Summary
除核された赤血球のタンパク質活性化の動的変化を捉えることは、後の評価のために急性刺激に対する動的変化を保存するなど、方法論的な課題をもたらします。提示されたプロトコルは、関連するタンパク質変化の保存と分析、およびその後の検出を可能にするサンプル調製および染色技術について説明しています。
Abstract
赤血球(RBC)タンパク質の抗体標識は、全体的なタンパク質含有量の変化やタンパク質活性化状態の急激な変化を検出するために一般的に使用される半定量的な方法です。これにより、赤血球治療の評価、特定の病状の違いの特性評価、および細胞コヒーレンシーの説明が容易になります。急性に変化したタンパク質活性化(メカノトランスダクションなど)の検出には、一時的なタンパク質修飾を保存するための適切なサンプル調製が必要です。基本原理は、特異的一次抗体の初期結合を可能にするために、所望のRBCタンパク質の標的結合部位を固定化することを含む。サンプルは、二次抗体が対応する一次抗体に結合するための最適条件を保証するためにさらに処理されます。非蛍光二次抗体の選択には、ビオチン-アビジンカップリングや染色を開発するための3,3-ジアミノベンジジン-四塩酸塩(DAB)の適用など、追加の処理が必要であり、酸化を停止し、染色強度を時間通りに停止させるために顕微鏡下でリアルタイムで制御する必要があります。染色強度検出のために、画像は標準的な光学顕微鏡を用いて撮影される。このプロトコルの改変では、フルオレセイン標識二次抗体を代わりに適用することができ、これはさらなる開発ステップを必要としないという利点を有する。ただし、この手順では、染色検出のために顕微鏡に取り付けられた蛍光対物レンズが必要です。これらのメソッドの半定量的な性質を考えると、非特異的抗体反応とバックグラウンドシグナルを説明するために、いくつかのコントロール染色剤を提供することが不可欠です。ここでは、染色プロトコルと対応する分析プロセスの両方を提示し、さまざまな染色技術のそれぞれの結果と利点を比較および説明します。
Introduction
赤血球(RBC)は心血管系を70〜140日間横断し、平均赤血球年齢は約115日です1,2。老化または損傷した赤血球は、マクロファージ3によって駆動される効率的な透明化プロセスである赤血球貪食によって循環から除去されます。これらの細胞の所定の寿命は、分化および成熟中に核、ミトコンドリア、およびリボソームを含む細胞小器官を放棄することの1つの結果である4。したがって、循環する赤血球は翻訳機構を欠いており、新しいタンパク質の合成を妨げています3。したがって、既存のタンパク質に対する動的な翻訳後修飾は、赤血球に作用する細胞外および細胞内ストレッサーに応答する急性の生化学的調節の唯一の実行可能なメカニズムを表しています5。
機械的な力は、赤血球内の生化学的経路の活性化または調節を引き起こす主要な細胞外手がかりであるように思われます。赤血球膜6における機械感受性タンパク質Piezo1の発見は、これらの細胞における機械的に活性化されたシグナル伝達を調査するいくつかの研究ラインに影響を与えました7。例えば、最近の進歩により、赤血球の物理的特性は、翻訳後リン酸化やユビキチン化を含むタンパク質8の急性かつ動的な変化によって活発に制御されていることが示されています9。これらの正常な修飾は特定の疾患で異なるため9,10,11、特にメカノバイオロアプロセスに関連して、RBCタンパク質の活性化状態を決定することは科学的および臨床的に興味深いようです。
赤血球タンパク質活性化状態の急激な変化の決定は、いくつかの方法論的課題をもたらします。例えば、後の分析のために赤血球サンプルを保存するには、翻訳後修飾は耐久性がないため、修飾された赤血球タンパク質を保存する必要があります。さらに、従来のタンパク質検出法(ウェスタンブロッティングなど)は、これらの細胞のタンパク質含有量の~98%を占めるヘモグロビンに比べてタンパク質の存在量が少ないため、赤血球で標準化することが難しいことで有名です12。したがって、化学的に保存された赤血球の抗体ベースの染色は、一酸化窒素合成酵素の赤血球特異的アイソフォーム(RBC-NOS)などの重要な赤血球タンパク質の急性修飾を調べる際に選択される方法となっています13,14。RBC-NOSは一酸化窒素(NO)を酵素的に生成することが示されており、これはRBC変形能を含む必須のRBC特性に不可欠であると思われる15,16,17。RBC-NOSの翻訳後修飾は触媒酵素活性を調節し、セリン1177残基のリン酸化は酵素活性を増加させると記載されているが、セリン114またはスレオニン495残基のリン酸化はRBC-NOS活性の低下と関連している18,19。
全体として、RBCタンパク質の一時的な修飾は重要な細胞機能に寄与し、これらの修飾タンパク質の検出を可能にする標準化されたプロトコルは高い価値があります。ここでは、RBC-NOSタンパク質活性化の検出を容易にするために特異的抗体を利用する2つの異なるプロトコルを提示し、データ分析と解釈のための推奨事項について説明します。
記載されたプロトコルの性能は、ヒト血管系内で起こるものを反映する機械的力(5Pa)に応答して、セリン1177残基におけるRBC−NOSのリン酸化のよく報告された増加を測定することによって評価した。
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Protocol
ここに記載されているプロトコルは、ヘルシンキ宣言に沿ったものであり、ドイツスポーツ大学ケルン(9年16月2013日)およびグリフィス大学(2019/808)の倫理委員会によって承認されました。ボランティアは、関連する病状がないことを確認するためにスクリーニングされ、書面によるインフォームドコンセントが提供されました。
