Summary
Nåværende metoder for å analysere den intracellulære dynamikken til polariserte enkeltceller er ofte manuelle og mangler standardisering. Dette manuskriptet introduserer en ny bildeanalysepipeline for automatisering av midtlinjeekstraksjon av enkeltpolariserte celler og kvantifisering av spatiotemporal oppførsel fra tidsforløp i et brukervennlig online grensesnitt.
Abstract
Cellepolaritet er et makroskopisk fenomen etablert av en samling romlig konsentrerte molekyler og strukturer som kulminerer i fremveksten av spesialiserte domener på subcellulært nivå. Det er knyttet til å utvikle asymmetriske morfologiske strukturer som ligger til grunn for viktige biologiske funksjoner som celledeling, vekst og migrasjon. I tillegg har forstyrrelsen av cellepolaritet vært knyttet til vevsrelaterte lidelser som kreft og gastrisk dysplasi.
Nåværende metoder for å evaluere den spatiotemporale dynamikken til fluorescerende reportere i individuelle polariserte celler involverer ofte manuelle trinn for å spore en midtlinje langs cellens hovedakse, noe som er tidkrevende og utsatt for sterke forstyrrelser. Videre, selv om ratiometrisk analyse kan korrigere den ujevne fordelingen av reportermolekyler ved hjelp av to fluorescenskanaler, er bakgrunnssubtraksjonsteknikker ofte vilkårlig og mangler statistisk støtte.
Dette manuskriptet introduserer en ny beregningsrørledning for å automatisere og kvantifisere den spatiotemporale oppførselen til enkeltceller ved hjelp av en modell av cellepolaritet: pollenrør / rothårvekst og cytosolisk iondynamikk. En tre-trinns algoritme ble utviklet for å behandle ratiometriske bilder og trekke ut en kvantitativ representasjon av intracellulær dynamikk og vekst. Det første trinnet segmenterer cellen fra bakgrunnen, og produserer en binær maske gjennom en terskelteknikk i bildepunktintensitetsrommet. Det andre trinnet sporer en bane gjennom midtlinjen av cellen gjennom en skjelettiseringsoperasjon. Til slutt gir det tredje trinnet de behandlede dataene som en ratiometrisk timelapse og gir en ratiometrisk kymograph (dvs. en 1D romlig profil gjennom tid). Data fra ratiometriske bilder oppnådd med genetisk kodede fluorescerende reportere fra voksende pollenrør ble brukt til å benchmark metoden. Denne rørledningen muliggjør raskere, mindre partisk og mer nøyaktig representasjon av den spatiotemporale dynamikken langs midtlinjen av polariserte celler, og dermed fremme den kvantitative verktøykassen som er tilgjengelig for å undersøke cellepolaritet. AMEBaS Python-kildekoden er tilgjengelig på: https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
Cellepolaritet er en grunnleggende biologisk prosess der den samordnede virkningen av en samling romlig konsentrerte molekyler og strukturer kulminerer i etableringen av spesialiserte morfologiske subcellulære domener1. Celledeling, vekst og migrasjon er avhengig av slike polaritetssteder, mens tapet har vært assosiert med kreft i epitelvevsrelaterte lidelser2.
Apikalt voksende celler er et dramatisk eksempel på polaritet, hvor polaritetsstedet på spissen vanligvis reorienterer seg til ekstracellulære signaler3. Disse inkluderer utvikling av nevritter, sopphyfer, rothår og pollenrør, hvor flere cellulære prosesser viser uttalt forskjeller fra spissen av cellen mot skaftet. Spesielt i pollenrør er aktinpolymerisasjon, vesikkelhandel og ionekonsentrasjoner markert polarisert, og viser spissfokuserte gradienter4. Pollenrør er de mannlige gametofytter av blomstrende planter og er ansvarlige for å levere sædcellene til eggløsningen ved å vokse utelukkende på toppen av cellen ved en av de raskeste vekstratene kjent for en enkelt celle. De spissfokuserte gradientene av ioner som kalsium 5 (Ca2+) og protoner 6 (H +) spiller en viktig rolle i å opprettholde pollenrørvekst, noe som er avgjørende for å oppnå sin viktigste biologiske funksjon som kulminerer i en dobbel befruktning 5,6. Dermed er kvantitative metoder for å analysere den spatiotemporale dynamikken langs midtlinjen av apikalt voksende celler avgjørende for å undersøke de cellulære og molekylære mekanismene som ligger til grunn polarisert vekst 7,8,9. Forskere bruker ofte kymographs, dvs. en matrise som representerer pikselintensitetene til cellens midtlinje (f.eks. Kolonner) gjennom tid (f.eks. Rader), som gjør det mulig å visualisere cellevekst og migrasjon i diagonalen (figur 1). Til tross for deres nytte, blir kymographs ofte trukket ut ved å manuelt spore midtlinjen, være utsatt for forstyrrelser og menneskelige feil, samtidig som de er ganske arbeidskrevende. Dette krever en automatisert metode for midtlinjeekstraksjon som er den første funksjonen i rørledningen introdusert her kalt AMEBaS: Enutomatisk Midline Extraction og Background Subtraksjon av ratiometrisk fluorescenstid bortfaller av polariserte enkeltceller.
