों में सापेक्ष गुना परिवर्तन। प्रत्येक कॉलम एसडी (एन = 3) ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। ** पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: जेसी -1 स्टेनिंग द्वारा मूल्यांकन के अनुसार कोशिकाओं में एमएमपी विध्रुवण पर पीडी का प्रभाव। (ए) एमएमपी विध्रुवण फ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी, 200x द्वारा पता लगाया गया था। स्केल बार: 20 μm. (B) विभिन्न समूहों में JC-1 मोनोमर्स: डिमर अनुपात में सापेक्ष परिवर्तन। प्रत्येक कॉलम एसडी (एन = 3) ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। ** पी < 0.01. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्र 3: पश्चिमी सोख्ता द्वारा मूल्यांकन के अनुसार कोशिकाओं में LC3-II/LC3-I और p62 के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तरों पर PD का प्रभाव। (A) पश्चिमी ब्लोटिंग द्वारा LC3, p62 और β-एक्टिन के प्रोटीन स्तरों का पता लगाया गया था। (बी) विभिन्न समूहों में एलसी 3-II: एलसी 3-1 अनुपात में सापेक्ष परिवर्तन। (सी) विभिन्न समूहों में पी 62 की अभिव्यक्ति में सापेक्ष गुना परिवर्तन। प्रत्येक कॉलम एसडी (एन = 3) ± माध्य का प्रतिनिधित्व करता है। * पी < 0.05, ** पी < 0.01, *** पी < 0.001। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

अध्ययनों ने इस तथ्य पर प्रकाश डाला है कि एनएएफएलडी एक क्लिनिकोपैथोलॉजिकल सिंड्रोम है, जो फैटी लीवर से लेकर एनएएसएच तक है, जो सिरोसिस और यकृत कैंसर51 में प्रगति कर सकता है। एक उच्च वसा वाले आहार और एक निष्क्रिय जीवन शैली एनएएफएलडी के लिए विशिष्ट जोखिम कारक हैं। एनएएफएलडी उपचार के लिए गैर-दवा उपचार और दवा उपचार दोनों पर 51,52,53 शोध किया गया है। हालांकि, एनएएफएलडी के रोगजनन को पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है। यहां वर्णित विधि में पीए-उत्तेजित एएमएल -12 कोशिकाओं द्वारा स्थापित एनएएफएलडी का एक इन विट्रो मॉडल शामिल है। हमने इस मॉडल में एनएएफएलडी के खिलाफ पीडी के सुरक्षात्मक प्रभावों की जांच की, और हमने पाया कि पीडी ने आरओएस में पीए-प्रेरित वृद्धि को क्षीण कर दिया। इसके अलावा, पीडी ने पीए-प्रेरित एमएमपी विध्रुवण को भी सुधारा। इसके अलावा, पीडी पी 62 के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर को काफी कम कर सकता है और एलसी 3-II: एलसी 3-आई के अनुपात को बढ़ा सकता है। ये प्रयोगात्मक परिणाम एनएएफएलडी उपचार के लिए एक सक्रिय दवा घटक के रूप में पीडी के आवेदन के लिए एक आधार प्रदान कर सकते हैं।

एक प्रमुख इंट्रासेल्युलर गिरावट मार्ग के रूप में, ऑटोफैगी कोशिकाओंमें अतिरिक्त घटकों को कम करके पोषक तत्वों के कच्चे माल के पुनर्चक्रण और पुन: उपयोग की शारीरिक प्रक्रिया का एहसास करता है। ऑटोफैगी शरीर के लिए "यिन-यांग संतुलन" बनाए रखने के लिए एक महत्वपूर्ण मरम्मत तंत्र भी है, और यह टीसीएम 55,56,57 में "क्यूई परिवर्तन" का सूक्ष्म अवतार है। वर्तमान प्रोटोकॉल में, आरओएस उत्पादन और एमएमपी विध्रुवण में परिवर्तन का पता लगाने के अलावा, पश्चिमी सोख्ता द्वारा ऑटोफैगी से संबंधित प्रोटीन एलसी -3 और पी 62 के प्रोटीन अभिव्यक्ति स्तर का पता लगाकर ऑटोफैगी मार्ग पर पीडी की संभावित भूमिका की जांच की गई थी। पीडी के साथ पीए-प्रेरित कोशिकाओं के उपचार के बाद, एलसी 3-II: एलसी 3-आई का अनुपात कम हो गया, और पी 62 का संचय बढ़ गया, यह दर्शाता है कि ऑटोफैगी का स्तर कम हो गया है। प्रयोगात्मक परिणाम अन्य साहित्यरिपोर्टों 20,34,58,59 के अनुरूप हैं। यह इन विट्रो सेल मॉडल पीडी के जैविक कार्य की समझ में सुधार करने में मदद कर सकता है और एनएएफएलडी के उपचार के लिए अन्य सक्रिय टीसीएम पदार्थों के उपयोग का अध्ययन करने में मदद कर सकता है।

