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Methodenartikel

Das Modell der Chorioallantoismembran (CAM) von Küken als Werkzeug zur Untersuchung der Transplantation von Eierstockgewebe

2.5K Aufrufe

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DOI:

10.3791/64867

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23. Juni 2023

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In diesem Artikel

Zusammenfassung

In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll für die Entwicklung eines Xenotransplantatmodells für menschliches Ovarialgewebe und demonstrieren die Wirksamkeit der Technik, den Zeitrahmen für die Revaskularisierung des Transplantats und die Lebensfähigkeit des Gewebes über einen Zeitraum von 6 Tagen.

Zusammenfassung

Die Kryokonservierung und Transplantation von Eierstockgewebe ist eine wirksame Strategie zur Erhaltung der Fruchtbarkeit, hat jedoch einen großen Nachteil, nämlich den massiven Follikelverlust, der kurz nach der Reimplantation aufgrund einer abnormalen Follikelaktivierung und des Todes auftritt. Nagetiere sind Benchmark-Modelle für die Untersuchung der Follikelaktivierung, aber die Kosten, der Zeitaufwand und die ethischen Überlegungen werden immer unerschwinglicher, was die Entwicklung von Alternativen vorantreibt. Das Modell der Chorioallantoismembran (CAM) von Küken ist besonders attraktiv, da es kostengünstig ist und die natürliche Immundefizienz bis zum Tag 17 nach der Befruchtung aufrechterhält, was es ideal für die Untersuchung der kurzfristigen Xenotransplantation von menschlichem Eierstockgewebe macht. Das CAM ist auch stark vaskularisiert und wurde häufig als Modell zur Erforschung der Angiogenese verwendet. Dies verschafft ihm einen bemerkenswerten Vorteil gegenüber In-vitro-Modellen und ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen, die den frühen Follikelverlustprozess nach der Transplantation beeinflussen. Das hier beschriebene Protokoll zielt darauf ab, die Entwicklung eines CAM-Xenografting-Modells für menschliches Ovarialgewebe zu beschreiben, mit spezifischen Einblicken in die Wirksamkeit der Technik, den Zeitrahmen für die Revaskularisierung des Transplantats und die Lebensfähigkeit des Gewebes über einen Transplantationszeitraum von 6 Tagen.

Einleitung

Die Nachfrage nach Fertilitätserhalt bei onkologischen und gutartigen Indikationen sowie aus sozialen Gründen ist in den letzten Jahrzehnten dramatisch gestiegen. Verschiedene Behandlungen, die zur Heilung von bösartigen und nicht-bösartigen Erkrankungen eingesetzt werden, sind jedoch hochtoxisch für die Keimdrüsen und können zu einer iatrogenen vorzeitigen Ovarialinsuffizienz führen, die letztendlich zu Unfruchtbarkeit führt1. Zu den etablierten Techniken zur Erhaltung der Fruchtbarkeit gehören die Kryokonservierung von Embryonen, die Vitrifikation unreifer oder reifer Eizellen und die Kryokonservi....

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Protokoll

Die Verwendung von menschlichem Gewebe wurde vom Institutional Review Board der Katholischen Universität Löwen genehmigt. Die Patientinnen gaben ihre schriftliche Einverständniserklärung für die Verwendung ihres Eierstockgewebes zu Forschungszwecken.

1. Bestellung von Eizellen vom Tag 0, bei denen die Wahrscheinlichkeit hoch ist, dass sie embryoniert werden

  1. Finden Sie einen zertifizierten, von Lohman ausgewählten Lieferanten von weißen Leghorn-Eiern in Laborqualität, der eine hohe Rate an embryonierten Eiern meldet, die in erster Linie vom Alter der Küken abhängt.

2. Vorbere....

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Ergebnisse

Überlebensraten von Kükenembryonen
Die Überlebensrate des Embryos vom Fenstering (Tag 3 der ED) bis zur Transplantation von Eierstockgewebe (Tag 7 der ED) betrug 79% (33/42). Da der prozentuale Anteil der embryonierten Tag-0-Eier unbekannt ist, wurden überzählige Tag-0-Eier von Lohman-selektierten weißen Leghorn-Hühnern bestellt, um sicherzustellen, dass genügend embryonierte Eizellen für die Transplantation zur Verfügung stehen. Insgesamt wurden 23 lebensfähige Eizellen am Tag 7 für die Transplantati.......