Når det gjelder eksperimentelle prosedyrer, kan kvantitativ avbildning av ioner/molekyler/arter av interesse i enkeltceller oppnås med genetisk kodede fluorescerende prober10. Blant de stadig voksende valgene er ratiometriske prober en av de mest nøyaktige siden de avgir forskjellige fluorescensbølgelengder når de er bundet / ubundet til molekylene av interesse11. Dette muliggjør korreksjon av den romlige heterogeniteten i sondens intracellulære konsentrasjon ved å bruke forholdet mellom to kanaler med deres kanalspesifikke bakgrunn trukket fra. Det kan imidlertid være en komplisert oppgave å estimere bakgrunnsterskelen for hver kanal og hvert tidspunkt, siden den ofte varierer i rommet på grunn av effekter som skyggelegging, der hjørnene i bildet har lysstyrkevariasjon i forhold til sentrum, og i tid på grunn av falming av fluoroforen (fotobleking)12. Selv om det er flere mulige metoder, foreslår dette manuskriptet å bestemme bakgrunnsintensiteten automatisk ved hjelp av segmenteringsterskelen oppnådd med Isodata-algoritmen13, som deretter glattes over rammer gjennom polynomregresjon som standard. Romlige komponenter som stammer fra fluorescensheterogenitet som ikke var relatert til målcellen fjernet i12, ble imidlertid ignorert ved denne metoden. Automatisk terskelverdi kan utføres med flere metoder, men Isodata-algoritmen ga de beste resultatene empirisk. Dermed er automatisk bakgrunnsverdisubtraksjon og ratiometrisk beregning den andre hovedfunksjonen til AMEBaS (figur 1), som til sammen mottar som inngang en stabel med tokanals fluorescensmikroskopibilder, estimerer cellens midtlinje og den kanalspesifikke bakgrunnen, og sender ut kymografer av begge kanalene og deres forhold (hovedutgang #1) etter bakgrunnssubtraksjon, utjevning og fjerning av avvik, sammen med en stabel med ratiometriske bilder (hovedutgang #2).
AMEBaS ble testet med fluorescenstid bortfall av voksende Arabidopsis pollenrør oppnådd under et mikroskop, enten med Ca2 + (CaMeleon) 8 eller pH (pHluorin) 6 ratiometriske sensorer uttrykt under pollen-spesifikke LAT52 promotor. Bilder fra hver kanal ble tatt hver 4. s koblet til et invertert mikroskop, et frontbelyst kamera (2560 piksler × 2160 piksler, pikselstørrelse 6.45 μm), en fluorescensbelysning og en vannnedsenkningsobjektivlinse 63x, 1.2NA. Filterinnstillinger som ble brukt for CaMeleon var: eksitasjon 426-450 nm (CFP) og 505-515 nm (YFP), utslipp 458-487 nm (CFP) og 520-550 nm (YFP), mens for pHluorin, eksitasjon 318-390 nm (DAPI) og 428-475 nm (FITC), utslipp 435-448 nm (DAPI) og 523-536 nm (FITC). Et komplett datasett ble lagt til for testing hos Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)14.