1. 免疫組織化学プロトコルを用いた赤血球タンパク質の染色
注意: 必要な化学物質と材料の詳細なリストは、 材料表に記載されています。以下のセクションでは、必要な溶液の調製について説明し、その後に免疫組織化学プロトコルの詳細な説明を示します(図1)。
図1:リン酸化部位1177におけるRBC-NOSの免疫組織化学および免疫蛍光染色に必要な個々のステップの概略図。溶液調製および採血から抗体ベースの検出および可視化まで、提示されたプロトコルの典型的なワークフローが提示されます。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
- 血液サンプルの採取
- 7人の健康な男性から血液サンプル(全血10 mL)を取得します。ボランティアは、心血管疾患、血液疾患、神経疾患、内分泌疾患、または代謝性疾患がないと報告されている健康な個人でした。ボランティアも非喫煙者でした。
- 前腕の肘前領域の目立つ静脈から滅菌針と注射器を使用して血液を採取し、すぐに次の抗凝固剤のいずれかでコーティングされたチューブに移します:ヘパリンナトリウム(免疫組織化学用)またはエチレンジアミン四酢酸(EDTA;蛍光標識用)。
- 7,20の前に説明したように、クエットタイプのせん断システムを使用して、抗凝固血液サンプルを正確に制御された機械的力にさらします。
- せん断装置は、回転可能なカップと、300μmのギャップで隔てられた固定ボブとを備える。血液サンプルをギャップに移すと、カップの正確に制御可能な回転速度がサンプルに適切に制御された機械的力を加えます。ここに提示された代表的なデータは、人間の血管系(5 Pa)内で発生するものを反映した機械的な力を長期間(300秒)適用することによって作成されました。
- 免疫染色に必要な溶液の調製
- 表1のように溶液を調製する。溶液は、免疫染色手順を実行する前に調製し、必要になるまで所定の温度で保存することができます。
注意: 保管期間は化学物質によって異なる場合があります。製品安全データシートを確認してください。
- 表1のように溶液を調製する。溶液は、免疫染色手順を実行する前に調製し、必要になるまで所定の温度で保存することができます。
- サンプル調製
- 離脱または実験的治療(該当する場合、サンプルの機械的刺激など、ステップ1.1.3を参照)の直後に全血を処理して、せん断応力の適用、運動、短時間の低酸素曝露などの短命の影響を検出できるようにします。
- ホルムアルデヒドを用いたRBCタンパク質固定を以下のように行います:全血を4%パラホルムアルデヒド溶液中で1:2の割合で室温(RT)で20分間希釈します。サンプルを132 x g でRTで3分間遠心分離し、ピペッティングで上清を慎重に除去します。
- RBCペレットを2容量の0.1 mol/Lリン酸緩衝生理食塩水(PBS)(1:3希釈)に再懸濁し、RTで5分間インキュベートします。 上記のように遠心分離を繰り返し、ピペッティングによって透明であるはずの上清を除去します。RBCペレットを0.1 mol/L PBS(1:2希釈)の1容量に再懸濁します。
- 次のように血液塗抹標本を準備します:アルコール耐性ペン(鉛筆など)を使用して、サンプルID、抗体などを顕微鏡スライドにラベル付けします。次に、調製したRBC溶液をラベルフィールドのすぐ上に加えます。
- 2枚目のスライドをサンプル上に約45°の角度で置き、サンプルをスライドに沿って均等に分散させます。サンプルをバーナーの上に5〜7秒間一定の動きでホバリングすることにより、ブンゼンバーナーの上のスライドを熱固定します。
注意: 熱固定する前にサンプルを風乾することをお勧めします。サンプルは染色までRTで保存できます(図2)。
- 免疫組織化学染色
- 各スライドの2つの領域(RBCをそれぞれの一次抗体および二次抗体とインキュベートするテスト領域、および一次抗体が対照溶液に置き換えられる対照領域)に印を付けます。この領域は、赤血球のバックグラウンドシグナルを決定するためのアッセイコントロール内として機能します。
- 表2に従って、手順の前または最中に溶液を調製します。テストエリアあたり300 μL、コントロールエリアあたり200 μLの容量が必要です。
注:これらの抗体ベースの染色手順では、定量的ではなく半定量的なデータが得られることに注意してください。したがって、生成されたデータから意味のある結論を確実に導き出すためには、適切な対照サンプル(すなわち、タンパク質活性化の評価された相対的変化の基準点を提供する)が絶対に必要です。 - トリプシン消化の場合は、0.1%トリプシンを解凍し、RTに平衡化します。 グリースペンシルを使用して、各スライドの2つの領域、テスト領域(スライドの2/3)とコントロール領域(スライドの1/3)にマークを付けます。トランスファーピペットを使用してトリス緩衝生理食塩水(TBS)を慎重に塗布し、サンプル領域を洗浄します。TBSを30秒間放置してから注ぎます。洗浄手順を繰り返します。
注: 特に説明がない限り、コントロール領域とテスト領域の両方に次のソリューションを追加します。領域は、それぞれのソリューションで十分にカバーする必要があります。使い捨てトランスファーピペットを使用して溶液を塗布し、各溶液の後にピペットを切り替えます。 - 0.1%トリプシンを添加し、蓋またはアルミホイル付きの専用のインキュベーションチャンバーを使用してスライドを覆い、インキュベーター内で37°Cで30分間インキュベートします。インキュベーション後、水道水を加えて酵素反応を停止します。溶液を注ぎます。上記のように、両方の領域をTBSで3回洗浄します。
- ペルオキシダーゼの活性化をブロックするには、メタノール溶液を加え、RTで30分間インキュベートします。 その間にスライドを覆います。溶液を注ぎます。
