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Biochemistry

लाल रक्त कोशिका प्रोटीन में गतिशील परिवर्तनों का इम्यूनोस्टेनिंग-आधारित पता लगाना

Published: March 17, 2023 doi: 10.3791/64843
Automatic Translation
1, 2
1Department of Molecular and Cellular Sports Medicine, German Sport University Cologne, 2Biorheology Research Laboratory, Menzies Health Institute, Griffith University Gold Coast

Summary

एन्यूक्लिएटेड लाल रक्त कोशिकाओं के प्रोटीन सक्रियण में गतिशील परिवर्तनों को कैप्चर करना पद्धतिसंबंधी चुनौतियों का सामना करता है, जैसे कि बाद के मूल्यांकन के लिए तीव्र उत्तेजनाओं में गतिशील परिवर्तनों का संरक्षण। प्रस्तुत प्रोटोकॉल नमूना तैयारी और धुंधला तकनीकों का वर्णन करता है जो प्रासंगिक प्रोटीन परिवर्तनों और बाद में पता लगाने के संरक्षण और विश्लेषण को सक्षम करता है।

Abstract

लाल रक्त कोशिका (आरबीसी) प्रोटीन की एंटीबॉडी लेबलिंग समग्र प्रोटीन सामग्री में परिवर्तन या प्रोटीन सक्रियण राज्यों में तीव्र परिवर्तन का पता लगाने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली, अर्ध-मात्रात्मक विधि है। यह आरबीसी उपचार के मूल्यांकन, कुछ रोग राज्यों में मतभेदों के लक्षण वर्णन और सेलुलर कोहेरेंस के विवरण की सुविधा प्रदान करता है। तीव्र रूप से परिवर्तित प्रोटीन सक्रियण का पता लगाने के लिए (उदाहरण के लिए, मेकेनोट्रांसडक्शन के माध्यम से) अन्यथा अस्थायी प्रोटीन संशोधनों को संरक्षित करने के लिए पर्याप्त नमूना तैयारी की आवश्यकता होती है। मूल सिद्धांत में विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी के प्रारंभिक बंधन को सक्षम करने के लिए वांछित आरबीसी प्रोटीन के लक्ष्य बाध्यकारी साइटों को स्थिर करना शामिल है। द्वितीयक एंटीबॉडी को संबंधित प्राथमिक एंटीबॉडी से बांधने के लिए इष्टतम परिस्थितियों की गारंटी देने के लिए नमूना को आगे संसाधित किया जाता है। गैर-फ्लोरोसेंट द्वितीयक एंटीबॉडी के चयन के लिए अतिरिक्त उपचार की आवश्यकता होती है, जिसमें बायोटिन-एविडिन युग्मन और धुंधला विकसित करने के लिए 3,3-डायमिनोबेंज़िडाइन-टेट्राहाइड्रोक्लोराइड (डीएबी) का आवेदन शामिल है, जिसे ऑक्सीकरण को रोकने के लिए माइक्रोस्कोप के तहत वास्तविक समय में नियंत्रित करने की आवश्यकता होती है, और इस प्रकार समय पर तीव्रता को धुंधला करना पड़ता है। धुंधला तीव्रता का पता लगाने के लिए, छवियों को एक मानक प्रकाश माइक्रोस्कोप का उपयोग करके लिया जाता है। इस प्रोटोकॉल के संशोधन में, इसके बजाय एक फ्लोरेसिन-संयुग्मित द्वितीयक एंटीबॉडी लागू किया जा सकता है, जिसका लाभ यह है कि कोई और विकास कदम आवश्यक नहीं है। हालांकि, इस प्रक्रिया को धुंधला पता लगाने के लिए माइक्रोस्कोप से जुड़े प्रतिदीप्ति उद्देश्य की आवश्यकता होती है। इन विधियों की अर्ध-मात्रात्मक प्रकृति को देखते हुए, गैर-विशिष्ट एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं और पृष्ठभूमि संकेतों के लिए कई नियंत्रण दाग प्रदान करना अनिवार्य है। यहां, हम विभिन्न धुंधला तकनीकों के संबंधित परिणामों और लाभों की तुलना और चर्चा करने के लिए धुंधला प्रोटोकॉल और संबंधित विश्लेषणात्मक प्रक्रियाओं दोनों को प्रस्तुत करते हैं।

Introduction

लाल रक्त कोशिकाएं (आरबीसी) 70 से 140 दिनों के लिए कार्डियोवैस्कुलर सिस्टम को पार करती हैं, जिसमें लगभग 115 दिनों की औसत आरबीसी आयु 1,2 होती है। सेनेसेंट या क्षतिग्रस्त आरबीसी को एरिथ्रोफागोसाइटोसिस द्वारा परिसंचरण से हटा दिया जाता है, मैक्रोफेज3 द्वारा संचालित एक कुशल समाशोधन प्रक्रिया। इन कोशिकाओं का पूर्व निर्धारित जीवनकाल विभेदन और परिपक्वता के दौरान नाभिक, माइटोकॉन्ड्रिया और राइबोसोम सहित सेल ऑर्गेनेल को आत्मसमर्पण करने का एक परिणामहै। इस प्रकार, परिसंचारी आरबीसी एक ट्रांसलेशनल मशीनरी से रहित होते हैं, जोनए प्रोटीन 3 के संश्लेषण को प्रभावित करते हैं। यह इस प्रकार है कि मौजूदा प्रोटीन में गतिशील, पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन आरबीसी5 पर कार्य करने वाले बाह्य और इंट्रासेल्युलर तनावों के जवाब में तीव्र, जैव रासायनिक विनियमन के एकमात्र व्यवहार्य तंत्र का प्रतिनिधित्व करते हैं।

यांत्रिक बल मुख्य बाह्य संकेत प्रतीत होते हैं जो आरबीसी के भीतर जैव रासायनिक मार्गों के सक्रियण या मॉड्यूलेशन का कारण बनते हैं। आरबीसी झिल्ली6 में मेकेनोसेंसेटिव प्रोटीन, पीज़ो 1 की खोज नेइन कोशिकाओं में यांत्रिक रूप से सक्रिय सिग्नलिंग की जांच करने वाले अनुसंधान की कई पंक्तियों को प्रेरित किया। उदाहरण के लिए, हाल की प्रगति से पता चला है कि आरबीसी के भौतिक गुणों को प्रोटीन8 के तीव्र और गतिशील परिवर्तनों द्वारा सक्रिय रूप से विनियमित किया जाता है, जिसमें पोस्ट-ट्रांसलेशनल फॉस्फोराइलेशन और सर्वव्यापी9 शामिल हैं। चूंकि ये सामान्य संशोधन कुछ बीमारियों 9,10,11 में भिन्न होते हैं, इसलिए आरबीसी प्रोटीन की सक्रियण स्थिति को निर्धारित करने के लिए वैज्ञानिक और नैदानिक रुचि प्रतीत होती है, विशेष रूप से मेकेनोबायोलॉजिकल प्रक्रियाओं के संबंध में।