I tillegg ble rørledningen testet med rothårdata, hvor avbildning ble utført med et lysarkmikroskop (SPIM) som tidligere beskrevet 15,16 med Arabidopsis rothår som uttrykker den genetisk kodede Ca2+ reporteren NES-YC3.6 under kontroll av UBQ10-promotoren17. Den hjemmelagde LabView-programvaren som styrte kamerainnsamlingen, prøveoversettelsen og lukkeren til lysarkmikroskopet tillot observasjon av de to cpVenus- og CFP-kanalene, men også visualiseringen av forholdet deres i sanntid. Hvert forholdsbilde av time-lapse representerte en maksimal intensitetsprojeksjon (MIP) mellom cpVenus og CFP fluorescerende kanaler bilder hentet fra 15 skiver av prøven fordelt 3 μm fra hverandre. Time-lapse cpVenus/CFP-forholdet for MIP ble lagret og direkte brukt til AMEBaS-analysen.
Selv om denne rørledningen kan fungere med flere typer voksende og migrerende celler, ble den spesielt utviklet for å analysere voksende celler som vokser utelukkende på spissen, for eksempel pollenrør, rothår og sopphyfer, der det er en korrespondanse av de ikke-voksende cytoplasmatiske områdene mellom rammer. Når en slik korrespondanse ikke er til stede, bør brukeren velge alternativet complete_skeletonization i trinn 1.3.1.1 (se diskusjonsdelen for mer informasjon).
Figur 1: En oversikt over pipelinearbeidsflyten. AMEBaS-rørledningen analyserer og behandler mikroskopiske tidsforløp i tre hovedtrinn: Single-Cell Segmentation, Midline Tracing og Kymograph Generation. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Interaktiv notatbokprotokoll
Jupyter-notatboken kan brukes direkte på nettet ved hjelp av Google Colab på https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, der instruksjonene nedenfor var basert. Alternativt er Jupyter-notatboken tilgjengelig på https://github.com/badain/amebas, hvor den kan lastes ned og konfigureres til å kjøre lokalt i Jupyter (Anaconda kan gi en enkel installasjonsprosess på tvers av plattformer). En komplett test data kan bli funnet på Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), som inneholder single og dual channel data av Arabidopsis pollen rør uttrykker enten pH eller Ca2 + reportere14. Rørledningen er delt inn i deler, der hvert trinn kan utføres ved å klikke på avspillingsknappen etter å ha angitt de brukerspesifikke alternativene. De nødvendige filene for denne studien er tilgjengelige i AMEBaS- hoved zip-mappe (Supplementary Coding File 1).
- Åpne Jupyter notebook og les time-lapse-filene.
- Naviger til hjemmesiden til den interaktive notatboken i Google Colab nevnt ovenfor, eller last ned og åpne AMEBaS_Local.ipynb-notatboken fra GitHub.
- Forbered katalogoppsettet for inngangs- og utdataene:
- Hvis du bruker den lokale versjonen, plasserer du fluorescensintervallet som en TIFF-fil eller DV-fil i en mappe med navnet data som må være i rotmappen til programmet. En mappe med navn må opprettes for å motta de genererte dataene. Kjør deretter installasjonskodeblokken.
- Hvis du bruker notatblokken på Google Colab, kjører du kodeblokken for oppsett for å generere data - og ut-mappene automatisk.
- Kjør File Input-kodeblokken for å lese tidsforløpsdataene ved å klikke avspillingsknappen . Hvis du bruker Google Colab-versjonen av notatboken, klikker du på Velg fil-knappen for å laste opp tidsforløpsfilen direkte til datamappen .
MERK: Antall kanaler oppdages automatisk basert på dimensjonen til bildet. - Velg om ytterligere utdata for hvert trinn skal genereres ved å sette den detaljerte parameteren til True eller False.
- Oppdag hovedcellen og segmentet fra bakgrunnen (figur 2).
- Kjør kodeblokken for enkeltcellesegmentering for automatisk å skille interessecellen fra bakgrunnen ved å klikke på avspillingsknappen .
MERK: Median- og gaussfiltre vil bli brukt som et forbehandlingstrinn for å fjerne uønsket støy før forgrunnen segmenteres fra bakgrunnen ved at isodata terskler og isolerer området for det største området for å fjerne uønskede artefakter.- Juster sigmaverdien som brukes av Gaussian i 'sigma'-variabelen for å finjustere jevnheten til segmenteringsmasken. Standardverdien er 2,0.
- Sett variabelestimatet til Usann for å lagre terskelverdien beregnet direkte fra Isodata eller til True for å jevne den over naborammer ved hjelp av lokal polynomregresjon (LOESS). Finjuster funksjonen ved å endre n_points-variabelen . Standardverdien er 40.
