Erzeugung und Kultivierung von hochgradigen serösen Ovarialkarzinom-Organoiden, die von Patientinnen stammen

Zusammenfassung

Patient-derived Organoids (PDO) sind eine dreidimensionale (3D) Kultur, die die Tumorumgebung in vitro nachahmen kann. Bei hochgradigem serösem Ovarialkarzinom stellen PDOs ein Modell zur Untersuchung neuartiger Biomarker und Therapeutika dar.

Zusammenfassung

Organoide sind dynamische 3D-Tumormodelle, die erfolgreich aus patientischem Ovarialtumorgewebe, Aszites oder Pleuraflüssigkeit gezüchtet werden können und bei der Entdeckung neuartiger Therapeutika und prädiktiver Biomarker für Eierstockkrebs helfen. Diese Modelle rekapitulieren die klonale Heterogenität, die Tumormikroumgebung sowie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen. Darüber hinaus wurde gezeigt, dass sie morphologisch, zytologisch, immunhistochemisch und genetisch mit dem Primärtumor übereinstimmen. So erleichtern Organoide die Erforschung von Tumorzellen und der Tumormikroumgebung und sind Zelllinien überlegen. Das vorliegende Protokoll beschreibt verschiedene Methoden zur Erzeugung von von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden aus Patiententumoren, Aszites und Pleuraflüssigkeitsproben mit einer Erfolgsrate von mehr als 97%. Die Patientenproben werden sowohl durch mechanischen als auch durch enzymatischen Aufschluss in zelluläre Suspensionen getrennt. Die Zellen werden dann mit einem Basalmembranextrakt (BME) plattiert und mit optimierten Wachstumsmedien unterstützt, die Nahrungsergänzungsmittel enthalten, die spezifisch für die Kultivierung von hochgradigem serösem Ovarialkarzinom (HGSOC) sind. Nach der Bildung der ersten Organoide können die PDOs eine Langzeitkultur aufrechterhalten, einschließlich der Passage zur Expansion für nachfolgende Experimente.

Einleitung

Im Jahr 2021 wurde bei etwa 21.410 Frauen in den Vereinigten Staaten neu epithelialer Eierstockkrebs diagnostiziert, und 12.940 Frauen starben an dieser Krankheit¹. Obwohl in der Chirurgie und Chemotherapie ausreichende Fortschritte erzielt wurden, entwickeln über 70% der Patienten mit fortgeschrittener Erkrankung eine chemotherapeutische Resistenz und sterben innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose ^2,3. Neue Strategien zur Behandlung dieser tödlichen Krankheit und repräsentative, verlässliche Modelle für die präklinische Forschung sind daher dringend erforderlich.

Protokoll

Alle menschlichen Gewebeproben, die für Forschungszwecke gesammelt wurden, wurden gemäß dem vom Institutional Review Board (IRB) genehmigten Protokoll gewonnen. Die unten beschriebenen Protokolle wurden in einer sterilen menschlichen Gewebekulturumgebung durchgeführt. Die schriftliche Einverständniserklärung wurde von menschlichen Probanden eingeholt. Geeignete Patienten mussten eine Diagnose oder vermutete Diagnose von Eierstockkrebs haben, bereit und in der Lage sein, eine Einverständniserklärung zu unterschreiben, und mindestens 18 Jahre alt sein. Tumorgewebe (bösartiger Primärtumor oder metastasierende Stellen), Aszites und Pleuraflüssigkeit wurden von einwilligen....

Ergebnisse

Um PDOs zu erzeugen, wurden die Proben mechanisch und enzymatisch zu Einzelzellsuspensionen aufgeschlossen. Die Zellen wurden dann in BME resuspendiert und mit speziell hergestellten Medien ergänzt (Abbildung 3). Organoide werden in der Regel über einen Zeitraum von 10 Tagen etabliert, danach zeigen sie diskrete Organoide in Kultur (Abbildung 4).

Diskussion

Eierstockkrebs ist aufgrund seines fortgeschrittenen Stadiums bei der Diagnose sowie der häufigen Entwicklung einer Chemotherapieresistenz extrem tödlich. Viele Fortschritte in der Eierstockkrebsforschung wurden durch die Verwendung von Krebszelllinien und PDX-Modellen erzielt. Es besteht jedoch ein offensichtlicher Bedarf an einem repräsentativeren und erschwinglicheren In-vitro-Modell . PDOs repräsentieren nachweislich die Tumorheterogenität, die Tumormikroumgebung sowie die genomischen und transkriptomischen .......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
1 % HEPES	Life Technologies	15630080
1 % Penicillin-Streptomycin	Fisher Scientific	30002CI
1,5 mL Eppendorf Röhrchen	Genesee Scientific	14125
10 cm Gewebekulturschale	TPP	93100
10 mL Serologische Pipette
100 & Mikro; m Cell Filter	MidSci	100ICS
15 mL Zentrifugenröhrchen	Corning	430052
2 mL Cryovial	Simport Scientific	T301-2
2% Paraformaldehyd Fixativ	Sigma-Aldrich
37 ° C Wasserbad	NEST	602052
3dGRO R-Spondin-1 Conditioner Media Supplement	Millipore Sigma	SCM104
6-Well-Platten	TPP	92006
70% Ethanol	Sigma-Aldrich	R31541GA
A83-01	Sigma-Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	ThermoFisher	12634028
Agar	Lamda Biotech	C121
B-27	Life Technologies	17504044
Zentrifuge
Cultrex Typ 2	R& D Systems	3533-010-02	Basalmembran-Extrakt
DNase I	New England Bio Labs	M0303S
DNase I Reaktionspuffer	New England Bio Labs	M0303S
EGF	PeproTech	AF-100-15
FBS	Sigma-Aldrich	F2442
FGF-10	PeproTech	100-26
FGF2	PeproTech	100-18B
gentleMACS C Tubes	Miltenyi BioTech	130-096-334
gentleMACS Octo Dissoziator mit Heizelementen	Miltenyi BioTech	130-096-427	Wir verwenden das Protokoll des Herstellers.
GlutaMAX	Life Technologies	35050061	Dipeptid-, L-Alanyl-L-Glutamin-Hämatoxylin
und Eosin-Färbeset	Fisher Scientific	NC1470670
Histoplast Paraffinwachs	Fisher	Scientific 22900700
Mikrozentrifuge
Mr. Frosty Gefrierbehälter	Fisher Scientific	07202363S
N-Acetylcystein	Sigma-Aldrich	A9165
Nicotinamid	Sigma-Aldrich	N0636
p1000 Pipette mit Spitzen
p200 Pipette mit Spitzen
Pasteurpipetten 9"	Fisher Scientific	1367820D
PBS	Fisher Scientific	MT21031CM
Pipettierhilfe
Prostaglandin E2	R& D Systems	2296
Puromycin	ThermoFisher	A1113802
Rekombinanter Maus-Noggin	PeproTech	250-38
Recovery Zellkultur-Einfriermedium	Invitrogen	12648010
Lysionspuffer für rote Blutkörperchen	BioLegend	420301 ROCK-Inhibitor
(Y-27632)	R& D Systems	1254/1
SB202190	Sigma-Aldrich	S7076
T75 Kolben	MidSci	TP90076
Gewebekulturhaube
Gewebeeinbettungskassette
TrypLE Express	Invitrogen	12604013	tierischen Ursprungs freies, rekombinantes Enzym
Typ II Kollagenase	Life Technologies	17101015
Vortex

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