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Diskussion

Der schwierigste Teil des hier beschriebenen Protokolls besteht darin, das kleine Loch zu bohren, das zum Absaugen des Eiweißes erforderlich ist, um das CAM von der Eierschale zu lösen, bevor ein Fenster entsteht. Zu viel Druck kann zu einer übermäßigen Penetration führen oder sogar die Eizelle zerbrechen und zerstören, was zu einer unwiderruflichen Schädigung des CAM und seines Gefäßsystems führt. Um Fehler bei den ersten Versuchen, das CAM zu trennen, auf ein Minimum zu reduzieren, wird dringend empfohlen, das Bohren k.......

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Danksagungen

Die Autoren danken Mira Hryniuk, BA, für die Durchsicht der englischen Sprache des Artikels.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Agani Injektionsnadel, 19 GTerumo EuropeAN*1950R119 G Nadel zum Aspirieren von Albumin
Terumo Spritze, 5 mL konzentrischer Luer-LockTerumo EuropeSS*05LE15 ml sterile Spritze
Caseviewer v2.23DHISTECHBildanalysesoftware
DiethyletherMerck Chemicals603-022-00-4Steriler Ether zur Traumatisierung des CAM
Eosin Y wässrige Lösung 0,5%Merck1098441000Färbelösung
Formaldehyd 4% wässrige Lösung gepuffert (Formalin 10%)VWR97139010Formaldehyd zur Gewebefixierung
KühlschrankLiebherr7081260Kühlschrank bei 4 > C für die Paraffineinbettung
HeizplatteSchottSLK2Heizplatte zum Trocknen der Objektträger
InkubatorThermo Forma Scientific 311110365156Ofen für die Objektträgerinkubation
Leica CLS 150 XE Mikroskop KaltlichtquelleLeicaCLS 150 XEBrennweite Kaltlichtquelle zum Kerzen der Eier
Linsenreinigungstuch, Güteklasse 541VWR111-5003Gewebe zum Einweichen in sterilem Äther zur Traumatisierung des CAM
Mayer's HämatoxylinMERCK1092491000Färbelösung
MethanolVWR20847307Methanol
MikrotomThermoScientific-MICROMHM325-2Mikrotom
Pannoramic P250 Flash III3DHISTECH/Slide Scanner bei 20-facher Vergrößerung
Paraformaldehyd Merck1,04,00,51,000Paraffin-Einbettlösung
Paraplast Plus RSigmaP3683-1KGParaffin-Petrischale
, 60x15 mm, sterilGreiner628161sterile Petrischale
Pin-HalterFine Science Tools26016-12Pin-Halter
PolyhatchBrinseaCP01FEi-Inkubator mit automatischem Rotator
Dekupiersägeblatt, 132 mmSencys/Sägeblatt zum Erstellen eines Fensters in der Eierschale
Einsatzstifte aus EdelstahlFine Science Tools26007-02Gerader Stift zum Bohren eines Lochs in die Eierschale
Steril-Helios Angelantoni IndustrieST-00275400000Laminar-Flow-Haube
Superfrost Plus Bords Stab é s 90°;VWR631-9483Objektträger 
Tissue-Tek VIP 6AlSakura60320417-0711 VID6E3-1Automatisches Einbettungsgerät
TitanzangeFine Science Tools11602-16Pinzette für die Entfernung von Eierschalen und die Manipulation von Eierstockgewebe
Toluol, paVWR28701364Paraffineinbettlösung

Referenzen

  1. Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. Ovarian tissue and oocyte cryopreservation prior to iatrogenic premature ovarian insufficiency. Best Practice & Research Clinical Obstetrics & Gynaecology. 81, 119-133 (2022).
  2. Dolmans, M. -M., Hossay, C., Nguyen, T. Y. T., Poirot, C.

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Nachdrucke und Genehmigungen

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