- Kjør kodeblokken for enkeltcellesegmentering for automatisk å skille interessecellen fra bakgrunnen ved å klikke på avspillingsknappen .
- Spor midtlinjen langs celleforlengelsen (figur 3).
- Kjør kodeblokken Cell Midline Tracing ved å klikke på avspillingsknappen for automatisk å skjelettisere cellen ved hjelp av Lees metode18 og utvide spissen av det siste skjelettet gjennom lineær ekstrapolering.
- Velg å spore midtlinjen bare på det siste bildet eller én gang per ramme ved å justere det complete_skeletonization argumentet.
MERK: Når alle rammer er skjelettisert, hoppes ekstrapolering over. - Sett brøkdelen av punkter i skjelettet som skal interpoleres under ekstrapolering ved å justere den interpolation_fraction variabelen. Standardverdien er 0,25.
- Velg lengden på midtlinjeekstrapolasjonen ved å endre variabelen extrapolation_length. Standard er -1, som strekker skjelettet opp til nærmeste kant.
- Velg å spore midtlinjen bare på det siste bildet eller én gang per ramme ved å justere det complete_skeletonization argumentet.
- Kjør kodeblokken Cell Midline Tracing ved å klikke på avspillingsknappen for automatisk å skjelettisere cellen ved hjelp av Lees metode18 og utvide spissen av det siste skjelettet gjennom lineær ekstrapolering.
- Generer kymographs for hver kanal ( Figur 4).
- Kjør den første datavisualiseringskodeblokken ved å klikke på avspillingsknappen for automatisk å generere kymographs for begge kanalene.
- Velg størrelsen på den gaussiske kjernen som brukes til utjevning ved å justere variabelen kymograph_kernel.
MERK: Det tilsvarer størrelsen på nabolaget (i piksler) som pikselintensitetene gjennomsnittes over. Standard er 3 piksler x 3 piksler. - Ikke-utvidede skjeletter genererer avkortede kymografer som må bruke et egendefinert fargekart for å vise intensiteten riktig. Velg brøkprosenten av intensitetene som skal tilordnes bakgrunnsfargen, svart, justere shift_fraction variabel. Standardverdien er 0,7.
- Velg størrelsen på den gaussiske kjernen som brukes til utjevning ved å justere variabelen kymograph_kernel.
- Kjør den første datavisualiseringskodeblokken ved å klikke på avspillingsknappen for automatisk å generere kymographs for begge kanalene.
- Beregn forholdet mellom kanaler (figur 5).
- Kjør den andre kodeblokken for datavisualisering ved å klikke på avspillingsknappen for automatisk å generere en ratiometrisk kymograf og en ratiometrisk timelapse (figur 6).
MERK: Dette trinnet er bare tilgjengelig når du bruker tidsforløp for to kanaler. Terskelen for bakgrunnsintensitet som er lagret i trinn 1.2.1.2, trekkes fra hver kanal.- Juster den switch_ratio variabelen for å bytte rekkefølgen på kanaler som brukes som teller og nevner under forholdstallsberegninger. Standard er False.
- Velg om forholdet timelapse må glattes ytterligere med et medianfilterpass ved å justere smooth_ratio-variabelen. Standard er False.
- Velg om du vil fjerne avvik produsert av det lave signalet til nevnerkanalen ved å manipulere reject_outliers-variabelen . Standard er Sann og definerer avvik som verdier 1,5 ganger interkvartilområdet over tredje kvartil (der 75 % av verdiene ligger).
- Velg om bakgrunnen i ratiometriske utdata må eksporteres ved å justere variabelen background_ratio. Standard er False, som erstatter den med nuller.
- Kjør den andre kodeblokken for datavisualisering ved å klikke på avspillingsknappen for automatisk å generere en ratiometrisk kymograf og en ratiometrisk timelapse (figur 6).