प्रयोगात्मक प्रक्रिया में कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। यह निर्धारित करने के लिए कि क्या इन विट्रो एनएएफएलडी मॉडल सफलतापूर्वक स्थापित किया गया है, लिपिड ड्रॉपलेट जमा की तुलना सामान्य नियंत्रण और पीए-उपचारित समूह कोशिकाओं में ऑयल रेड ओ स्टेनिंग द्वारा की जा सकती है, जैसा कि पहले60,61 वर्णित है। डीसीएफएच-डीए धुंधला होने या जेसी -1 धुंधला होने के बाद, शेष जांच जो कोशिकाओं में प्रवेश नहीं करती हैं, उन्हें धोया जाना चाहिए; अन्यथा, यह प्रतिदीप्ति छवियों को लेते समय एक उच्च पृष्ठभूमि का कारण होगा। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट जांच (डीसीएफएच-डीए या जेसी -1) के लोडिंग और माप के बीच का समय (इनक्यूबेशन समय को छोड़कर) को प्रयोगात्मक त्रुटियों की संभावना को कम करने के लिए छोटा किया जाना चाहिए। इसके अलावा, फ्लोरोसेंट प्रोब्स (डीसीएफएच-डीए या जेसी -1) की कामकाजी सांद्रता को आवश्यकतानुसार समायोजित किया जा सकता है यदि नकारात्मक नियंत्रण समूह में कोशिकाओं का प्रतिदीप्ति मूल्य अपेक्षाकृत अधिक है। वैकल्पिक रूप से, जेसी -1 काम करने वाले समाधान और कोशिकाओं के इनक्यूबेशन समय को वास्तविक प्रयोगात्मक स्थितियों के अनुसार 15-60 मिनट की समय सीमा के भीतर उचित रूप से समायोजित किया जा सकता है।

इस इन विट्रो सेल मॉडल में कुछ सीमाएं भी हैं। यकृत पैरेन्काइमल कोशिकाओं, यकृत स्टेलेट कोशिकाओं, कुफ़्फ़र कोशिकाओं और संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाओं जैसी कोशिकाएं यकृतऊतकों में मौजूद होती हैं। इसलिए, केवल हेपेटिक पैरेन्काइमल कोशिकाओं पर प्रयोग दवाओं के प्रभावों को समझाने के लिए पर्याप्त नहीं हो सकते हैं। एनएएफएलडी विरोधी दवा की खोज में अन्य सेल मॉडल का भी उपयोग करने की आवश्यकता है। इसके अलावा, तीन आयामी (3 डी) सेल कल्चर सिस्टम का उपयोग यकृत मॉडल बनाने और हेपेटोटॉक्सिसिटी63,64 का परीक्षण करने के लिए किया गया है। भविष्य के अध्ययन संभावित एंटी-एनएएफएलडी दवा स्क्रीनिंग के लिए सह-संस्कृति और 3 डी सेल संस्कृति तकनीकों का उपयोग करके इन विट्रो मॉडल विकसित करने पर ध्यान केंद्रित करेंगे।

एक बहु-प्रणाली रोग के रूप में, कई कारक एनएएफएलडी के विकास और प्रगति में भूमिका निभाते हैं, जिसका अर्थ है कि एक एकल पशु मॉडल या सेल मॉडल इस बीमारी की सभी रोग प्रक्रियाओं की पूरी तरह से नकल नहीं करसकता है। पशु मॉडल के उपयोग पर अति-निर्भरता चिकित्सीय दवा विकास के बोझ को बढ़ाती है। एंटी-एनएएफएलडी दवा विकास के शुरुआती चरणों में इन विट्रो सेल मॉडल का उपयोग करना अधिक व्यावहारिक और लागत प्रभावी है। इस अध्ययन में, एनएएफएलडी के इन विट्रो मॉडल के निर्माण के लिए एक सामान्य माउस हेपेटोसाइट सेल लाइन एएमएल -12 का उपयोग किया गया था, और पीडी के चिकित्सीय प्रभाव को इस मॉडल में मान्य किया गया था। विशेष रूप से, इस अध्ययन के परिणाम चूहों हेपेटोसाइट और प्राथमिक हेपेटोसाइट मॉडल में पीडी के एंटी-एनएएफएलडी प्रभावों पर आगे के शोध के लिए एक आधार प्रदान करते हैं।

