Dieses Protokoll beschreibt eine unkomplizierte und minimalinvasive Methode zur Transplantation und Bildgebung von NIT-1-Zellen in nicht-adipösen diabetischen (NOD)-schweren kombinierten immundefizienten Mäusen, die mit Splenozyten konfrontiert wurden, die von spontan diabetischen NOD-Mäusen gereinigt wurden.
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Methodenartikel
Biolumineszentes Monitoring des Transplantatüberlebens in einem adoptiven Transfermodell des Autoimmundiabetes bei Mäusen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Typ-1-Diabetes ist gekennzeichnet durch die autoimmune Zerstörung der insulinproduzierenden Betazellen der Bauchspeicheldrüse. Eine vielversprechende Behandlung für diese Krankheit ist die Transplantation von Betazellen aus Stammzellen. Genetische Veränderungen können jedoch notwendig sein, um die transplantierten Zellen vor anhaltender Autoimmunität zu schützen. Diabetische Mausmodelle sind ein nützliches Werkzeug für die vorläufige Evaluierung von Strategien zum Schutz transplantierter Zellen vor Autoimmunangriffen. Hier wird ein minimalinvasives Verfahren zur Transplantation und Bildgebung von Zelltransplantaten in einem adoptiven Transfermodell von Diabetes in Mäusen beschrieben. In diesem Protokoll werden Zellen aus der murinen Pankreas-Betazelllinie NIT-1, die das Glühwürmchen-Luciferase-Transgen luc2 exprimieren, subkutan in immundefizige, nicht-adipöse diabetische (NOD)-schwere kombinierte immundefiziente (scid) Mäuse transplantiert. Diesen Mäusen werden gleichzeitig Splenozyten von spontandiabetischen NOD-Mäusen intravenös injiziert, um Autoimmunität zu übertragen. Die Transplantate werden in regelmäßigen Abständen mittels nicht-invasiver biolumineszenter Bildgebung abgebildet, um das Überleben der Zellen zu überwachen. Das Überleben von mutierten Zellen wird mit dem von Kontrollzellen verglichen, die in dieselbe Maus transplantiert wurden.
Einleitung
Typ-1-Diabetes (T1D) wird durch die autoimmune Zerstörung der insulinproduzierenden Betazellen der Bauchspeicheldrüse verursacht. Der Verlust von Betazellmasse führt zu Insulinmangel und Hyperglykämie. T1D-Patienten sind auf mehrere tägliche Injektionen von exogenem Insulin angewiesen und leiden im Laufe ihres Lebens unter Episoden schwerer Hyperglykämie und Hypoglykämie. Zu den Komplikationen, die mit diesen Episoden verbunden sind, gehören diabetische Retinopathie, verminderte Nierenfunktion und Neuropathie1.
Insulininjektionen sind eine Behandlung, aber keine Heilung für T1D. Der Ersatz der verlorenen Betazellmass....
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Protokoll
Abbildung 1: Der Arbeitsablauf für die Transplantation und Bildgebung von Transplantaten in einem adoptiven Transfermodell von Diabetes bei Mäusen. NIT-1-Zellen, die das Glühwürmchen-Transgen Luciferase (luc2) exprimieren, werden subkutan in NOD-scid-Mäuse transplantiert. Den Mäusen werden gleichzeitig autoreakti....
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Ergebnisse
Eine Übersicht über das Protokoll ist in Abbildung 1 dargestellt. Das Überleben zweier Zelllinien, wie z.B. einer mutierten und einer nicht-zielgerichteten Kontrolle, kann verglichen werden, oder das Überleben einer Zelllinie kann in mehreren Gruppen von Mäusen gemessen werden, wie z. B. medikamentös behandelte Mäuse im Vergleich zu mit Vehikeln behandelten Kontrollen. Abbildung 3A zeigt drei 8 Wochen alte weibliche NOD-scid-Mäuse, die mit einer nicht-zielgerich.......
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Diskussion
T1D ist eine verheerende Krankheit, für die es derzeit keine Heilung gibt. Die Betazellersatztherapie bietet eine vielversprechende Behandlung für Patienten mit dieser Krankheit, aber das entscheidende Hindernis für diese Strategie ist das Potenzial für wiederkehrende Autoimmunangriffe gegen die transplantierten Betazellen. Eine mögliche Lösung für dieses Problem ist die gentechnische Veränderung von SC-beta-Zellen, um deren Immunsichtbarkeit oder -anfälligkeit zu verringern. Hier wird ein Protokoll für die nicht-invasiv.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass keine Interessenkonflikte bestehen.