注:免疫蛍光検出(セクション2)の場合、内因性ペルオキシダーゼの遮断が西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)および3,3'-ジアミノベンジジン水和物(DAB)による検出によって引き起こされる人工シグナルを防ぐのに役立つため、このステップは省略できます。 - 手順3で説明されているように、TBSで両方の領域を1.4.3回洗浄します。3%スキムミルク溶液を加え、RTで30分間インキュベートしてブロックします。溶液を注ぎます。その後洗わないでください。
- 一次抗体(AB)はテスト領域にのみ追加してください。AB制御ソリューション( 表2を参照)を制御領域に追加します。サンプルを4°Cで一晩インキュベートします。乾燥を防ぐために、その間スライドを覆います。
注意: テストからコントロールエリアにソリューションを転送すると、制御値に影響するため、避けてください。 - 抗体溶液を注ぎます。手順3で説明されているように、TBSで両方の領域を1.4.3回洗浄します。
- ブロック手順を実行して、不特定の結合を防止します。3%正常ヤギ血清を加え、RTで30分間インキュベートします。
- 二次抗体溶液を加え、RTで30分間インキュベートします。 抗体溶液を注ぎます。手順3で説明されているように、TBSで領域を1.4.3回洗浄します。
- 染色とカバーの開発
- 希釈したアビジンペルオキシダーゼ溶液を添加し、RTで30分間インキュベートすることにより、アビジン共役HRP反応( 表2の希釈を参照)を実行します。 溶液を注ぎます。
- DAB混合物を調製して、 表3に従って、使用前に免疫染色を発達させる。
注意:DABは危険です。危険有害性ステートメントH341(遺伝的欠陥を引き起こす疑いがある)およびH350(癌を引き起こす可能性がある)を考慮してください。次の注意事項を検討してください:P201、P202、P280、P308 + P313、P405、およびP501。 - 以下のようにDABコントロール染色を行います:スライドからステップ1.5.1のHRP溶液を集め、染色前に別の遠沈管で少量(例えば、1 mL)の調製したDAB溶液と混合します。混合物は茶色/灰色を発色するはずです。
- スライドを顕微鏡(倍率200倍以上)の下に置き、両方の領域にDAB溶液を追加します。赤血球の染色を継続的に監視し、背景が着色し始める前に使い捨てピペットでDAB溶液を除去して染色を停止します。RBC-NOSセリン1177染色の場合、DABインキュベーション時間は約17分です。
- サンプル脱水を実行します。スライドをガラスラックに置き、70%から始めて96%、次に100%、最後にキシロールに、さまざまな希釈液のエタノール溶液にそれぞれ5秒間浸します。スライドをラックから取り外し、余分な液体を吸収するためにRBCを上部にしてティッシュに置きます。
- スライド全体に2〜3滴の封入剤を追加します。カバーガラスを使用してスライドを覆います。気泡の混入は顕微鏡評価の妨げとなるため避けてください。サンプルをドラフトで少なくとも一晩乾燥させます。
- 顕微鏡評価の実施
- 視覚化とイメージングのために、少なくとも200倍の倍率で透過光顕微鏡にスライドを置きます。顕微鏡がカメラに結合されていることを確認して、染色された赤血球の写真を撮ります。
- 顕微鏡の光源をオンにします。顕微鏡搭載カメラの電源を入れ、顕微鏡制御ソフトウェアを起動します。明視野顕微鏡を使用して、粗い焦点調整ノブと細かい焦点調整ノブを回し、赤血球が見える焦点のレベルを見つけることにより、適切な焦点を決定します。
- 画像の背景値を 220 ± 5 つのグレー値に設定し、スライドの 3 つのセルのない領域で測定します。これを行うには、無料で入手できるソフトウェアImageJを使用して最初の画像を開きます。オプションを選択します 平均グレー値 パネルを使用して 測定値を設定します。楕円形のアイコンを使用して、[測定]コマンドを使用してグレーの値を 測定 します。測定値が範囲外の場合は、それに応じて顕微鏡で背景光を調整します。背景の値が正しくなるまで、これらの手順を繰り返します。
注意: これらの背景値は、撮影したすべての画像に対して指定された範囲内にある必要があります。それ以外の場合、データは比較できません。 - 赤血球グレー値を分析するには、ImageJソフトウェア内の楕円選択ツールを使用して各赤血球のエッジをマークします。[ 測定 ]コマンドを使用して、個々の RBC のグレー値を決定します。テストからの最小50 RBCとコントロールエリアからの最小10 RBCのグレー値を測定します。
注: 分析された RBC の総数は個別に調整できます。分析される RBC が多いほど、結果はより意味のあるものになります。ただし、分析された赤血球の総数は、特定の実験内の各条件、被験者などについて比較可能である必要があります。- グリースペンシルの近くの赤血球の分析は、この領域での汚れが不完全である可能性があるため、避けてください。重複する赤血球の分析は染色強度に影響するため避けてください。他の RBC から分離された RBC のみを使用します。 50/10 RBC を評価するために、テストから少なくとも 5 つの画像とコントロール領域から少なくとも 2 つの画像を分析します。 最終分析には、すべての画像の RBC を含めます。
- 染色強度を計算するには、最終シグナルを次のように計算します。
(個別試験領域RBC - 平均試験領域背景) - (個別管理領域 RBC - 平均管理領域背景)
図2:固定プロセスと血液塗抹標本の生成の描写。 (BioRender.com で作成したスキーム)希釈した血液サンプルをパラホルムアルデヒドで化学的に固定し、遠心分離してリン酸緩衝生理食塩水で洗浄します。最後に、再懸濁した血液をスライドガラスに塗りつけ、ブンゼンバーナーの炎の上にホバリング することで 熱的に固定します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