Figur 2: Segmenteringstrinn for enkeltceller. Bildebehandlingsteknikker som filtrering, terskel og områdemerking brukes til å isolere signalet av interesse (trinn 1.2). Disse bestemte dataene hadde følgende verdier for laveste intensitet: 2556, median: 3441 og høyeste intensitet: 32125. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Oversikt over midtlinjesporing - Midtlinjen til enkeltcellen oppnås ved å beregne skjelettet (hvitt). Spissen (magenta) ekstrapoleres lineært fra de siste punktene i enden av skjelettet (trinn 1.3). I denne sammensetningen legges både midtlinjen og spissen over den opprinnelige cellen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Timelapse's kymographs- Sammenligning av kymographs for hver kanal generert med "complete_skeletonization" slått av (trinn 1.4). Den vertikale aksen beskriver tidens progresjon, og den horisontale aksen plotter den gjennomsnittlige intensiteten til den ekstrapolerte midtlinjebanen etterfulgt av en enkelt celle. For disse dataene representerer fargekartet følgende verdier for Kanal 1 Laveste intensitet: 2886, Median: 3167, Høyeste intensitet: 21021. Kanal 2 Laveste intensitet: 3030, Median: 3400, Høyeste intensitet: 29688. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Bakgrunnsterskelutjevning - Bakgrunnssegmenteringsterskelen estimeres via isodataalgoritmen og glattes deretter via lokal polynomregresjon (trinn 1.5). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Ratiometriske resultater- (A) Sammenligning mellom det siste bildet i den ratiometriske tidsforløpet og den segmenterte opprinnelige første kanalen. (B) Kymograph generert fra ratiometric timelapse (trinn 1.5). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
2. Protokoll for batchmodus
- Last ned og plasser filen pipeline.py fra AMEBaS GitHub-depotet i samme katalog som dataene.
- Skriv inn filplasseringen på kommandolinjen etter programfilen.
- Inkluder - -v som et posisjonsargument for å vise de interne trinnene i pipelinen, hvis du ønsker det.
- Inkluder --s for å velge i sigma-verdien som brukes i forbehandlingstrinnet for gaussisk filter som forberedelse til cellesegmentering. Standard er 2.
- Inkluder - -a for å spore midtlinjen for hvert bilde i tidsforløpet. Som standard bruker pipelinen bare den siste rammen.
- Inkluder - -f for å velge brøkdelen [0,1] av skjelettet som skal brukes i interpolasjonen. Standardverdien er 0,25.
- Inkluder -e for å velge lengden i piksler av det ekstrapolerte skjelettet. Standard er -1, som strekker skjelettet opp til nærmeste kant.
- Inkluder -- sf for å velge brøkdelen av fargespekteret som skal flyttes til bakgrunnen i ikke-ekstrapolerte kymographs. Standardverdien er 0,7.
- Inkluder - -k for å bestemme størrelsen på kjernen som brukes i kymograph Gaussian filtrering. Standard er 3.
- Inkluder -- eb for å estimere global bakgrunnsterskelintensitet via LOESS-polynomregresjon av de rammespesifikke bakgrunnsterskelintensitetene.
- Tilpass antall punkter som brukes i LOESS-utjevning av bakgrunnsterskelverdiene ved å endre parameteren - -n. Standardverdien er 40.
- Bytt kanalene som brukes som teller og nevner under forholdsberegninger, inkludert - r eller - -switch_ratio, hvis tidsforløpet har to kanaler. Som standard er den andre kanalen telleren og den første er nevneren.
- Velg om tidsforløpet i forholdet må jevnes ytterligere ut med en middelverdifilterpasning med -- sm-argumentet . Standard er False.
- Inkluder -o for å avvise bildepunkter med unormal intensitet under ratiometrisk tidsforløpsgenerering.
- Velg om bakgrunnen i ratiometriske utdata må eksporteres ved hjelp av argumentet - -b. Standard er False, som erstatter den med nuller.
- Trykk enter for å kjøre. Utdataene genereres i samme katalog som programfilen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AMEBaS-rørledningen automatiserer ekstraksjonen av midtlinjedynamikken til polariserte enkeltceller fra fluorescensmikroskopiske bildestakker, noe som gjør den mindre tidkrevende og mindre utsatt for menneskelige feil. Metoden kvantifiserer disse tidsforløpene ved å generere kymografer og ratiometriske bildestabler (figur 1) i voksende enkeltceller. Det kan justeres for å fungere på migrerende enkeltceller, men ytterligere eksperimenter er nødvendige. AMEBaS er implementert i Python som en interaktiv Jupyter Notebook (beskrevet i avsnittet Interaktiv notisbokprotokoll), noe som gir enklere bruk uten å kreve programmeringserfaring, og som et kommandolinjeverktøy (i seksjonen Batch mode protocol), hvor flere stakker kan analyseres med samme parametersett. Selv om enten en eller to fluorescenskanaler kan brukes, bør ratiometriske sonder med to utslippskanaler gi mer pålitelige resultater, siden fluorescensutslipp av sondens ubundne tilstand kan lindre den romlige heterogeniteten forårsaket av ujevn fordeling av proteinet i cytoplasma.