Danksagungen
Wir danken Dr. Erica P. Cai und Dr. Yuki Ishikawa für die Entwicklung der in diesem Protokoll beschriebenen Methode (siehe Ref. 11). Die Forschung in den Labors von S.K. und P.Y. wird durch Zuschüsse der National Institutes of Health (NIH) (R01DK120445, P30DK036836), JDRF, des Harvard Stem Cell Institute und der Beatson Foundation unterstützt. T.S. wurde durch ein Postdoc-Stipendium des National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (T32 DK007260-45) unterstützt, und K.B. wurde teilweise durch ein Stipendium der Mary K. Iacocca Foundation unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsin, 0,53 mM EDTA | Corning | 25-052-CI | |
| 293FT | Invitrogen | R70007 | Schnellwachsendes, hochgradig transfizierbares klonales Isolat, das aus menschlichen embryonalen Nierenzellen gewonnen wird, die mit dem SV40-Large-T-Antigen transformiert |
| wurden ACK Lysing Buffer | Gibco | A10492-01 | |
| Alkoholvorbereitungspads, 70 % Isopropylalkohol | Amazon/Ever Ready Erste Hilfe | B08NWF31DX | |
| BD 5ml Spritze Luer-Lok Spitze | BD | 309646 | |
| BD PrecisionGlide Nadel 26G x 5/8 (0,45 mm x 16 mm) Sub-Q | BD | 305115 | |
| BD 1 mL TB Spritze Slip Tip | BD | 309659 | |
| Blasticidin S HCl | Corning | 30-100-RB | |
| Zellsieb premium SureStrain, 70 & micro; m, steril | Southern Labware | C4070 | Oder verwenden Sie ein ähnliches steriles Sieb mit einer Porengröße von 40-70 μm |
| CellDrop automatisierter Zellzähler | Denovix | CellDrop BF-PAYG | Oder verwenden Sie ein ähnliches Zellzählergerät |
| Corning 100 mL Penicillin-Streptomycin-Lösung, 100x | Corning | 30-002-CI | |
| Einweg-Aspirationspipetten, Polystyrol, steril, Kapazität=2 mL | VWR | 414004-265 | Oder verwenden Sie eine ähnliche Aspirationspipette |
| D-Luciferin, Kaliumsalz, Molekularbiologie, Pulver, >99% | Goldbio | LUCK-100 | |
| DMEM, hohe Glukose, Pyruvat, kein Glutamin | Gibco | 10313039 | |
| Falcon BD Röhrchen, 50 mL | Fisher Scientific | 14-959-49A | |
| Fötales Rinderserum | Gibco | 10437-028 | |
| Pinzette Premium für Gewebe, 1 x 2 Zähne 5 Zoll, German | Steel Fisher Scientific | 13-820-074 | |
| Glukose-Urin-Teststreifen | California Pet Pharmacy | u-tsg100 | Oder verwenden Sie einen ähnlichen Teststreifen für Glukosemessungen im Urin/Blut |
| GlutaMAX– 1 (100x) | Gibco | 35050-061 | |
| Infrarot-Heizlampe | Cole Parmer | 03057-00 | Oder verwenden Sie eine ähnliche Infrarotlampe |
| Insulinspritze 0,5 ml, U-100 29 g 0,5 in | Becton Dickinson | 309306 | |
| Isofluran, USP | Piramal Critical Care | 6679401725 | |
| IVIS Spectrum In-vivo-Bildgebungssystem | Perkin Elmer | 124262 | Instrument zur nicht-invasiven Sammlung von biolumineszierenden Bildern transplantierter Zellen |
| Software zur Analyse lebender Bilder | Perkin Elmer | 128113 | Software zum Sammeln und Quantifizieren von Biolumineszenzsignalen |
| Mikrozentrifugenröhrchen seal-rite, 1,5 mL | USA Scientific | 1615-5510 | Oder verwenden Sie ähnliche sterile Mikrozentrifugenröhrchen |
| NIT-1 | ATCC | CRL-2055 | Pankreas-Beta-Zelll-Linie, abgeleitet von NOD/Lt-Mäusen |
| NOD. Cg-Prkdcscid/J | The Jackson Laboratory | 001303 | Mäuse, die homozygot für die schwere kombinierte Immundefizienz-Spontanmutation sind Prkdcscid, allgemein bezeichnet als scid, zeichnen sich durch das Fehlen von funktionellen T-Zellen und B-Zellen, Lymphopenie, Hypogammaglobulinämie und eine normale hämatopoetische Mikroumgebung aus. |
| NOD/ShiLtJ | The Jackson Laboratory | 001976 | Der NOD/ShiLtJ-Stamm von Mäusen (allgemein als NOD bezeichnet) ist ein polygenes Modell für Autoimmun-Typ-1-Diabetes |
| PBS, pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | Kein Kalzium, kein Magnesium, kein Phenolrot |
| pCMV-VSV-G | Addgene | 8454 | |
| pLenti-Luciferase-Blast | Hergestellt im Haus | Plasmid auf Anfrage | erhältlichSiehe ergänzende Datei 1 |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| Polyethylenimin, linear, MW 25.000, Transfektionsgrad (PEI 25K) | Fisher Scientific | NC1014320 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| Rückhaltesystem für Nagetiere, brutartig Runde 1 in | Fisher Scientific | 01-288-32A | |
| Schere, scharfe Spitze | Fisher Scientific | 08-940 | Oder verwenden Sie eine andere Schere aus chirurgischem Edelstahl |
| Mit Gewebekulturen behandelte Kulturschalen | Millipore Sigma | CLS430167-20EA | Oder verwenden Sie andere sterile, mit Zellkulturen behandelte Petrischalen |
| Pinzetten/Pinzetten, feine Präzision mit mittlerer Spitze | Fisher Scientific | 12-000-157 |
Referenzen
- Katsarou, A., et al. Type 1 diabetes mellitus. Nature Reviews Disease Primers. 3, 17016(2017).
- Shapiro, A. M., Pokrywczynska, M., Ricordi, C. Clinical pancreatic islet transplantation. Nature Reviews Endocrinology. 13 (5), 268-277 (2017).
- Pagliuca, F. W., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