आरबीसी प्रोटीन सक्रियण राज्यों में तीव्र परिवर्तनों का निर्धारण कुछ पद्धतिगत चुनौतियां पैदा करता है। उदाहरण के लिए, बाद के विश्लेषण के लिए आरबीसी नमूनों के भंडारण के लिए संशोधित आरबीसी प्रोटीन के संरक्षण की आवश्यकता होती है, क्योंकि पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन गैर-टिकाऊ होते हैं। इसके अलावा, क्लासिक प्रोटीन-डिटेक्शन विधियों (जैसे, पश्चिमी सोख्ता) हीमोग्लोबिन के सापेक्ष प्रोटीन की कम प्रचुरता के कारण आरबीसी में मानकीकृत करना मुश्किल है, जोइन कोशिकाओं में प्रोटीन सामग्री का ~ 98% है। इस प्रकार, रासायनिक रूप से संरक्षित आरबीसी का एंटीबॉडी-आधारित धुंधलापन महत्वपूर्ण आरबीसी प्रोटीन के तीव्र संशोधनों की जांच करते समय पसंद की विधि रही है, जैसे कि नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेज़ (आरबीसी-एनओएस) 13,14 के आरबीसी-विशिष्ट आइसोफॉर्म। आरबीसी-एनओएस को एंजाइमेटिक रूप से नाइट्रिक ऑक्साइड (एनओ) का उत्पादन करने के लिए दिखाया गया है, जो आरबीसी विकृति15,16,17 सहित आवश्यक आरबीसी गुणों के लिए अपरिहार्य लगता है। आरबीसी-एनओएस के पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधन उत्प्रेरक एंजाइम गतिविधि को नियंत्रित करते हैं, जिसमें एंजाइम गतिविधि को बढ़ाने के लिए सेरीन 1177 अवशेषों के फॉस्फोराइलेशन का वर्णन किया जाता है, जबकि अवशेषों सेरीन 114 या थ्रेओनिन 495 के फॉस्फोराइलेशन को आरबीसी-एनओएस गतिविधि18,19 में कमी के साथ जोड़ा गया है।

सामूहिक रूप से, आरबीसी प्रोटीन के अस्थायी संशोधन महत्वपूर्ण सेलुलर फ़ंक्शन में योगदान करते हैं, और मानकीकृत प्रोटोकॉल जो इन संशोधित प्रोटीनों का पता लगाने में सक्षम होते हैं, उच्च मूल्य के होते हैं। यहां, हम दो अलग-अलग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो आरबीसी-एनओएस प्रोटीन सक्रियण का पता लगाने की सुविधा के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी का फायदा उठाते हैं, और डेटा विश्लेषण और व्याख्या के लिए सिफारिशों पर चर्चा करते हैं।

वर्णित प्रोटोकॉल के प्रदर्शन का मूल्यांकन मानव वाहिका (5 पीए) के भीतर होने वाले यांत्रिक बलों के जवाब में सेरीन 1177 अवशेषों पर आरबीसी-एनओएस के फॉस्फोराइलेशन में अच्छी तरह से रिपोर्ट की गई वृद्धि को मापकर किया गया था।

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Protocol

यहां वर्णित प्रोटोकॉल हेलसिंकी की घोषणा के साथ संरेखण में हैं और जर्मन स्पोर्ट्स यूनिवर्सिटी कोलोन (9/16/2013) और ग्रिफिथ विश्वविद्यालय (2019/808) की नैतिकता समितियों द्वारा अनुमोदित किए गए थे। स्वयंसेवकों को प्रासंगिक विकृति की अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए जांच की गई और लिखित सूचित सहमति प्रदान की गई।

1. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल का उपयोग करके आरबीसी प्रोटीन का धुंधला होना।

नोट: आवश्यक रसायनों और सामग्रियों की एक विस्तृत सूची सामग्री की तालिका में प्रदान की जाती है। निम्नलिखित अनुभाग आवश्यक समाधानों की तैयारी का वर्णन करते हैं, इसके बाद इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री प्रोटोकॉल (चित्रा 1) का विस्तृत विवरण है।

Figure 1
चित्रा 1: फॉस्फोराइलेशन साइट 1177 पर आरबीसी-एनओएस के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस स्टेनिंग के लिए आवश्यक व्यक्तिगत चरणों का योजनाबद्ध। प्रस्तुत प्रोटोकॉल का एक विशिष्ट वर्कफ़्लो समाधान तैयारी और रक्त के नमूने से लेकर एंटीबॉडी-आधारित पहचान और विज़ुअलाइज़ेशन तक फैला हुआ है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