表1:免疫組織化学染色に必要な溶液の調製および保存条件。 溶液は、プロトコルの前に調製することができる。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:即時使用のための抗体溶液の説明。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:DABソリューションをすぐに使用できるように準備するためのコンポーネントとプロトコル。この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
2. 赤血球タンパク質の蛍光標識
注:次のセクションでは、蛍光コンジュゲートを持つ抗体の使用を可能にすることを目的として開発された免疫組織化学的プロトコルの適応について概説します(図1)。
免疫蛍光プロトコルのための血液サンプル調製は、セクション1で説明したものと同じであるため、次のセクションはサンプルの染色から始まります。
- 免疫蛍光染色
- 二次蛍光標識抗体(容量については、ステップ1.4.2を参照)とともに、専用のインキュベーションチャンバーまたはアルミホイルを使用して、光から保護されたRTで30分間インキュベートします。
- 二次抗体溶液を注ぎ、サンプルをTBSで3倍洗浄します。 サンプルが乾燥しないように、サンプルに最後の洗浄を残します。
- TBSを注ぎ、サンプルをサンプルラックから一度に1つずつ取り出して、長時間の光の露出を防ぎます。サンプルを脱水するには、スライドをそれぞれ~5秒間、70%から始めて90%、最後に100%の異なるエタノール溶液にさらします。スライドをキシロール/キシレン溶液に5秒間さらします。
- 2〜3滴の封入剤でカバーガラスを準備し、カバーガラスでスライドを取り付けます。ピンセットまたは同様の滅菌金属器具で軽い圧力をかけることにより、封入剤の均一な分布を確保します。同じ機器で、イメージングを妨げる可能性のある気泡を除去します。サンプルを暗くて乾燥した場所で一晩乾燥させます。
- 顕微鏡評価
- 視覚化とイメージングのために、スライドを顕微鏡ステージに少なくとも400倍の合計倍率で置きます。顕微鏡光源と蛍光光源の電源を入れ、蛍光光源が最大強度に調整されていることを確認します。
- 顕微鏡搭載カメラの電源を入れ、顕微鏡制御ソフトウェアを起動します。明視野顕微鏡を使用して、粗い焦点調整ノブと細かい焦点調整ノブを回し、赤血球が見える焦点のレベルを見つけることで、適切な焦点を決定します。
注:光に過度にさらされると、蛍光コンジュゲートの光退色を引き起こす可能性があります。この目的のために、以前の実験のスライドを使用して、まだ分析されていないスライドの光曝露を最小限に抑えることができます。 - コントロールエリアの赤血球を検査して最適なレーザー強度を決定します。赤血球が見えるように強度が十分に高く、大きなバックグラウンド信号が生成されないことを確認します。比較可能性を確保するために、領域とサンプル間で強度と露光時間を一定に保ちます。
- ランダムに選択されたスライドのテスト領域の少なくとも3つの異なる領域で明視野および蛍光画像をキャプチャします。領域を選択するには、顕微鏡ステージコントロールを使用して、脂質ペンでマークされたスライドの端から離れるようにパンします。特異な RBC レイヤーの均一な分布を示すエリアを選択します。
- 蛍光画像の露光時間を1秒に設定し、顕微鏡制御ソフトウェアのソフトウェアコントロールを使用して画像をキャプチャします。明視野モードに切り替え、露出時間を「自動」に設定して、対応する明視野画像をキャプチャします。
- ステップ2.2.3を繰り返して、スライドの制御領域の少なくとも2つの異なるランダムに選択された領域で明視野および蛍光画像をキャプチャします。
- 画像を.tif形式で保存して、ピクセルの元のグレー値を保持し、圧縮を防ぎ、取得のメタデータを保持します。
- キャプチャした赤血球のグレー値を測定します。 ImageJ(またはFIJI21、 補足ファイル1を参照)を開きます。個々の RBC のグレー値を決定します。このためには、 楕円 選択ツールを使用して個々のセルをマークし、[ 計測 ] コマンドを使用して分析します。
注:赤血球が他の細胞と重なる場合は、結果のシグナルが増加する可能性があるため、分析しないでください。 - RBCのない3〜5つの領域を強調表示し、グレー値を決定して、バックグラウンド信号の測定値を提供します。テスト領域ごとに少なくとも3つの異なる画像から少なくとも150個のRBCを分析し、各コントロール領域の少なくとも2つの異なる画像から少なくとも50個のRBCを分析します。
注:変動を最小限に抑えるために、より多くの細胞/領域の分析が推奨される場合があります。RBC集団が本質的に不均一であることを考えると、目的のタンパク質によっては、シグナルの細胞間変動性が有意である可能性があります。 - マクロコマンドを使用して、キャプチャした画像の代替データ分析を実行します。特定の画像の自動選択、背景補正、およびグレー値分析のためのImageJのFIJIリリースを介してマクロコマンドを作成/インストールします。
注:このルーチンは、自動閾値化を使用して、元の画像のコピーを使用して特定の画像に存在する細胞を検出し、蛍光赤血球のグレー値を抽出するために元の画像に課されるオーバーレイを生成します。マクロは、 補足コーディング・ファイル 1 として .ijm ファイルとして保管されます。 - フィジーで分析できるように.tif形式で画像ファイルを開きます。RBC fluorescence.ijm (補足コーディング ファイル 1) マクロを開き、[ 実行] をクリックします。