Pipelinen gir først en binær maske av den største cellen på den sterkeste kanalen, eksportert som en tif-fil med navnet Filename_binary_mask.tiff (figur 2). Terskelestimater oppnådd med isodata for hver kanal blir eventuelt glattet med loess og lagret i tabellen Filename_background_treshold.csv (figur 5). Cellens midtlinje, ekstrahert fra binærmasken, eksporteres som en tif-fil med navnet Filename_skeletonized.tiff (figur 3). Kymographs av hver kanal er produsert fra midtlinjen, kalt Filename_kymograph_c_ * .csv, hvor * tilsvarer kanalnummeret (figur 4). Til slutt lagres en ratiometrisk kymograph som Filename_kymograph_ratio.csv, mens den fullstendige ratiometriske stakken heter Filename_ratiometric.tiff (figur 6). Plott som tilsvarer figur 2, figur 3, figur 4, figur 5 og figur 6, lagres eventuelt som PNG-filer når 'verbose == True' eller '--v' er spesifisert av brukeren i den første kodebiten (trinn 1.1).
Disse resultatene kan kobles til andre bildeanalyserørledninger for å undersøke cellens spatiotemporale dynamikk ytterligere, for eksempel CHUKNORRIS8, som tar kymografene til hver kanal som inngang og utfører veksthastighetsanalyse med subpikseloppløsning, sammen med ulike tidsserieanalysemetoder.
AMEBaS ble testet på pollenrørdatasett med genetisk kodede ratiometriske fluorescerende reportere for intracellulær Ca2+ (CaMeleon; Figur 7A,B) og H+ (pHluorin; Figur 7C,D) konsentrasjoner oppnådd på et optisk fluorescensmikroskop, samt maksimal intensitetsprojeksjon av cpVenus / CFP-forhold mellom voksende rothår som uttrykker CaMeleon NES-YC3.6 (figur 7E, F) oppnådd på et lysarkmikroskop som tidligere beskrevet 15,16. Rørledningen fungerte vellykket til tross for forskjeller i vekstretning, bildebehandlingsteknikker, fluorescerende reportere og celletyper. Segmentering, midtlinjesporing og kymografekstraksjon vises for disse datasettene (figur 7), noe som viser potensialet for å bruke AMEBaS på et bredt spekter av eksperimentelle oppsett.
Figur 7: Representative resultater for ulike fluorescensbildedatasett av spissvoksendeceller. (A,B) Pollenrør som uttrykker Ca2+ reporteren CaMeleon; (C,D) Pollenrør som uttrykker pH-indikatoren pHluorin; (E,F) Rothår som uttrykker Ca2+ reporteren NES-YC3.6. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende kodefil 1: AMEBaS-main.zip. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den nye metoden som presenteres her er et kraftig verktøy for å effektivisere og automatisere analysen av fluorescensmikroskopiske bildestabler av polariserte celler. Nåværende metoder beskrevet i litteraturen, for eksempel ImageJ Kymograph-plugins, krever manuell sporing av midtlinjen til den polariserte cellen av interesse, en oppgave som ikke bare er tidkrevende, men også utsatt for menneskelige feil. Siden definisjonen av midtlinjen i denne rørledningen støttes av en numerisk metode18,19 som utfører skjelettisering, fjernes subjektiv evaluering, og introduserer en kvantitativ standard for prosedyren. Dette er spesielt nyttig for forskere med store mengder data, med mulighet for å tilpasse rørledningen til forskjellige krav, inkludert å trekke ut midtlinjen for hver ramme. Videre er bakgrunnsverdisubtraksjonen ofte vilkårlig, med en enkelt bakgrunnsverdi valgt for hånd for alle rammer i en gitt kanal. Her brukes isodatasegmentering til objektivt å bestemme bakgrunnsterskelen for hver ramme, glatte den (valgfritt) med en lokal polynomregresjon for å fange langsiktige endringer i fluorescens forårsaket av falming (fotobleking). Mens mulige artefakter og sekundære elementer ignoreres i bakgrunnen ved å velge det større objektet etter pikselområde, kan andre metoder, for eksempel FRET-IBRA12, brukes til å fjerne effekter som skyggelegging. Romlige artefakter (for eksempel skyggelegging) kan påvirke formen på cellen segmentert ved terskelverdi, noe som kan forklare skjevheten til gradienten mot den ene siden av røret som vises i den ratiometriske filmen som vises på AMEBaS-logoen (se GitHub-siden eller Colab-notatboken).