  1. रक्त के नमूने का संग्रह
    1. सात स्वस्थ पुरुषों से रक्त के नमूने (पूरे रक्त का 10 मिलीलीटर) प्राप्त करें। स्वयंसेवक स्वस्थ व्यक्ति थे जो कथित तौर पर कार्डियोवैस्कुलर, हेमेटोलॉजिकल, न्यूरोलॉजिकल, अंतःस्रावी या चयापचय रोगों से मुक्त थे। स्वयंसेवक धूम्रपान न करने वाले भी थे।
    2. अग्रभाग के एंटीक्यूबिटल क्षेत्र में एक प्रमुख नस से एक बाँझ सुई और सिरिंज का उपयोग करके रक्त एकत्र करें, और तुरंत निम्नलिखित एंटीकोआगुलंट्स में से एक के साथ लेपित ट्यूबों में स्थानांतरित करें: सोडियम हेपरिन (इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री के लिए) या एथिलीनडायमाइनटेट्राएसेटिक एसिड (ईडीटीए; फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए)।
    3. 7,20 से पहले वर्णित एक कॉएट-प्रकार की कतरन प्रणाली का उपयोग करके एंटीकोगुलेटेड रक्त के नमूनों को सटीक रूप से नियंत्रित यांत्रिक बलों में उजागर करें।
      1. कतरनी तंत्र में एक घूर्णन कप और एक स्थिर बॉब शामिल है, जिसे 300 μm अंतर से अलग किया गया है। रक्त के नमूने को अंतराल में स्थानांतरित करें, जो कप के सटीक नियंत्रणीय घूर्णी वेग को नमूने पर अच्छी तरह से नियंत्रित यांत्रिक बलों को लागू करने का कारण बनता है। यहां प्रस्तुत प्रतिनिधि डेटा विस्तारित अवधि (300 सेकंड) के लिए मानव वाहिका (5 पीए) के भीतर होने वाले यांत्रिक बलों को लागू करके उत्पादित किया गया था।
  2. इम्यूनोस्टेनिंग के लिए आवश्यक समाधान ों की तैयारी
    1. तालिका 1 के अनुसार समाधान तैयार करें। इम्यूनोस्टेनिंग प्रक्रिया करने से पहले समाधान तैयार किए जा सकते हैं और आवश्यकता होने तक दिए गए तापमान पर संग्रहीत किए जा सकते हैं।
      नोट: भंडारण अवधि रसायनों के बीच भिन्न हो सकती है। सामग्री सुरक्षा डेटा पत्रक की जाँच करें।
  3. नमूना तैयार करना
    1. वापसी या प्रयोगात्मक उपचार के तुरंत बाद पूरे रक्त को संसाधित करें (जहां लागू हो; उदाहरण के लिए, हमारे नमूनों में यांत्रिक उत्तेजना; चरण 1.1.3 देखें) अल्पकालिक प्रभावों का पता लगाने में सक्षम होने के लिए, उदाहरण के लिए कतरनी तनाव आवेदन, व्यायाम, अल्पकालिक हाइपोक्सिया जोखिम आदि के बाद।
    2. फॉर्मलाडेहाइड का उपयोग करके आरबीसी प्रोटीन निर्धारण निम्नानुसार करें: कमरे के तापमान (आरटी) पर 20 मिनट के लिए 4% पैराफॉर्मलडिहाइड समाधान में 1: 2 के अनुपात में पूरे रक्त को पतला करें। आरटी पर 3 मिनट के लिए 132 x g पर नमूने को सेंट्रीफ्यूज करें और पाइपिंग द्वारा सतह पर तैरनेवाले को सावधानीपूर्वक हटा दें।
    3. आरबीसी गोली को 0.1 मोल/एल फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (पीबीएस) (1:3 तनुकरण) के दो खंडों में फिर से निलंबित करें और आरटी पर 5 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। ऊपर वर्णित सेंट्रीफ्यूजेशन को दोहराएं और सुपरनैटेंट को हटा दें, जो स्पष्ट होना चाहिए। आरबीसी गोली को 0.1 मोल / एल पीबीएस (1: 2 कमजोर पड़ने) की एक मात्रा में फिर से निलंबित करें।
    4. रक्त स्मीयर निम्नानुसार तैयार करें: अल्कोहल प्रतिरोधी पेन (जैसे, पेंसिल) का उपयोग करके नमूना आईडी, एंटीबॉडी लागू आदि के साथ एक माइक्रोस्कोप स्लाइड लेबल करें। फिर, लेबल फ़ील्ड के ठीक ऊपर तैयार आरबीसी समाधान के 10 μL जोड़ें।
    5. लगभग 45 ° के कोण पर नमूने पर एक दूसरी स्लाइड रखें और स्लाइड के साथ नमूने को समान रूप से फैलाएं। 5-7 सेकंड के लिए निरंतर आंदोलन के साथ बर्नर पर नमूने को घुमाकर बन्सन बर्नर पर स्लाइड को हीट-फिक्स करें।
      नोट: गर्मी ठीक करने से पहले नमूने को हवा से सुखाने की सिफारिश की जाती है। नमूने को धुंधला होने तक आरटी में संग्रहीत किया जा सकता है (चित्रा 2)।
  4. इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री धुंधला हो जाता है।
    1. प्रत्येक स्लाइड पर दो क्षेत्रों को चिह्नित करें: एक परीक्षण क्षेत्र जिसमें आरबीसी को संबंधित प्राथमिक और द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ इनक्यूबेट किया जाता है, और एक नियंत्रण क्षेत्र जिसमें प्राथमिक एंटीबॉडी को एक नियंत्रण समाधान द्वारा प्रतिस्थापित किया जाता है। यह क्षेत्र आरबीसी के पृष्ठभूमि संकेत को निर्धारित करने के लिए परख नियंत्रण के भीतर कार्य करता है।
    2. तालिका 2 के अनुसार, प्रक्रिया से पहले या उसके दौरान समाधान तैयार करें। प्रति परीक्षण क्षेत्र 300 μL की मात्रा और प्रति नियंत्रण क्षेत्र 200 μL की आवश्यकता होती है।
      नोट: यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि ये एंटीबॉडी-आधारित धुंधला प्रक्रियाएं मात्रात्मक, डेटा के बजाय अर्ध-मात्रात्मक उत्पन्न करती हैं। इस प्रकार, यह सुनिश्चित करने के लिए कि उत्पादित डेटा से सार्थक निष्कर्ष निकाले जा सकते हैं, उचित नियंत्रण नमूने (यानी, प्रोटीन सक्रियण में मूल्यांकन किए गए सापेक्ष परिवर्तनों के लिए एक संदर्भ बिंदु प्रदान करने के लिए) बिल्कुल आवश्यक हैं।
    3. ट्रिप्सिन पाचन के लिए, 0.1% ट्रिप्सिन को पिघलाएं और आरटी के बराबर करें। ग्रीस पेंसिल का उपयोग करके प्रत्येक स्लाइड पर दो क्षेत्रों को चिह्नित करें: एक परीक्षण क्षेत्र (स्लाइड का 2/3) और एक नियंत्रण क्षेत्र (स्लाइड का 1/3)। नमूना क्षेत्रों को धोने के लिए ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके ट्राइस-बफर्ड सेलाइन (टीबीएस) को ध्यान से लागू करें। टीबीएस को 30 सेकंड तक बैठने दें और फिर इसे डालें। धोने के चरण को दोहराएं।
      नोट: नियंत्रण और परीक्षण क्षेत्र दोनों में निम्न समाधान जोड़ें, जब तक कि अन्यथा वर्णित न हो। क्षेत्रों को संबंधित समाधान के साथ पर्याप्त रूप से कवर करने की आवश्यकता है। डिस्पोजेबल ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके समाधान लागू करें, और प्रत्येक समाधान के बाद पिपेट स्विच करें।
    4. 0.1% ट्रिप्सिन जोड़ें, ढक्कन या एल्यूमीनियम पन्नी के साथ एक उद्देश्य-निर्मित इनक्यूबेशन कक्ष का उपयोग करके स्लाइड को कवर करें, और इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, नल का पानी जोड़कर एंजाइम प्रतिक्रिया को रोकें। घोल को डालें। ऊपर वर्णित के रूप में टीबीएस के साथ दोनों क्षेत्रों को 3x धोएं।
    5. पेरोक्सीडेज सक्रियण को अवरुद्ध करने के लिए, मेथनॉल समाधान जोड़ें और आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। घोल को डालें।
