Methodenartikel

Untersuchung der Protein-Arginin-Methylierung: Ansätze und Methoden

DOI:

10.3791/64821

⸱

20. Januar 2023

1Pharmacology and Toxicology and Structural Genomics Consortium, University of Toronto

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

DISKUTIERTE ARTIKEL:

Hutchinson, A., Seitova, A. Produktion von rekombinanten PRMT-Proteinen unter Verwendung des Baculovirus-Expressionsvektorsystems. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (173), doi: 10.3791/62510 (2021).

Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. Ein massenspektrometrischer Proteomik-Ansatz für die globale und hochzuverlässige Protein-R-Methylierungsanalyse. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (182), doi: 10.3791/62409 (2022).

Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Erforschung des Arginin-Methyloms durch Kernspinresonanzspektroskopie. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (178), doi: 10.3791/63245 (2021).

Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative Methoden zur Untersuchung der Protein-Arginin-Methyltransferase 1-9-Aktivität in Zellen. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (174), doi: 10.3791/62418 (2021).

Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Der Proximity-Ligationsassay ermöglicht den Nachweis, die Lokalisierung und die Quantifizierung der Protein-Arginin-Methylierung in fixiertem Gewebe. Zeitschrift für visualisierte Experimente. (185), doi: 10.3791/64294 (2022).

Editorial

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Protein-Arginin-Methylierung ist eine posttranslationale Modifikation, die an der Regulation eines breiten Spektrums biologischer Prozesse beteiligt ist 1,2,3. Die neun Mitglieder der Familie der Protein-Arginin-Methyltransferasen (PRMTs) können Arginine symmetrisch oder asymmetrisch als Monomethyl und Dimethyl methylieren. Das Verständnis der funktionellen Konsequenzen und die Katalogisierung der methylierten Substrate von PRMTs haben das Verständnis der PRMT-Enzyme dramatisch verbessert und ihre Verknüpfung mit der Krankheiterleichtert 2. Darüber hinaus hat die Entwicklung wirksamer und selektiver Inhibitoren auf chemischer Biologie basierende Ansätze zur Untersuchung von PRMTs ermöglicht und die klinische Entwicklung der PRMT-Zielwirkstoffe beschleunigt3. Im Zuge der Fortschritte auf dem Gebiet der PRMTs werden neuartige Methoden und ihre Anwendungen die Aufklärung der Regulation und Biologie dieser Enzyme ermöglichen.

In dieser Methodensammlung liefert ein Artikel über die rekombinante Produktion der PRMT-Proteine eine detaillierte Beschreibung eines Baculovirus-basierten Expressionssystems4. Mit der bakteriellen Expression können mehrere PRMTs erzeugt werden; größere oder komplexe abhängige PRMTs wie PRMT7 oder PRMT5 erfordern jedoch ein Insektenzellexpressionssystem. Diese Methode hat bereits zahlreichen In-vitro-Bemühungen zur Bestimmung der Substrate von PRMTs geholfen.

Die Untersuchung von PRMT-Substraten in der zellulären Umgebung erfordert ausgefeilte Nachweisansätze. Zwei Artikel in dieser Sammlung stellen unterschiedliche Methoden vor, die auf der Antikörperanreicherung von methylierten Argininen beruhen, gefolgt von einer massenspektrometrischen Quantifizierung oder einer Antikörper-unabhängigen Quantifizierung mittels Kernspinresonanz (NMR). Es wurden mehrere Antikörper entwickelt, die unterschiedliche Methylierungszustände erkennen und in Studien zur Identifizierung der PRMT-Substrate verwendet wurden5. Die massenspektrometrische Methode ermöglicht die quantitative Bewertung der Arginin-Methylierung von zellulären Proteinen durch metabolische Markierung, anschließende ausgefeilte Trenntechniken und antikörperbasierte Anreicherung6. Mehrere Mitglieder der PRMT-Familie bevorzugen methylierende Arginine, die in repetitiven RGG-Motiven vorkommen, die sich in den intrinsisch ungeordneten Regionen von Proteinen befinden7. Die auf NMR-Spektroskopie basierende Methode ermöglicht die Bestimmung des Methylierungszustands und der Position aller Argininderivate (Mono und Di, symmetrisch und asymmetrisch), wo sie in komplexen biologischen Proben zuverlässig quantifiziert werden können8.