注意: このマクロは、600倍の倍率と大きな信号対雑音比で得られた画像用に設定されています。細胞の自動選択は、研究者によってレビューされるべきです。
- 最終信号を次のように計算します。
手動分析のための(テスト領域RBC - テスト領域の背景) - (制御領域RBC - 制御領域の背景)。
自動分析のための(テストエリア - コントロールエリア)。
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Representative Results
RBCタンパク質の急性変化の検出を容易にする方法を記載した提示されたプロトコルを、周知の機械的に敏感なタンパク質変化、すなわちセリン1177残基におけるRBC-NOSのリン酸化について試験した。全血は健康なボランティアから得られ、その後2つの別々のアリコートに分割されました。所与の血液試料を生理的大きさ(5Pa)の機械的剪断応力に300秒間曝露し、これはセリン117714でRBC-NOSリン酸化を誘発することが以前に示された。機械的せん断暴露の停止直後に、血液サンプルをパラホルムアルデヒドで固定した。対照として、血液サンプルを露出させ、せん断装置に装填し、パラホルムアルデヒドに固定する前に300秒間静置した。安静時および機械的な力のばく露に応答してセリン1177残基でリン酸化されたRBC-NOSを標的とする抗体のシグナルを、免疫組織化学(図3A、B)および免疫蛍光(図3C、D)の両方を用いて評価した。せん断サンプルと非せん断サンプルでは、統計的に有意に異なるシグナルを生成しました[フリードマン検定:χ2(3)= 18.71、p = 0.0003]。免疫組織化学的または免疫蛍光プロトコルのいずれかで評価した場合、それぞれのせん断されていない細胞(いずれもp<0.01)と比較して、RBCの機械的力ばく露に応答して、セリン1177残基でリン酸化されたRBC-NOSに対する抗体のシグナルの約3倍の増加が同等に検出されました(図3E)。
したがって、両方の方法で得られた結果の比較は、提示されたプロトコル間の優れた一致を示し、これも機械的刺激に応答して増加したRBC-NOSリン酸化を首尾よく確実に検出した。
図3:機械的せん断後のRBC-NOSセリン1177リン酸化の免疫組織化学(A、B)および免疫蛍光(C、D)染色からの代表的なプールデータ。 これらのサンプルからのシグナル強度の分析は(E)に示されており、白いバーはHRP染色を使用して得られたデータを反映し、黒いバーは蛍光法を使用して得られたデータを表します。血液は、安静時または機械的な力(すなわち、剪断)にさらされた直後に調製された。 N = 7の血液サンプルは、異なるドナーから得られた。データは平均±平均の標準誤差として示される。**p < 0.01、ノンパラメトリックフリードマン検定を用いて決定。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:免疫蛍光赤血球の画像の段階的な注釈付きの自動半定量画像分析生コード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディングファイル1:免疫蛍光赤血球の自動画像解析を実行するためのFIJI/ImageJソフトウェアと互換性のあるコンパイルされたコード。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
最近の文献は、RBC-NOSタンパク質がRBC変形能の調節にとって決定的に重要であることを強く示唆しており15,22,23、その結果、狭い毛細血管を通過することが促進されます24。タンパク質活性は、翻訳後タンパク質修飾、特に特定の残基のリン酸化に大きく依存します18。関心の焦点は、RBC−NOSタンパク質23の活性化に関するリン酸化部位1177にある。このタンパク質の変化は、さまざまな疾患で示されています25,26,27,28,29したがって、これらの変化の調査は、特定の疾患の理解だけでなく、特定の治療法の開発と指導にも貴重な知識を提供する可能性があります30。
RBC−NOSセリン1177リン酸化を増加させるいくつかの刺激が同定されているが22、機械的な力は、RBC−NOSタンパク質13,18,31,32の活性化または調節を引き起こす主要な細胞外刺激であると思われる。ただし、RBC-NOS活性の調節はかなり一時的なものです33。したがって、せん断依存性変化の分析/保存を直ちに実行する必要があります。免疫組織化学的、およびその後の免疫蛍光プロトコルは、RBC-NOSの急性の調節修飾の保存と分析を容易にするために開発されました。
免疫組織化学的および免疫蛍光プロトコルを介して得られたここに提示された結果は、せん断曝露後のRBC-NOSセリン1177のリン酸化の増加に関して高いレベルの一致を示しています。したがって、どちらのプロトコルもRBCタンパク質の一過性翻訳後変化の調査に適しており、それぞれの実験者は、地元で利用可能なリソースとインフラストラクチャを考慮して、それぞれのラボで使用する方法を決定できます。タンパク質を標的とする抗体は、天然状態または翻訳後修飾後の両方で広く商業的に入手可能であることを考えると、本アッセイはかなりの範囲の標的に適応可能である。したがって、それらは、RBCシグナル伝達を評価するための有用なツールを提示する14、27、34。