Likevel er det fortsatt noen få situasjoner der den presenterte rørledningen kan mislykkes og ikke bør betraktes som en sølvkuleløsning. Spesiell oppmerksomhet må betales under bildeopptak fordi store forstyrrelser kan svekke algoritmens evne til å segmentere målcellen. Forbehandling av bildestakken bør vurderes for optimale resultater, fjerning av uønskede elementer og generelt defekte rammer.
Parametere ble valgt med sikte på å analysere enkelt apikalt voksende celler med tanke på begrenset datasett av Arabidopsis pollenrør som analyserer ioniske konsentrasjoner med fluorescerende reportere. Dermed kan andre data kreve fornuftige valg av parametere. Forbehandlingsfiltre jevner ut dataene med sikte på å produsere en ren binær maske etter segmentering (trinn 1.2), slik at sigmaverdien som brukes for Gauss- og medianfiltrene, kan økes for mer støyende data eller reduseres hvis resultatene blir altfor glatte. Plasseringen av den binære masken oppnådd i den sterkeste kanalen antas å være den samme som den svakeste kanalen, noe som kan være et problem hvis celleplasseringen ikke er den samme i begge kanaler. Hvis dette er tilfelle, må enten forskjellige masker brukes for hver kanal eller bilderegistrering må utføres, som gjort i FRET-IBRA12.
Skjelettisering gjøres utelukkende i den siste rammen (trinn 1.3) som standard, som antar en spissvoksende celle som opprettholder plasseringen av cytoplasma over tid (annet enn ved toppunktet). Ved å utvide skjelettet, Det er mulig å generere kymographs som tillater analyse av vekstraten, selv med subpixel oppløsning, ved hjelp av metoder som CHUKNORRIS8. Denne utvidelsen gjøres ved lineær ekstrapolering med tanke på de første 25% punktene i den voksende spissen av skjelettet (trinn 1.3) og kan justeres ved å justere interpolation_fraction fra 0% til 100% punkter av hele skjelettet. Men hvis cellen driver på plass mellom rammer eller er en migrerende celle, blir veksthastighetsanalysen mer kompleks. I et slikt scenario kan uavhengige skjeletter genereres for hver ramme med valg av parametere complete_skeletonization=TRUE, som vil produsere skjeletter uten ekstracellulær forlengelse. Det ville fortsatt være mulig å analysere vekstraten, men oppløsningen ville være begrenset av den binære masken produsert med isodata terskel. Videre antar den resulterende kymograph at påfølgende skjeletter kan justeres etter deres standard koordinater, som, hvis ikke sant, gjør det uegnet til å analysere intracellulær dynamikk.
Når du genererer kymographs (trinn 1.4), bruker AMEBaS gjennomsnitt med en Gaussian kjerne i stedet for å bruke den tradisjonelle pixel margin rundt midtlinjen. Standardverdien på 3x3 er den minste mulige størrelsen, som kan økes hvis dataene er for støyende og/eller hvis cellen er stor. Dette trinnet kan imidlertid føre til overutjevning, i så fall bør filteret slås helt av ved å stille inn kymograph_kernel = 0. Til slutt kan bakgrunnen som er beregnet for hver ramme i hver kanal, glattes ut når brukeren forventer falming (fotobleking) eller ved hjelp av råestimatene (trinn 1.5). Utjevning av bakgrunnsverdiene med LOESS-polynomregresjon (trinn 1.5) kan stilles inn ved å sette antall punkter som brukes i vinduet n_points til minimum 3 og maksimalt antall bilder i stakken (avkortet automatisk). En enklere funksjon som beskriver bakgrunnsendringen over tid kan oppnås med et større vindu, noe som gir en grovere passform.
Siden denne metoden konsoliderer flere manuelle trinn som vanligvis utføres av forskere, er AMEBaS-rørledningen et mer effektivt, objektivt og presist tilnærmingsverktøy for å analysere den spatiotemporale oppførselen til enkeltpolariserte celletider. I fremtiden har denne metoden potensial til å bli utvidet for å støtte analysen av migrerende enkeltceller. Videre er ytterligere analyse nødvendig for å vurdere ytelsen til denne metoden over et bredere spekter av celletyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne av dette manuskriptet oppgir ingen konkurrerende økonomiske interesser eller andre interessekonflikter.