      नोट: इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन (खंड 2) के लिए, इस कदम को छोड़ा जा सकता है, यह देखते हुए कि अंतर्जात पेरोक्सीडेज का अवरोध हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) और 3,3'-डायमिनोबेंज़िडीन हाइड्रेट (डीएबी) के साथ पता लगाने के कारण कृत्रिम संकेत को रोकने के लिए कार्य करता है।
    6. चरण 1.4.3 में वर्णित के रूप में टीबीएस के साथ दोनों क्षेत्रों को 3x धोएं। 3% स्किम दूध का घोल जोड़ें और ब्लॉक करने के लिए आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। घोल को डालें। बाद में न धोएं।
    7. केवल परीक्षण क्षेत्र में प्राथमिक एंटीबॉडी (एबी) जोड़ें। नियंत्रण क्षेत्र में AB नियंत्रण समाधान ( तालिका 2 देखें) जोड़ें. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर नमूने इनक्यूबेट करें। सुखाने से बचाने के लिए उस समय के दौरान स्लाइड को कवर करें।
      नोट: परीक्षण से नियंत्रण क्षेत्र में समाधान ों को स्थानांतरित करने से बचें, क्योंकि यह नियंत्रण मूल्यों को प्रभावित करेगा।
    8. एंटीबॉडी घोल डालें। चरण 1.4.3 में वर्णित के रूप में टीबीएस के साथ दोनों क्षेत्रों को 3x धोएं।
    9. विशिष्ट बाइंडिंग को रोकने के लिए अवरोधन चरण निष्पादित करें. 3% सामान्य बकरी सीरम जोड़ें और आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
    10. द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान जोड़ें और आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। चरण 1.4.3 में वर्णित के रूप में टीबीएस के साथ 3x क्षेत्रों को धोएं।
  5. धुंधलापन और आवरण का विकास
    1. पतला एविडिन-पेरोक्सीडेज घोल जोड़कर और आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करके एविडिन-युग्मित एचआरपी प्रतिक्रिया ( तालिका 2 में कमजोर पड़ने देखें) करें।
    2. तालिका 3 के अनुसार, उपयोग से पहले इम्यूनोस्टेनिंग विकसित करने के लिए डीएबी मिश्रण तैयार करें।
      चेतावनी: डीएबी खतरनाक है। खतरे के बयानों पर विचार करें H341 (आनुवंशिक दोष पैदा करने का संदेह) और H350 (कैंसर का कारण बन सकता है)। निम्नलिखित एहतियाती कथनों पर विचार करें: P201, P202, P280, P308 + P313, P405, और P501।
    3. डीएबी नियंत्रण धुंधला निम्नानुसार करें: एक स्लाइड से चरण 1.5.1 से एचआरपी समाधान एकत्र करें और धुंधला होने से पहले एक अलग सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में तैयार डीएबी समाधान की एक छोटी मात्रा (जैसे, 1 एमएल) के साथ मिलाएं। मिश्रण को भूरा / ग्रे रंग विकसित करना चाहिए।
    4. स्लाइड ्स को माइक्रोस्कोप (कम से कम 200x का आवर्धन) के तहत रखें और दोनों क्षेत्रों में डीएबी समाधान जोड़ें। आरबीसी के धुंधलापन की लगातार निगरानी करें और पृष्ठभूमि के रंग शुरू होने से पहले एक डिस्पोजेबल पिपेट के साथ डीएबी समाधान को हटाकर धुंधलापन को रोकें। आरबीसी-एनओएस सेरीन 1177 धुंधला होने के लिए, डीएबी इनक्यूबेशन समय लगभग 17 मिनट है।
    5. नमूना निर्जलीकरण करें। स्लाइड्स को एक ग्लास रैक में रखें और विभिन्न तनुकरण के इथेनॉल समाधानों में 5 सेकंड के लिए डुबोएं, 70% से शुरू होकर, इसके बाद 96%, और फिर 100%, और अंत में जाइलोल में। रैक से स्लाइड निकालें और अतिरिक्त तरल को अवशोषित करने के लिए शीर्ष पर आरबीसी के साथ एक ऊतक पर रखें।
    6. स्लाइड के दौरान माउंटिंग माध्यम की दो या तीन बूंदें जोड़ें। कवरस्लिप का उपयोग करके स्लाइड को कवर करें। हवा के बुलबुले को शामिल करने से बचें, क्योंकि यह सूक्ष्म मूल्यांकन में बाधा डालता है। नमूने को फ्यूम हुड में कम से कम रात भर सुखाएं।
  6. सूक्ष्म मूल्यांकन करना
    1. विज़ुअलाइज़ेशन और इमेजिंग के लिए, स्लाइड्स को कम से कम 200x के आवर्धन के साथ एक संचारित-प्रकाश माइक्रोस्कोप में रखें। सुनिश्चित करें कि माइक्रोस्कोप को दाग वाले आरबीसी की तस्वीरें लेने के लिए एक कैमरे के साथ जोड़ा गया है।
    2. माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोत चालू करें। माइक्रोस्कोप-संलग्न कैमरा चालू करें और माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर शुरू करें। मोटे और ठीक फोकस समायोजन नॉब्स को चालू करके और फोकस के स्तर को खोजने के लिए उचित फोकस निर्धारित करने के लिए ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें जहां आरबीसी दिखाई दे रहे हैं।
    3. चित्रों के पृष्ठभूमि मानों को स्लाइड के तीन सेल-मुक्त क्षेत्रों पर मापा गया 220 ± 5 ग्रे मानों पर सेट करें। ऐसा करने के लिए, स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर ImageJ का उपयोग करके पहली तस्वीर खोलें। पैनल सेट माप का उपयोग करके विकल्प माध्य ग्रे मान का चयन करें। माप आदेश का उपयोग करके ग्रे मान को मापने के लिए अंडाकार आइकन का उपयोग करें। यदि मापा मान सीमा से बाहर हैं, तो तदनुसार माइक्रोस्कोप पर पृष्ठभूमि प्रकाश को समायोजित करें। इन चरणों को तब तक दोहराएँ जब तक कि पृष्ठभूमि मान सही न हों.
      नोट: ये पृष्ठभूमि मान ली गई सभी छवियों के लिए दी गई सीमा के भीतर होना चाहिए। अन्यथा, डेटा तुलनीय नहीं हैं।
    4. आरबीसी ग्रे मान के विश्लेषण के लिए, इमेजजे सॉफ्टवेयर के भीतर ओवल चयन उपकरण का उपयोग करके प्रत्येक आरबीसी के किनारे को चिह्नित करें। माप आदेश का उपयोग करके अलग-अलग आरबीसी के ग्रे मान निर्धारित करें । परीक्षण से न्यूनतम 50 आरबीसी और नियंत्रण क्षेत्र से न्यूनतम 10 आरबीसी के ग्रे मूल्यों को मापें।
      नोट: विश्लेषण किए गए आरबीसी की कुल संख्या को व्यक्तिगत रूप से समायोजित किया जा सकता है। जितना अधिक आरबीसी का विश्लेषण किया जाता है, परिणाम उतना ही सार्थक होता है। हालांकि, विश्लेषण किए गए आरबीसी की कुल संख्या किसी दिए गए प्रयोग के भीतर प्रत्येक स्थिति, विषय आदि के लिए तुलनीय होनी चाहिए।
      1. ग्रीस पेंसिल के पास आरबीसी के विश्लेषण से बचें, क्योंकि इस क्षेत्र में धुंधलापन अधूरा हो सकता है। अतिव्यापी आरबीसी के विश्लेषण से बचें, क्योंकि यह धुंधला तीव्रता को प्रभावित करता है। केवल उन RBCs का उपयोग करें जो अन्य RBCs से अलग हैं। 50/10 RBCs के मूल्यांकन के लिए परीक्षण से कम से कम पांच छवियों और नियंत्रण क्षेत्र से कम से कम दो छवियों का विश्लेषण करें। अंतिम विश्लेषण में हर चित्र से RBCs शामिल करें।
    5. धुंधला तीव्रता की गणना करने के लिए, अंतिम संकेतों की गणना करें:
      (व्यक्तिगत परीक्षण क्षेत्र आरबीसी - औसत परीक्षण क्षेत्र पृष्ठभूमि) - (व्यक्तिगत नियंत्रण क्षेत्र आरबीसी - औसत नियंत्रण क्षेत्र पृष्ठभूमि)