手順中に特定の側面を考慮する必要があります。上記の抗体は、赤血球に適用するために特別に開発されたものではありません。代わりに、これらは特定の内皮型NOS(eNOS)抗体です。eNOSとRBC-NOSは大きな相同性を共有しているように見えるため22,23、eNOS特異的抗体は伝統的にRBC-NOS活性化を可視化するために使用されてきました。誘導性(iNOS)またはニューロン(nNOS)アイソフォームに対する抗体は赤血球でシグナルを産生しないことに留意することは重要であり、RBC-NOSがeNOS22と有意な構造的類似性を共有していることを裏付けています。サプライヤーが推奨するデータは、テストなしではRBC実験に適用できないため、抗体を実験に使用する前に適切な希釈をテストする必要があります。さらに、流通会社の切り替えでは、使用前にさまざまな希釈液を過度にテストする必要があります。新たに調達した抗体/化学物質を検査する際には、高度に体系的なアプローチに従うことをお勧めします。新しいコンポーネントは、新しいコンポーネントを導入する特定のステップのみを変更する必要がある用量反応アプローチでテストする必要があります。.ポジティブコントロール(すなわち、RBC-NOS活性化を刺激する)は、ここに示されているように、剪断された血液と剪断されていない血液を比較することによって提供されるべきです。あるいは、350pMインスリンによるRBC-NOSリン酸化の薬理学的刺激は、機械的な力の適用で観察されたものと同様に、RBC-NOSリン酸化の増加をもたらすことが示されています7。
提示された検出方法の限界は、商業的に得られた一次抗体の特異性に依存する方法(例えば、ウェスタンブロット)の一般的な限界にまで及ぶ。まず、目的の抗原を標的とする一次抗体が利用可能でなければなりません。抗体が入手可能な場合、抗体は標的に特異的でなければならず、機能的測定(すなわち、活性化剤/阻害剤による薬理学的治療)またはウェスタンブロッティングによって確認することができます。さらに、記載された方法を介して生成されたデータは慎重に解釈されなければならない。すなわち、提示された方法は半定量的であり、適切な対照試料に対するタンパク質修飾の変化に関する情報を提供する。ここで提示された半定量的評価は、常に酵素の活性化を指し、酵素活性と混同しないでください。酵素活性の測定には、[3H] L-アルギニンから[3H]シトルリンへの変換率(fmol/min)または[14 C] L-アルギニンから[14C]シトルリン35,36への変換率(fmol/min)を測定するアルギニン-シトルリンアッセイなどの個別のアッセイが必要です。増加したRBC-NOS活性化がより高いNOレベルおよび/または増加したRBC変形能値も伴うかどうかを検証するために、例えば、NO濃度の追加分析を実施すべきである。さらに、NOの供給源としてRBC-NOSを選別するには、L-NIOなどのNOS阻害剤を採用する必要があります15。
ここで提示された方法は、刺激されていない対照細胞と比較して、加えられた刺激に応答するRBC-NOS活性化の変化を分析するために十分に開発されていることを要約することができます。したがって、これらの方法は、機械的ストレスが細胞機能に重要であり、最終的には作業組織の適切な灌流とガス交換に不可欠なRBCタンパク質の機能にどのように影響するかを理解するのに役立ちます。
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Disclosures
すべての著者は、利益相反がないことを明らかにしています。
Acknowledgments
LKは、オーストラリア政府の研究トレーニングプログラム奨学金の支援を認めています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3,3′-Diaminobenzidin -tetrahydrochloride Hydrate | Sigma/Merck | D5637 | DAB |
| Ammoniumchloride | Merck /Millipore | 101145 | NH4Cl |
| Centrifuge 5427 R | Eppendorf | 5409000010 | |
| Coverslips | VWR | 631-0147 | |
| di-sodium Hydrogen Phosphate Dihydrate | Merck /Millipore | 106580 | Na2HPO4. 2 H2O |
| Disposable transfer pipettes | VWR | 612-6803 | |
| Entellan | Merck /Millipore | 107961 | rapid mounting medium for microscopy |
| Ethanol denaturated using 1 % methyl ethyl ketone (MEK) | Hofmann | 642 | |
| Glucose-Oxidase | Sigma/Merck | G2133 | |
| Grease pencil | Dako | S 2002 | |
| Horse-radish peroxidase/ExtrAvidin−Peroxidase | Sigma/Merck | E-2886 | HRP |
| Hydrochloric acid | Merck /Millipore | 109057 | HCl |
| Hydrogen peroxide, 30% | Merck /Millipore | 107203 | H2O2 |
| ImageJ Software | Freeware | ||
| Laser-assisted optical rotational cell analyser (LORCA) | RR Mechatronics | Ektacytometer instrument used for shearing | |
| Methanol | Merck /Millipore | 106009 | |
| Microscope slides | VWR | 630-1985 | |