Um methylierte Argininreste in bestimmten Proteinen zu identifizieren, bieten zwei Artikel Ansätze an, die auf Western Blotting und dem Proximity Ligation Assay (PLA) basieren. Beide Methoden nutzen den Antikörper-basierten Nachweis, unterscheiden sich jedoch in der Nachweismethode und den bereitgestellten Informationen. Die Western-Blot-Methode ist quantitativ und hat sich bei der Charakterisierung chemischer Sonden als wertvoll erwiesen9. Das PLA liefert Informationen über die räumliche Lokalisation des methylierten Arginins, da es den Zielprotein-Antikörper und den generischen Antikörper für Mono- oder Dimethylarginin verwendet, wodurch die Notwendigkeit umgangen wird, spezifische Antikörper zu erzeugen, und bemerkenswerterweise auf fixierten Geweben10 verwendet werden kann.

Zusammen werden diese verschiedenen Methoden eine robuste Entdeckung von methylierten Argininen in verschiedenen Zellsystemen und Krankheitszuständen ermöglichen und das grundlegende Wissen über die biologische Funktion der PRMT-Enzyme weiter vorantreiben.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.B.L. wird vom Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) unterstützt. Das Structural Genomics Consortium ist eine eingetragene Wohltätigkeitsorganisation (Nr.: 1097737), die Mittel von Bayer AG, Boehringer Ingelheim, Bristol Myers Squibb, Genentech und Genome Canada über das Ontario Genomics Institute [OGI-196], EU/EFPIA/OICR/McGill/KTH/Diamond Innovative Medicines Initiative 2 Joint Undertaking [EUbOPEN-Zuschuss 875510], Janssen, Merck KGaA (auch bekannt als EMD in Kanada und den USA), Pfizer und Takeda erhält.

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Bedford, M. T., Clarke, S. G. Protein arginine methylation in mammals: who, what, and why. Molecular Cell. 33 (1), 1-13 (2009).
  2. Blanc, R. S., Richard, S. Arginine methylation: The coming of age. Molecular Cell. 65 (1), 8-24 (2017).
  3. Wu, Q., Schapira, M., Arrowsmith, C. H., Barsyte-Lovejoy, D. Protein arginine methylation: from enigmatic functions to therapeutic targeting. Nature Reviews. Drug Discovery. 20 (7), 509-530 (2021).
  4. Hutchinson, A., Seitova, A. Production of recombinant PRMT proteins using the baculovirus expression vector system. Journal of Visualized Experiments. (173), e62510(2021).
  5. Dhar, S., et al. Loss of the major Type I arginine methyltransferase PRMT1 causes substrate scavenging by other PRMTs. Scientific Reports. 3, 1311(2013).
  6. Maniaci, M., Marini, F., Massignani, E., Bonaldi, T. A mass spectrometry-based proteomics approach for global and high-confidence protein R-methylation analysis. Journal of Visualized Experiments. (182), e62409(2022).
  7. Thandapani, P., O'Connor, T. R., Bailey, T. L., Richard, S. Defining the RGG/RG motif. Molecular Cell. 50 (5), 613-623 (2013).
  8. Habisch, H., Zhang, F., Zhou, Q., Madl, T. Exploring the arginine methylome by nuclear magnetic resonance spectroscopy. Journal of Visualized Experiments. (178), e63245(2021).
  9. Szewczyk, M. M., Vu, V., Barsyte-Lovejoy, D. Quantitative methods to study protein arginine methyltransferase 1-9 activity in cells. Journal of Visualized Experiments. (174), e62418(2021).
  10. Poulard, C., Jacquemetton, J., Valantin, J., Treilleux, I., Le Romancer, M. Proximity ligation assay allows the detection, localization, and quantification of protein arginine methylation in fixed tissue. Journal of Visualized Experiments. (185), e64294(2022).

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Recombinant PRMT ProteinsBaculovirus Expression VectorMass SpectrometryProteomics ApproachProtein R methylation AnalysisArginine MethylomeNuclear Magnetic Resonance SpectroscopyProtein Arginine Methyltransferase ActivityProximity Ligation AssayProtein DetectionTissue Quantification

Verwandte Artikel