Figure 2
चित्रा 2: फिक्सेटिव प्रक्रिया और रक्त स्मीयर उत्पादन का चित्रण। (BioRender.com के साथ बनाई गई योजना) पतला रक्त के नमूनों को रासायनिक रूप से पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया जाता है, फिर सेंट्रीफ्यूज किया जाता है और फॉस्फेट-बफर ्ड खारा के साथ धोया जाता है। अंत में, पुन: निलंबित रक्त को एक ग्लास स्लाइड पर लगाया जाता है और बनसेन बर्नर लौ पर मंडराने के माध्यम से थर्मल रूप से तय किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

तालिका 1: इम्यूनोहिस्टोकेमिकल धुंधला होने के लिए आवश्यक समाधानों के लिए तैयारी और भंडारण की स्थिति। प्रोटोकॉल से पहले समाधान तैयार किया जा सकता है। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 2: तत्काल उपयोग के लिए एंटीबॉडी समाधान का विवरण। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

तालिका 3: तत्काल उपयोग के लिए डीएबी समाधान तैयार करने के लिए घटक और प्रोटोकॉल। कृपया इस तालिका को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें।

2. आरबीसी प्रोटीन का फ्लोरोसेंट लेबलिंग

नोट: निम्नलिखित खंड इम्यूनोहिस्टोकेमिकल प्रोटोकॉल के अनुकूलन को रेखांकित करता है, जिसे फ्लोरोसेंट संयुग्म (चित्रा 1) के साथ एंटीबॉडी के उपयोग को सक्षम करने के उद्देश्य से विकसित किया गया है।

इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के लिए रक्त नमूना तैयारी खंड 1 में वर्णित के समान है, इसलिए निम्नलिखित खंड नमूनों के धुंधला होने से शुरू होता है।

  1. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला होना।
    1. द्वितीयक, फ्लोरोसेंट संयुग्मित एंटीबॉडी (मात्रा के लिए, चरण 1.4.2 देखें) के साथ प्रकाश से संरक्षित आरटी पर 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें, या तो उद्देश्य-निर्मित इनक्यूबेशन कक्ष या एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके।
    2. द्वितीयक एंटीबॉडी घोल डालें और टीबीएस के साथ नमूने 3x धो लें। नमूनों को सूखने से बचाने के लिए उन पर अंतिम धो छोड़ दें।
    3. टीबीएस को डालें और लंबे समय तक प्रकाश के संपर्क को रोकने के लिए नमूना रैक से नमूने निकालें। नमूनों को निर्जलित करने के लिए, स्लाइड को ~ 5 एस के लिए अलग-अलग इथेनॉल समाधानों में उजागर करें, 70% से शुरू होकर, इसके बाद 90%, और अंत में 100%। स्लाइड्स को 5 सेकंड के लिए जाइलोल/जाइलीन घोल में उजागर करें।
    4. माउंटिंग माध्यम की दो या तीन बूंदों के साथ एक कवरस्लिप तैयार करें और फिर कवरस्लिप के साथ स्लाइड माउंट करें। चिमटी या एक समान, बाँझ धातु उपकरण के साथ हल्के दबाव को लागू करके माउंटिंग माध्यम का वितरण सुनिश्चित करें। हवा के बुलबुले को खत्म करें, जो अन्यथा इमेजिंग में हस्तक्षेप कर सकता है, एक ही उपकरण के साथ। नमूने को अंधेरे और सूखे स्थान में रात भर सूखने के लिए छोड़ दें।
  2. सूक्ष्म मूल्यांकन।
    1. विज़ुअलाइज़ेशन और इमेजिंग के लिए, स्लाइड को माइक्रोस्कोप चरण पर कम से कम 400x के कुल आवर्धन के साथ रखें। माइक्रोस्कोप प्रकाश स्रोत और फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत को चालू करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि फ्लोरोसेंट प्रकाश स्रोत अधिकतम तीव्रता में समायोजित है।
    2. माइक्रोस्कोप-संलग्न कैमरा चालू करें और माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर शुरू करें। मोटे और ठीक फोकस समायोजन नॉब्स को चालू करके उचित फ़ोकस निर्धारित करने के लिए ब्राइटफील्ड माइक्रोस्कोपी का उपयोग करें, और फोकस के स्तर को ढूंढें जहां आरबीसी दिखाई दे रहे हैं।
      नोट: प्रकाश के अत्यधिक संपर्क में फ्लोरोसेंट संयुग्म के फोटोब्लीचिंग का कारण बन सकता है। इस उद्देश्य के लिए पिछले प्रयोग से एक स्लाइड का उपयोग किया जा सकता है, ताकि उन स्लाइडों के प्रकाश जोखिम को कम किया जा सके जिनका विश्लेषण किया जाना बाकी है।
    3. नियंत्रण क्षेत्र में आरबीसी का निरीक्षण करके इष्टतम लेजर तीव्रता निर्धारित करें। सुनिश्चित करें कि तीव्रता इतनी अधिक है कि आरबीसी दिखाई दे रहे हैं, जबकि एक बड़े पृष्ठभूमि संकेत का उत्पादन नहीं कर रहे हैं। तुलनात्मकता सुनिश्चित करने के लिए क्षेत्रों और नमूनों के बीच तीव्रता और जोखिम समय को सुसंगत रखें।
    4. स्लाइड के परीक्षण क्षेत्र के कम से कम तीन अलग-अलग क्षेत्रों में ब्राइटफील्ड और फ्लोरोसेंट छवियों को कैप्चर करें, यादृच्छिक रूप से चुने गए। किसी क्षेत्र का चयन करने के लिए, माइक्रोस्कोप चरण नियंत्रण का उपयोग करके लिपिड पेन द्वारा चिह्नित स्लाइड के किनारों से दूर पैन करें। एक ऐसे क्षेत्र का चयन करें जो एक विलक्षण आरबीसी परत के समान वितरण को प्रदर्शित करता है।
    5. फ्लोरोसेंट छवियों के लिए एक्सपोजर समय 1 सेकंड सेट करें और माइक्रोस्कोप नियंत्रण सॉफ्टवेयर के सॉफ्टवेयर नियंत्रण का उपयोग करके एक छवि कैप्चर करें। ब्राइटफील्ड मोड पर स्विच करें, एक्सपोज़र टाइम को 'ऑटो' पर सेट करें, और संबंधित ब्राइटफील्ड छवि कैप्चर करें।
    6. चरण 2.2.3 को दोहराकर स्लाइड के नियंत्रण क्षेत्र के कम से कम दो अलग-अलग यादृच्छिक रूप से चयनित क्षेत्रों में ब्राइटफील्ड और फ्लोरोसेंट छवियों को कैप्चर करें।
    7. पिक्सेल के मूल ग्रे मानों को संरक्षित करने, संपीड़न को रोकने और अधिग्रहण के मेटाडेटा को ले जाने के लिए छवियों को .tif प्रारूप में सहेजें।
    8. कैप्चर किए गए RBCs के ग्रे मानों को मापें। Open ImageJ (या FIJI21; पूरक फ़ाइल 1 देखें)। अलग-अलग आरबीसी के ग्रे मान निर्धारित करें। इसके लिए, प्रत्येक व्यक्तिगत सेल को ओवल चयन उपकरण के साथ चिह्नित करें, और माप कमांड का उपयोग करके विश्लेषण करें ।
      नोट: आरबीसी का विश्लेषण नहीं किया जाना चाहिए यदि वे अन्य कोशिकाओं के साथ ओवरलैप करते हैं, क्योंकि इससे परिणामी संकेत बढ़ सकता है।
    9. आरबीसी से मुक्त तीन और पांच क्षेत्रों के बीच हाइलाइट करें और पृष्ठभूमि संकेत का माप प्रदान करने के लिए ग्रे मान निर्धारित करें। प्रत्येक परीक्षण क्षेत्र के लिए कम से कम तीन अलग-अलग छवियों से कम से कम 150 आरबीसी का विश्लेषण करें, और प्रत्येक नियंत्रण क्षेत्र के लिए कम से कम दो अलग-अलग छवियों से कम से कम 50 आरबीसी।
      नोट: परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए अधिक कोशिकाओं / क्षेत्रों के विश्लेषण की सलाह दी जा सकती है। यह देखते हुए कि आरबीसी आबादी स्वाभाविक रूप से विषम है, सिग्नल में सेल-सेल परिवर्तनशीलता महत्वपूर्ण हो सकती है, जो रुचि के प्रोटीन पर निर्भर करती है।
    10. मैक्रो कमांड का उपयोग करके कैप्चर की गई छवियों का वैकल्पिक डेटा विश्लेषण करें। किसी दिए गए छवि के स्वचालित चयन, पृष्ठभूमि सुधार और ग्रे मूल्य विश्लेषण के लिए इमेजजे की फिजी रिलीज के माध्यम से एक मैक्रो कमांड बनाएं / इंस्टॉल करें।
      नोट: यह दिनचर्या मूल छवि की एक प्रति का उपयोग करके किसी दिए गए छवि में मौजूद कोशिकाओं का पता लगाने के लिए स्वचालित थ्रेशोल्डिंग का उपयोग करती है, जिससे फ्लोरोसेंट आरबीसी के ग्रे मूल्यों को निकालने के लिए मूल छवि पर लगाए गए ओवरले का उत्पादन होता है। मैक्रो पूरक कोडिंग फ़ाइल 1 के रूप में एक .ijm फ़ाइल के रूप में जमा किया जाता है।
    11. फिजी में विश्लेषण के लिए तैयार .tif प्रारूप में छवि फ़ाइल खोलें। RBC प्रतिदीप्ति.ijm (पूरक कोडिंग फ़ाइल 1) मैक्रो खोलें और चलाएँक्लिक करें।
      नोट: मैक्रो 600x आवर्धन और एक बड़े सिग्नल-टू-शोर अनुपात के साथ प्राप्त छवियों के लिए सेट किया गया है। अन्वेषक द्वारा कोशिकाओं के स्वचालित चयन की समीक्षा की जानी चाहिए।
  3. अंतिम संकेतों की गणना इस प्रकार करें:
    (परीक्षण क्षेत्र आरबीसी - परीक्षण क्षेत्र पृष्ठभूमि) - (नियंत्रण क्षेत्र आरबीसी - नियंत्रण क्षेत्र पृष्ठभूमि) मैनुअल विश्लेषण के लिए;
    स्वचालित विश्लेषण के लिए (परीक्षण क्षेत्र - नियंत्रण क्षेत्र)।