अंत में, एनएएफएलडी के खिलाफ पीडी के सुरक्षात्मक प्रभावों का अध्ययन करने के लिए एक इन विट्रो मॉडल यहां प्रस्तुत किया गया है। यह एनएएफएलडी के उपचार के लिए टीसीएम के अन्य सक्रिय पदार्थों की प्रभावकारिता की जांच के लिए एक उपयोगी इन विट्रो मॉडल भी हो सकता है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

यह काम चोंगकिंग विज्ञान और प्रौद्योगिकी आयोग (cstc2020jxjl-jbky10002, jbky200026, cstc2021jscx-dxwtBX0013, और jbky20210029) और चीन पोस्टडॉक्टरल साइंस फाउंडेशन (संख्या 2021MD703919) से अनुदान द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5% BSA Blocking Buffer Solarbio, Beijing, China SW3015
AML12 (alpha mouse liver 12) cell line Procell Life Science&Technology Co., Ltd, China AML12
Beyo ECL Plus Beyotime, Shanghai, China P0018S
Bio-safety cabinet Esco Micro Pte Ltd, Singapore AC2-5S1 A2 
cellSens Olympus, Tokyo, Japan 1.8
Culture CO2 Incubator Esco Micro Pte Ltd, Singapore CCL-170B-8
Dexamethasone Beyotime, Shanghai, China ST125
Dimethyl sulfoxide Solarbio, Beijing, China D8371
DMEM/F12 Hyclone, Logan, UT, USA SH30023.01
Foetal Bovine Serum Hyclone, Tauranga, New Zealand SH30406.05
Graphpad software GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA 8.0
HRP Goat Anti-Mouse IgG (H+L) ABclonal, Wuhan, China AS003
Hydrophobic PVDF Transfer Membrane Merck, Darmstadt, Germany IPFL00010
Insulin, Transferrin, Selenium Solution, 100× Beyotime, Shanghai, China C0341
MAP LC3β Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-376404
Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit with JC-1 Solarbio, Beijing, China M8650
Olympus Inverted Microscope IX53 Olympus, Tokyo, Japan IX53
Palmitic Acid Sigma, Germany P0500
Penicillin-Streptomycin Solution (100x) Hyclone, Logan, UT, USA SV30010
Phenylmethanesulfonyl fluoride Beyotime, Shanghai, China ST506
Phosphate Buffered Solution Hyclone, Logan, UT, USA BL302A
Platycodin D Chengdu Must Bio-Technology Co., Ltd, China CSA: 58479-68-8
Protease inhibitor cocktail for general use, 100x Beyotime, Shanghai, China P1005
Protein Marker Solarbio, Beijing, China PR1910
Reactive Oxygen Species Assay Kit Solarbio, Beijing, China CA1410
RIPA Lysis Buffer Beyotime, Shanghai, China P0013E
SDS-PAGE Gel Quick Preparation Kit Beyotime, Shanghai, China P0012AC
SDS-PAGE Sample Loading Buffer, 5x Beyotime, Shanghai, China P0015
Sigma Centrifuge Sigma, Germany 3K15
SQSTM1/p62 Antibody Santa Cruz Biotechnology (Shanghai) Co., Ltd SC-28359
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria 1510002987
WB Transfer Buffer,10x Solarbio, Beijing, China D1060
β-Actin Mouse mAb ABclonal, Wuhan, China AC004

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Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., … More

Wen, X., Wang, J., Fan, J., Chu, R., Chen, Y., Xing, Y., Li, N., Wang, G. Investigating the Protective Effects of Platycodin D on Non-Alcoholic Fatty Liver Disease in a Palmitic Acid-Induced In Vitro Model. J. Vis. Exp. (190), e64816, doi:10.3791/64816 (2022).

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