| Nickel(II)-sulfate Hexahydrate | Sigma/Merck | N4882 | NiSO4.6H2O |
| Normal Goat serum | Agilent/DAKO | X0907 | NGS |
| Paraformaldehyde | Merck /Millipore | 818715 | PFA |
| Pipettes Eppendorf Reference 2 | VWR | 613-5836/ 613-5839 | |
| Rabbit Anti-phospho eNOS Antibody (Ser1177) | Merck/Millipore | 07-428-I | Primary Antibody |
| Reaction tubes, 2ml | Eppendorf | 30120094 | |
| Secondary Antibody goat anti rabbit | Agilent/DAKO | E0432 | Secondary Antibody |
| Skim milk powder | Bio-Rad | 170-6404 | |
| Sodium chloride | Merck /Millipore | 106404 | NaCl |
| Sodium Dihydrogen Phosphate Monohydrate | Merck /Millipore | 106346 | NaH2PO4.H2O |
| Sodium hydroxide, 1 M | Merck /Millipore | 150706 | NaOH |
| Tris(hydroxymethyl)-aminomethane | Merck /Millipore | 108382 | Tris |
| Trypsin | Sigma/Merck | T7409 | |
| Tween20 | Merck /Millipore | 822184 | |
| Whatman Glas microfiber filter, quality GF/F | Merck /Millipore | WHA1825047 | |
| Xylol | VWR Chemicals | 2,89,73,465 | |
| ß-D-Glucose monohydrate | Merck /Millipore | 14431-43-7 |
References
- Cohen, R. M., et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c. Blood. 112 (10), 4284-4291 (2008).
- Mock, D. M., et al. Red blood cell (RBC) survival determined in humans using RBCs labeled at multiple biotin densities. Transfusion. 51 (5), 1047-1057 (2011).
- Thiagarajan, P., Parker, C. J., Prchal, J. T. How do red blood cells die? Frontiers in Physiology. 12, 655393 (2021).
- Moras, M., Lefevre, S. D., Ostuni, M. A. From erythroblasts to mature red blood cells: organelle clearance in mammals. Frontiers in Physiology. 8, 1076 (2017).
- Pretini, V., et al. Red blood cells: chasing interactions. Frontiers in Physiology. 10, 945 (2019).
- Cahalan, S. M., et al. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume. eLife. 4, e07370 (2015).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 323 (1), H24-H37 (2022).
- Kuck, L., Peart, J. N., Simmonds, M. J. Active modulation of human erythrocyte mechanics. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 319 (2), C250-C257 (2020).
- Strader, M. B., et al. Post-translational modification as a response to cellular stress induced by hemoglobin oxidation in sickle cell disease. Scientific Reports. 10 (1), 14218 (2020).
- Pecankova, K., Majek, P., Cermak, J., Dyr, J. E. Posttranslational modifications of red blood cell ghost proteins as "signatures" for distinguishing between low- and high-risk myelodysplastic syndrome patients. Turkish Journal of Haematology. 34 (1), 111-113 (2017).