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Representative Results

प्रस्तुत प्रोटोकॉल, उन तरीकों का वर्णन करता है जो आरबीसी प्रोटीन में तीव्र परिवर्तनों का पता लगाने की सुविधा प्रदान करते हैं, एक प्रसिद्ध यांत्रिक रूप से संवेदनशील प्रोटीन परिवर्तन पर परीक्षण किया गया था: सेरीन 1177 अवशेषों में आरबीसी-एनओएस का फॉस्फोराइलेशन। पूरे रक्त को स्वस्थ स्वयंसेवकों से प्राप्त किया गया था और बाद में दो अलग-अलग एलिकोट में विभाजित किया गया था। एक दिए गए रक्त के नमूने को 300 सेकंड के लिए शारीरिक परिमाण (5 पीए) के यांत्रिक कतरनी तनाव के संपर्क में लाया गया था, जिसे पहले सेरीन 117714 पर आरबीसी-एनओएस फॉस्फोराइलेशन प्राप्त करने के लिए दिखाया गया था। यांत्रिक कतरनी एक्सपोजर की समाप्ति के तुरंत बाद, रक्त का नमूना पैराफॉर्मलडिहाइड में तय किया गया था। नियंत्रण के रूप में, एक रक्त का नमूना उजागर किया गया था, कतरनी उपकरण में लोड किया गया था, और पैराफॉर्मलडिहाइड में निर्धारण से पहले 300 सेकंड के लिए आराम करने के लिए छोड़ दिया गया था। आरबीसी-एनओएस के खिलाफ लक्षित एंटीबॉडी के संकेत को आराम से सेरीन 1177 अवशेषों पर फॉस्फोराइलेटेड किया गया और यांत्रिक बल जोखिम के जवाब में इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री (चित्रा 3 ए, बी) और इम्यूनोफ्लोरेसेंस (चित्रा 3 सी, डी) दोनों का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया। कतरनी और गैर-कतरनी नमूने सांख्यिकीय रूप से काफी अलग संकेत ों का उत्पादन करते हैं [फ्रीडमैन परीक्षण:2(3) = 18.71, पी = 0.0003]। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल या इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल (चित्रा 3 ई) के साथ मूल्यांकन किए जाने पर संबंधित अनशीयर ्ड कोशिकाओं (पी < 0.01 दोनों) की तुलना में आरबीसी के यांत्रिक बल जोखिम के जवाब में आरबीसी 1177 अवशेषों पर आरबीसी-एनओएस फॉस्फोराइलेटेड के खिलाफ लक्षित एंटीबॉडी के संकेत में तुलनीय, लगभग तीन गुना वृद्धि का पता लगाया गया था।

इस प्रकार, दोनों विधियों के साथ प्राप्त परिणामों की तुलना प्रस्तुत प्रोटोकॉल के बीच उत्कृष्ट समझौते को इंगित करती है, जिसने यांत्रिक उत्तेजना के जवाब में आरबीसी-एनओएस फॉस्फोराइलेशन में सफलतापूर्वक और मज़बूती से वृद्धि का भी पता लगाया।