Acknowledgments
Forfatterne er takknemlige for FAPESP tilskudd 2015/22308-2, 2019/23343-7, 2019/26129-6, 2020/06744-5, 2021/05363-0, CNPq, NIH R01 stipend GM131043 og NSF tilskudd MCB1714993, MCB1930165 for økonomisk støtte. Rothårdata ble produsert med infrastrukturen og under tilsyn av professor Andrea Bassi og professor Alex Costa.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
- Drubin, D. G., Nelson, W. J.
- Wodarz, A., Näthke, I. Cell polarity in development and cancer. Nature Cell Biology. 9 (9), 1016-1024 (2007).
- Palanivelu, R., Preuss, D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms. Trends in Cell Biology. 10 (12), 517-524 (2000).
- Portes, M. T., et al. The Pollen Tube Oscillator: Integrating Biophysics and Biochemistry into Cellular Growth and Morphogenesis. Rhythms in Plants: Dynamic Responses in a Dynamic Environment. , Springer. Cham. (2015).
- Wudick, M. M., et al. CORNICHON sorting and regulation of GLR channels underlie pollen tube Ca2+ homeostasis. Science. 360 (6388), 533-536 (2018).
- Hoffmann, R. D., et al. Plasma membrane H+-ATPases sustain pollen tube growth and fertilization. Nature Communications. 11 (1), 1-15 (2020).
- Michard, E., et al. Glutamate receptor-like genes form Ca2+ channels in pollen tubes and are regulated by pistil D-serine. Science. 332 (6028), 434-437 (2011).
- Damineli, D. S., Portes, M. T., Feijó, J. A. Oscillatory signatures underlie growth regimes in Arabidopsis pollen tubes: computational methods to estimate tip location, periodicity, and synchronization in growing cells. Journal of Experimental Botany. 68 (12), 3267-3281 (2017).
- Li, K., et al. An optimized genetically encoded dual reporter for simultaneous ratio imaging of Ca2+ and H+ reveals new insights into ion signaling in plants. New Phytologist. 230 (6), 2292-2310 (2021).
- Sadoine, M., et al. Designs, applications, and limitations of genetically encoded fluorescent sensors to explore plant biology. Plant Physiology. 187 (2), 485-503 (2021).
- Grenzi, M., et al. Illuminating the hidden world of calcium ions in plants with a universe of indicators. Plant Physiology. 187 (2), 550-571 (2021).
- Munglani, G., Vogler, H., Grossniklaus, U. Fast and flexible processing of large FRET image stacks using the FRET-IBRA toolkit. PLoS Computational Biology. 18 (4), 1009242 (2022).
- Ridler, T., Calvard, S. Picture thresholding using an iterative selection method. IEEE Transactions on Systems, Man, and Cybernetics. 8 (8), 630-632 (1978).
- Portes, M. T., Feijó, J. Growing Arabidopsis pollen tubes expressing genetically encoded reporters for calcium and pH. , (2023).
- Candeo, A., Doccula, F. G., Valentini, G., Bassi, A., Costa, A. Light sheet fluorescence microscopy quantifies calcium oscillations in root hairs of Arabidopsis thaliana. Plant & Cell Physiology. 58 (7), 1161-1172 (2017).
- Romano Armada, N., et al. In vivo light sheet fluorescence microscopy of calcium oscillations in Arabidopsis thaliana. Methods in Molecular Biology. 1925, 87-101 (2019).
- Krebs, M., et al. FRET-based genetically encoded sensors allow high-resolution live cell imaging of Ca2+ dynamics. The Plant Journal. 69 (1), 181-192 (2012).
- Lee, T. -C., Kashyap, R. L., Chu, C. -N. Building skeleton models via 3-D medial surface axis thinning algorithms. CVGIP: Graphical Models and Image Processing. 56 (6), 462-478 (1994).
- Nunez-Iglesias, J., Blanch, A. J., Looker, O., Dixon, M. W., Tilley, L. A new Python library to analyse skeleton images confirms malaria parasite remodelling of the red blood cell membrane skeleton. PeerJ. 6, 4312 (2018).