- Grau, M., et al. High red blood cell nitric oxide synthase activation is not associated with improved vascular function and red blood cell deformability in sickle cell anaemia. British Journal of Haematology. 168 (5), 728-736 (2015).
- Sae-Lee, W., et al. The protein organization of a red blood cell. Cell Reports. 40 (3), 111103 (2022).
- Suhr, F., et al. Moderate exercise promotes human RBC-NOS activity, NO production and deformability through Akt kinase pathway. PLoS One. 7 (9), e45982 (2012).
- Kuck, L., Grau, M., Bloch, W., Simmonds, M. J. Shear stress ameliorates superoxide impairment to erythrocyte deformability with concurrent nitric oxide synthase activation. Frontiers in Physiology. 10, 36 (2019).
- Grau, M., et al. RBC-NOS-dependent S-nitrosylation of cytoskeletal proteins improves RBC deformability. PLoS One. 8 (2), e56759 (2013).
- Simmonds, M. J., Detterich, J. A., Connes, P. Nitric oxide, vasodilation and the red blood cell. Biorheology. 51 (2-3), 121-134 (2014).
- Bor-Kucukatay, M., Wenby, R. B., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Effects of nitric oxide on red blood cell deformability. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 284 (5), H1577-H1584 (2003).
- Suhr, F., et al. Intensive exercise induces changes of endothelial nitric oxide synthase pattern in human erythrocytes. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 20 (2), 95-103 (2009).
- Grau, M., et al. Regulation of red blood cell deformability is independent of red blood cell-nitric oxide synthase under hypoxia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 63 (3), 199-215 (2016).
- Grau, M., Kuck, L., Dietz, T., Bloch, W., Simmonds, M. J. Sub-fractions of red blood cells respond differently to shear exposure following superoxide treatment. Biology. 10 (1), 47 (2021).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Ozüyaman, B., Grau, M., Kelm, M., Merx, M. W., Kleinbongard, P. RBC NOS: regulatory mechanisms and therapeutic aspects. Trends in Molecular Medicine. 14 (7), 314-322 (2008).
- Kleinbongard, P., et al. Red blood cells express a functional endothelial nitric oxide synthase. Blood. 107 (7), 2943-2951 (2006).
- McMahon, T. J. Red blood cell deformability, vasoactive mediators, and adhesion. Frontiers in Physiology. 10, 1417 (2019).
- Bizjak, D. A., Brinkmann, C., Bloch, W., Grau, M. Increase in red blood cell-nitric oxide synthase dependent nitric oxide production during red blood cell aging in health and disease: a study on age dependent changes of rheologic and enzymatic properties in red blood cells. PLoS One. 10 (4), 0125206 (2015).
- Di Pietro, N., et al. Nitric oxide synthetic pathway and cGMP levels are altered in red blood cells from end-stage renal disease patients. Molecular and Cellular Biochemistry. 417 (1-2), 155-167 (2016).
- Grau, M., et al. Even patients with mild COVID-19 symptoms after SARS-CoV-2 infection show prolonged altered red blood cell morphology and rheological parameters. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 26 (10), 3022-3030 (2022).
- Mozar, A., et al. Red blood cell nitric oxide synthase modulates red blood cell deformability in sickle cell anemia. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 64 (1), 47-53 (2016).
- Ulker, P., Gunduz, F., Meiselman, H. J., Baskurt, O. K. Nitric oxide generated by red blood cells following exposure to shear stress dilates isolated small mesenteric arteries under hypoxic conditions. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 54 (4), 357-369 (2013).
- Nader, E., et al. Hydroxyurea therapy modulates sickle cell anemia red blood cell physiology: Impact on RBC deformability, oxidative stress, nitrite levels and nitric oxide synthase signalling pathway. Nitric Oxide: Biology and Chemistry. 81, 28-35 (2018).
- Fischer, U. M., Schindler, R., Brixius, K., Mehlhorn, U., Bloch, W. Extracorporeal circulation activates endothelial nitric oxide synthase in erythrocytes. The Annals of Thoracic Surgery. 84 (6), 2000-2003 (2007).
- Horobin, J. T., Sabapathy, S., Kuck, L., Simmonds, M. J. Shear stress and RBC-NOS Serine1177 Phosphorylation in humans: a dose response. Life. 11 (1), 36 (2021).
- Kuck, L., Grau, M., Simmonds, M. J. Recovery time course of erythrocyte deformability following exposure to shear is dependent upon conditioning shear stress. Biorheology. 54 (5-6), 141-152 (2018).
- Grau, M., et al. Effect of acute exercise on RBC deformability and RBC nitric oxide synthase signalling pathway in young sickle cell anaemia patients. Scientific Reports. 9 (1), 11813 (2019).
- Methods in Nitric Oxide Research. Feelisch, M. , Wiley. Chichester. (1998).
- Cortese-Krott, M. M., et al. Human red blood cells at work: identification and visualization of erythrocytic eNOS activity in health and disease. Blood>. 120 (20), 4229-4237 (2012).