Figure 3
चित्रा 3: यांत्रिक कतरनी के बाद आरबीसी-एनओएस सेरीन 1177 फॉस्फोराइलेशन के इम्यूनोहिस्टोकेमिकल (ए, बी) और इम्यूनोफ्लोरोसेंट (सी, डी) धुंधला होने से प्रतिनिधि पूल किए गए डेटा। इन नमूनों से सिग्नल तीव्रता का विश्लेषण (ई) में प्रस्तुत किया गया है, जहां सफेद सलाखों एचआरपी धुंधला होने का उपयोग करके प्राप्त डेटा को दर्शाते हैं, और काली सलाखों फ्लोरोसेंट विधि का उपयोग करके प्राप्त डेटा का प्रतिनिधित्व करती हैं। रक्त या तो आराम पर या यांत्रिक बल (यानी, कतरनी) के संपर्क में आने के तुरंत बाद तैयार किया गया था। एन = 7 रक्त के नमूने अलग-अलग दाताओं से प्राप्त किए गए थे। माध्य ± मानक त्रुटि के रूप में दिखाया गया डेटा. ** पी < 0.01, एक गैर-पैरामीट्रिक फ्रीडमैन परीक्षण का उपयोग करके निर्धारित। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: इम्यूनोफ्लोरोसेंट लाल रक्त कोशिकाओं की छवियों के लिए चरण-दर-चरण एनोटेशन के साथ स्वचालित अर्ध-मात्रात्मक छवि विश्लेषण कच्चा कोड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक कोडिंग फ़ाइल 1: इम्यूनोफ्लोरोसेंट लाल रक्त कोशिकाओं के स्वचालित छवि विश्लेषण को चलाने के लिए फिजी / इमेजजे-सॉफ्टवेयर के साथ संगत संकलित कोड। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

हाल के साहित्य से पता चलता है कि आरबीसी-एनओएस प्रोटीन आरबीसी विकृति15,22,23 के विनियमन के लिए महत्वपूर्ण महत्व का है, जो बदले में संकीर्ण केशिकाओं 24 के माध्यम से उनके पारित होने की सुविधा प्रदान करता है। प्रोटीन गतिविधि अत्यधिक पोस्ट-ट्रांसलेशनल प्रोटीन संशोधनों पर निर्भर करती है, विशेष रूप से कुछ अवशेषों के फॉस्फोराइलेशन18। रुचि का ध्यान फॉस्फोराइलेशन साइट 1177 में निहित है, जो आरबीसी-एनओएस प्रोटीन23 के सक्रियण से संबंधित है। इस प्रोटीन के परिवर्तन विभिन्न प्रकार के रोगों 25,26,27,28,29 में दिखाए गए हैं, इस प्रकार, इन परिवर्तनों की जांच न केवल कुछ बीमारियों की समझ के लिए मूल्यवान ज्ञान प्रदान कर सकती है, बल्कि विशिष्ट उपचारों को विकसित करने और मार्गदर्शन करने के लिए भी।

आरबीसी-एनओएस सेरीन 1177 फॉस्फोराइलेशन22 को बढ़ाने के लिए कई उत्तेजनाओं की पहचान की गई है, लेकिन यांत्रिक बल एक प्रमुख बाह्य उत्तेजना प्रतीत होते हैं जो आरबीसी-एनओएस प्रोटीन 13,18,31,32 के सक्रियण या मॉड्यूलेशन का कारण बनता है। हालांकि, आरबीसी-एनओएस गतिविधि के मॉड्यूलेशन अस्थायीहैं; इस प्रकार, कतरनी-निर्भर परिवर्तनों का विश्लेषण / संरक्षण तुरंत किया जाना चाहिए। इम्यूनोहिस्टोकेमिकल, और बाद में इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल, आरबीसी-एनओएस के तीव्र, नियामक संशोधनों के संरक्षण और विश्लेषण की सुविधा के लिए विकसित किए गए थे।

इम्यूनोहिस्टोकेमिकल और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल के माध्यम से प्राप्त यहां प्रस्तुत परिणाम, कतरनी एक्सपोजर के बाद आरबीसी-एनओएस सेरीन 1177 के बढ़े हुए फॉस्फोराइलेशन के बारे में उच्च स्तर का समझौता दिखाते हैं। इस प्रकार, दोनों प्रोटोकॉल आरबीसी प्रोटीन के क्षणिक पोस्ट-ट्रांसलेशनल परिवर्तनों की जांच के लिए उपयुक्त हैं, और संबंधित प्रयोगकर्ता यह तय कर सकते हैं कि वे स्थानीय रूप से उपलब्ध संसाधनों और बुनियादी ढांचे पर विचार करते हुए अपनी संबंधित प्रयोगशाला में किस विधि का उपयोग कर सकते हैं। प्रोटीन को लक्षित करने वाले एंटीबॉडी की व्यापक व्यावसायिक उपलब्धता को देखते हुए, दोनों अपनी मूल स्थिति में या पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों के बाद, वर्तमान परख लक्ष्यों की एक बड़ी श्रृंखला के लिए अनुकूलनीय हैं। इस प्रकार, वे आरबीसी सिग्नलिंग 14,27,34 का आकलन करने के लिए उपयोगी उपकरण प्रस्तुत करते हैं।

प्रक्रिया के दौरान कुछ पहलुओं पर विचार किया जाना चाहिए। उल्लिखित एंटीबॉडी विशेष रूप से आरबीसी में लागू होने के लिए विकसित नहीं किए गए हैं। इसके बजाय, ये विशिष्ट एंडोथेलियल-प्रकार एनओएस (ईएनओएस) एंटीबॉडी हैं। चूंकि ईएनओएस और आरबीसी-एनओएस22,23 के महान होमोलॉजी साझा करते हैं, इसलिए ईएनओएस-विशिष्ट एंटीबॉडी का उपयोग पारंपरिक रूप से आरबीसी-एनओएस सक्रियण की कल्पना करने के लिए किया जाता है। यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि इंड्यूसेबल (आईएनओएस) या न्यूरोनल (एनएनओएस) आइसोफॉर्म के खिलाफ निर्देशित एंटीबॉडी आरबीसी में संकेत ों का उत्पादन नहीं करते हैं, जो समर्थन करते हैं कि आरबीसी-एनओएसईएनओएस 22 के साथ महत्वपूर्ण संरचनात्मक समानता साझा करता है। प्रयोग में किसी भी एंटीबॉडी का उपयोग करने से पहले उचित कमजोर पड़ने का परीक्षण किया जाना चाहिए, क्योंकि आपूर्तिकर्ता-अनुशंसित डेटा को परीक्षण के बिना आरबीसी प्रयोग पर लागू नहीं किया जा सकता है। इसके अलावा, वितरण कंपनियों के एक स्विच को उपयोग से पहले विभिन्न कमजोर पड़ने के अत्यधिक परीक्षण की आवश्यकता होती है। हम नए स्रोत एंटीबॉडी / रसायनों का परीक्षण करते समय एक अत्यधिक प्रणालीगत दृष्टिकोण का पालन करने की सलाह देते हैं; नए घटकों को खुराक-प्रतिक्रिया दृष्टिकोण के साथ परीक्षण किया जाना चाहिए, जहां केवल नए घटक को पेश करने वाले विशिष्ट चरणों को बदल दिया जाना चाहिए। सकारात्मक नियंत्रण (यानी, आरबीसी-एनओएस सक्रियण को उत्तेजित करना) बिना कतरनी वाले रक्त के साथ तुलना करके प्रदान किया जाना चाहिए, जैसा कि यहां प्रस्तुत किया गया है। वैकल्पिक रूप से, 350 पीएम इंसुलिन के साथ आरबीसी-एनओएस फॉस्फोराइलेशन की औषधीय उत्तेजना के परिणामस्वरूप आरबीसी-एनओएस फॉस्फोराइलेशन में वृद्धि हुई है, जैसा कि यांत्रिक बल अनुप्रयोग7 के साथ देखा गया है।

