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Mit ihren bemerkenswerten Gewinnen an Empfindlichkeit, Geschwindigkeit und Vielseitigkeit bietet die moderne Massenspektrometrie (MS) Forschern größere Möglichkeiten zur Charakterisierung von Proteomen. Mit verbesserten Technologien fordern die Forscher ein höheres Maß an Strenge in ihren Ergebnissen. Daher sind innovative Probenvorbereitungsstrategien, die entwickelt wurden, um komplexe proteomische Mischungen vor der MS zu isolieren, zu trennen und zu verarbeiten, für den Proteomik-Workflow von gleicher Bedeutung. Die chemische Vielfalt der proteomischen Systeme schließt einen einheitlichen Ansatz für die Probenvorbereitung aus. Wie jedoch an dieser Methodenerfassung zu sehen ist, stehen mehrere Protokolle zur Verfügung, um die Qualität und Zuverlässigkeit der MS-Daten zu maximieren. Diese Sammlung zielt darauf ab, Forschern einfach zu implementierende Werkzeuge und Tricks zur Verfügung zu stellen, die entwickelt wurden, um das erwartete Ergebnis von proteomischen und metabolomischen Arbeitsabläufen zu verbessern.
Kapillare HPLC- und UPLC-Säulen sind in umfassenden Proteomik-Arbeitsabläufen nahezu allgegenwärtig. Während selbstgepackte Kapillarsäulen eine kostengünstige Alternative zu kommerziellen Säulen sind, sind diejenigen, die versucht haben, ihre eigenen Säulen zu packen, möglicherweise mit inkonsistenten Packungsraten und variabler Säulenqualität vertraut. Kovalchuk und Kollegen von der Russischen Akademie der Wissenschaften demonstrieren ihren FlashPack-Ansatz, um die effiziente und konsistente Packung der UPLC-Kapillarsäulenzu gewährleisten 1. Eine Kombination von präzise gesteuerten Größen reduziert die Kupolbildung am Kapillareingang und ermöglicht eine schnelle Säulenbefüllung mit einer Niederdruck-Packungsbombe.
Die Immunpeptidomik ist eine aufstrebende Teildisziplin der Proteomik mit klinischen Implikationen in der Onkologie und Immuntherapie. Eine zuverlässige MS-Analyse erfordert die Isolierung von MHC-Klasse-I/II- oder humanen Leukozytenantigen (HLA)-Peptidliganden. Um die Reproduzierbarkeit dieses Isolationsprotokolls zu verbessern, demonstrieren Sirois und Kollegen an der Universität Montreal einen kleinen Bead-basierten Affinitätserfassungs-Workflow zusammen mit den erwarteten MS-Ergebnissen des wiederhergestellten Immunpeptidoms2.
Um die Genauigkeit der Proteomik-Daten weiter zu verbessern und die Hochdurchsatzverarbeitung großer Probenmengen zu ermöglichen, setzen die Forscher zunehmend auf Roboterplattformen, um die Probenverarbeitungsschritte zu automatisieren. Es steht eine kostengünstige Roboterplattform zur Verfügung, die jedoch erfordert, dass der Benutzer die gewünschten Manipulationsschritte programmiert, was ein Hindernis für die Verwendung dieses Geräts darstellen kann. Han et al. vom Anschutz Medical Campus der University of Colorado haben ein einfaches Open-Source-Codierungspaket entwickelt und demonstrieren die grundlegenden Schritte der Proteinverdauung auf der Opentrons OT-2-Roboterplattform3.
Tenside wie SDS werden häufig eingesetzt, um die zelluläre Extraktion und die Proteomsolubilisierung vor MS zu erleichtern. Die Entfernung des Sicherheitsdatenblatts kann jedoch unvollständig sein oder anderweitig den Verlust von Proben riskieren. Nickerson und Kollegen von der Dalhousie University demonstrieren eine Einwegkartusche, um den Prozess der Proteinfällung zu automatisieren4. Eine Kombination aus Salz und organischem Lösungsmittel ist entscheidend für die Maximierung der Proteinrückgewinnung und kann in kürzester Zeit bei hohen Ausbeuten durchgeführt werden.
Die Metabolomik tritt in die Fußstapfen der Proteomanalyse, mit einer wachsenden Datenbank von Referenz-MS-Spektren, die verwendet werden, um unbekannte Metaboliten in gezielten und ungezielten Arbeitsabläufen zu identifizieren. Ähnlich wie bei der Proteomik-Analyse sind spektrale Identifikationen anfällig für falsch positive Übereinstimmungen, und daher ist eine statistische Berichterstattung über die Falschentdeckungsrate (FDR) unerlässlich, um Ergebnisse mit geringer Konfidenz zu filtern. Li und Kollegen von der Jinan University haben sich mit Chi-Biotech Co. zusammengetan, um einen webbasierten Workflow auf der Grundlage ihres XY-Meta-Programms zu erstellen und eine Zielköder-Datenbank mit Metabolitenzu generieren 5. Sie demonstrieren die Schritte zur Generierung der Zieldatenbank und filtern die metabolomischen Ergebnisse basierend auf einer gewünschten FDR.
Schließlich wird ein Protokoll für die Isolierung von Einzelzellproteomen von Petelski und Kollegen an der Northeastern University6 demonstriert. Das Single-Cell ProtEomics (SCoPE2)-Protokoll ermöglicht es Forschern, Hunderte bis Tausende von Proteinen in einem einzigen Experiment zu quantifizieren, wobei ein isobarer Träger verwendet wird, um den Probenverlust zu reduzieren. Der Schlüssel zum Protokoll ist ein schneller thermischer Zyklusschritt zur Lyse der Zellen sowie ein effizienter tryptischer Verdau unter Verwendung einer überdurchschnittlich großen Menge an Enzymen und isobarer Markierung mit TMT-Markierungen.
Trotz jahrzehntelanger Erfahrung in der Proteomik hat sich dieses ausgereifte Feld einfach weiterentwickelt, um anspruchsvollere Probleme anzugehen. Die Fähigkeit, eine größere Anzahl von Proben oder kleinere Materialmengen mit größerer Konsistenz und Vertrauen in die Datenausgabe zu verarbeiten, treibt technologische Innovationen weiter voran. Der Austausch von Ideen im Zusammenhang mit chemischen Manipulationen, instrumentellen und informatischen Ansätzen ist für das Wachstum dieses Bereichs von entscheidender Bedeutung. Das "Problem" eines Forschers kann bereits durch einen einfachen "Tipp oder Trick" gelöst worden sein, um die Herausforderung zu meistern. Es ist daher ein positives Zeichen, dass so viele einzigartige Strategien für die Proteomanalyse zur Verfügung stehen. Bei den verbleibenden Herausforderungen ist es wahrscheinlich, dass bereits jemand an einer möglichen Lösung arbeitet.