प्रस्तुत पहचान विधियों की सीमाएं उन तरीकों की सामान्य सीमाओं तक फैली हुई हैं जो व्यावसायिक रूप से प्राप्त प्राथमिक एंटीबॉडी (जैसे, पश्चिमी धब्बा) की विशिष्टता पर निर्भर करती हैं। सबसे पहले, रुचि के एंटीजन के लिए लक्षित एक प्राथमिक एंटीबॉडी उपलब्ध होना चाहिए। यदि उपलब्ध हो, तो एंटीबॉडी लक्ष्य के लिए विशिष्ट होना चाहिए, जिसे कार्यात्मक उपायों (यानी, सक्रियकर्ताओं / अवरोधकों के साथ औषधीय उपचार) या पश्चिमी सोख्ता का उपयोग करके पुष्टि की जा सकती है। इसके अलावा, वर्णित विधियों के माध्यम से उत्पादित डेटा की सावधानीपूर्वक व्याख्या की जानी चाहिए। यही है, प्रस्तुत विधियां अर्ध-मात्रात्मक हैं, जो उचित नियंत्रण नमूनों के सापेक्ष प्रोटीन संशोधनों में परिवर्तन पर जानकारी प्रदान करती हैं। यहां प्रस्तुत अर्ध-मात्रात्मक मूल्यांकन हमेशा एंजाइम के सक्रियण को संदर्भित करता है, और एंजाइम गतिविधि के साथ भ्रमित नहीं होना चाहिए। एंजाइम गतिविधि के माप के लिए अलग-अलग परख की आवश्यकता होती है, जैसे कि आर्जिनिन-सिट्रूलाइन परख जो [3 एच] एल-आर्जिनिन से [3एच] सिट्रूलाइन या [14 सी] एल-आर्जिनिन से [14सी] सिट्रूलाइन35,36 के रूपांतरण (एफएमओएल / मिनट) की दर को मापता है। यह सत्यापित करने के लिए कि क्या आरबीसी-एनओएस सक्रियण में वृद्धि भी उच्च एनओ स्तर और / या आरबीसी विकृति मूल्यों में वृद्धि के साथ है, उदाहरण के लिए, एनओ एकाग्रता का अतिरिक्त विश्लेषण किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एनओ के स्रोत के रूप में आरबीसी-एनओएस को एकल करने के लिए, एल-एनआईओ जैसे एनओएस अवरोधकोंको नियोजित किया जाना चाहिए।

यह संक्षेप में बताया जा सकता है कि यहां प्रस्तुत विधियां उत्तेजित नियंत्रण कोशिकाओं के सापेक्ष लागू उत्तेजनाओं के जवाब में आरबीसी-एनओएस सक्रियण में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए अच्छी तरह से विकसित हैं। ये विधियां इस प्रकार यह समझने में योगदान करती हैं कि यांत्रिक तनाव आरबीसी प्रोटीन के कार्यों को कैसे प्रभावित करता है, जो सेलुलर फ़ंक्शन के लिए महत्वपूर्ण हैं, और अंततः काम करने वाले ऊतक और गैस विनिमय के पर्याप्त छिड़काव के लिए महत्वपूर्ण हैं।

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Disclosures

सभी लेखकों ने खुलासा किया है कि हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

एलके एक ऑस्ट्रेलियाई सरकार अनुसंधान प्रशिक्षण कार्यक्रम छात्रवृत्ति के समर्थन को स्वीकार करता है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate Sigma/Merck D5637 DAB
Ammoniumchloride  Merck /Millipore 101145 NH4Cl
Centrifuge 5427 R  Eppendorf 5409000010
Coverslips VWR 631-0147 
di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate  Merck /Millipore 106580 Na2HPO4. 2 H2O
Disposable transfer pipettes VWR 612-6803
Entellan Merck /Millipore 107961 rapid mounting medium for microscopy
Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) Hofmann 642
Glucose-Oxidase Sigma/Merck G2133
Grease pencil  Dako S 2002
Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase Sigma/Merck E-2886 HRP
Hydrochloric acid  Merck /Millipore 109057 HCl
Hydrogen peroxide, 30% Merck /Millipore 107203 H2O2
ImageJ Software Freeware
Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) RR Mechatronics Ektacytometer instrument used for shearing
Methanol Merck /Millipore 106009
Microscope slides VWR 630-1985
Nickel(II)-sulfate Hexahydrate  Sigma/Merck N4882 NiSO4.6H2O
Normal Goat serum Agilent/DAKO X0907 NGS
Paraformaldehyde Merck /Millipore 818715 PFA
Pipettes Eppendorf Reference 2 VWR 613-5836/ 613-5839
Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) Merck/Millipore 07-428-I Primary Antibody
Reaction tubes, 2ml Eppendorf 30120094
Secondary Antibody goat anti rabbit Agilent/DAKO E0432 Secondary Antibody
Skim milk powder Bio-Rad 170-6404
Sodium chloride  Merck /Millipore 106404 NaCl
Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate Merck /Millipore 106346 NaH2PO4.H2O
Sodium hydroxide, 1 M Merck /Millipore 150706 NaOH
Tris(hydroxymethyl)-aminomethane Merck /Millipore 108382 Tris
Trypsin Sigma/Merck T7409
Tween20  Merck /Millipore 822184
Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F Merck /Millipore WHA1825047
Xylol VWR Chemicals 2,89,73,465
ß-D-Glucose monohydrate Merck /Millipore 14431-43-7

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References

  1. Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
  2. Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
  3. Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die? Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
  4. Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
  5. Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
  6. Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
  7. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
  8. Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
  9. Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
  10. Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
  11. Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
  12. Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
  13. Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
  14. Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
  15. Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
  16. Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
  17. Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
  18. Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
  19. Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
  20. Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47 (2021).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
  23. Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
  24. McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
  25. Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
  26. Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
  27. Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
  28. Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
  29. Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
  30. Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
  31. Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
  32. Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
  33. Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
  34. Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
  35. Methods in Nitric Oxide Research. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).
  36. Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).

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जैव रसायन अंक 193 लाल रक्त कोशिकाएं लाल रक्त कोशिका प्रोटीन मेकेनोट्रांसडक्शन इम्यूनोहिस्टोकेमिस्ट्री इम्यूनोफ्लोरेसेंस नाइट्रिक ऑक्साइड सिंथेस
लाल रक्त कोशिका प्रोटीन में गतिशील परिवर्तनों का इम्यूनोस्टेनिंग-आधारित पता लगाना
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Grau, M., Kuck, L.… More

Grau, M., Kuck, L. Immunostaining-Based Detection of Dynamic Alterations in Red Blood Cell Proteins. J. Vis. Exp. (193), e64843, doi:10.3791/64843 (2023).

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