Summary
Patientafledte organoider (PDO) er en tredimensionel (3D) kultur, der kan efterligne tumormiljøet in vitro. I højkvalitets serøs kræft i æggestokkene repræsenterer BDO'er en model til at studere nye biomarkører og terapi.
Abstract
Organoider er 3D dynamiske tumormodeller, der kan dyrkes med succes fra patientafledt ovarietumorvæv, ascites eller pleurvæske og hjælpe med opdagelsen af nye terapeutiske og prædiktive biomarkører for kræft i æggestokkene. Disse modeller rekapitulerer klonal heterogenitet, tumormikromiljøet og celle-celle- og cellematrixinteraktioner. Derudover har de vist sig at matche den primære tumor morfologisk, cytologisk, immunhistokemisk og genetisk. Således letter organoider forskning på tumorceller og tumormikromiljøet og er bedre end cellelinjer. Denne protokol beskriver forskellige metoder til at generere patientafledte ovariecancerorganoider fra patienttumorer, ascites og pleurvæskeprøver med en succesrate på mere end 97%. Patientprøverne adskilles i cellulære suspensioner ved både mekanisk og enzymatisk fordøjelse. Cellerne belægges derefter ved hjælp af et kældermembranekstrakt (BME) og understøttes med optimerede vækstmedier, der indeholder kosttilskud, der er specifikke for dyrkning af højkvalitets serøs ovariecancer (HGSOC). Efter dannelse af indledende organoider kan BOB'erne opretholde langsigtet kultur, herunder passaging til ekspansion til efterfølgende eksperimenter.
Introduction
I 2021 blev cirka 21,410 kvinder i USA nyligt diagnosticeret med epitelial kræft i æggestokkene, og 12,940 kvinder døde af denne sygdom1. Selvom der er gjort tilstrækkelige fremskridt inden for kirurgi og kemoterapi, udvikler over 70% af patienterne med avanceret sygdom kemoterapeutisk resistens og dør inden for 5 år efter diagnose 2,3. Derfor er der et presserende behov for nye strategier til behandling af denne dødelige sygdom og repræsentative, pålidelige modeller for præklinisk forskning.
Kræftcellelinjer og patientafledte xenotransplantater (PDX) skabt af primære ovarietumorer er de vigtigste instrumenter, der anvendes i forskning i kræft i æggestokkene. En stor fordel ved kræftcellelinjer er deres hurtige ekspansion. Imidlertid resulterer deres kontinuerlige kultur i fænotypiske og genotypiske ændringer, der får kræftcellelinjerne til at afvige fra den oprindelige primære kræfttumorprøve. På grund af de eksisterende forskelle mellem kræftcellelinjen og den primære tumor har lægemiddelanalyser, der har positive virkninger i cellelinjer, ikke de samme virkninger i kliniske forsøg2. For at overvinde disse begrænsninger anvendes PDX-modeller. Disse modeller er skabt ved at implantere frisk ovariecancervæv i immundefekte mus. Da de er in vivo-modeller , ligner de mere nøjagtigt menneskelige biologiske egenskaber og er igen mere forudsigelige for lægemiddelresultater. Disse modeller har dog også betydelige begrænsninger, herunder omkostninger, tid og ressourcer, der er nødvendige for at generere dem4.
BDO'er tilbyder en alternativ model til præklinisk forskning, der overvinder begrænsningerne i både kræftcellelinjer og PDX-modeller. BDO'er rekapitulerer en patients tumor- og tumormikromiljø og giver således en in vitro-medgørlig model, der er ideel til præklinisk forskning 2,3,5. Disse 3D-modeller har selvorganiseringsfunktioner, der modellerer den primære tumor, hvilket er en funktion, som deres todimensionelle (2D) cellelinjemodstykker ikke besidder. Desuden har disse modeller vist sig at genetisk og funktionelt repræsentere deres modertumorer og er således pålidelige modeller til undersøgelse af nye terapeutiske og biologiske processer. Kort sagt tilbyder de langsigtede ekspansions- og lagringsfunktioner, der ligner cellelinjer, men omfatter også mikromiljøet og celle-celle-interaktioner, der er forbundet med musemodeller 4,6.
Denne protokol beskriver oprettelsen af BDO'er fra patientafledte tumorer, ascites og pleurvæskeprøver med en succesrate på mere end 97%. BOB-kulturerne kan derefter udvides i flere generationer og bruges til at teste lægemiddelterapifølsomhed og prædiktive biomarkører. Denne metode repræsenterer en teknik, der kan bruges til at personalisere behandlinger baseret på de terapeutiske reaktioner fra BDO'er.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle humane vævsprøver indsamlet til forskning blev opnået i henhold til Institutional Review Board (IRB) -godkendt protokol. De protokoller, der er skitseret nedenfor, blev udført i et sterilt humant vævskulturmiljø. Der blev indhentet informeret skriftligt samtykke fra mennesker. Egnede patienter skulle have en diagnose eller formodet diagnose af kræft i æggestokkene, være villige og i stand til at underskrive informeret samtykke og være mindst 18 år. Tumorvæv (ondartet primær tumor eller metastatiske steder), ascites og pleurvæske blev opnået fra samtykkende patienter på tidspunktet for deres procedure. Disse prøver blev straks transporteret til laboratoriet og behandlet til organoidgenerering ved hjælp af nedenstående metoder.
1. Forberedelse af medier
- Komplet organoid medieforberedelse
- Forbered R-spondin 1/Noggin konditioneret medium efter en tidligere offentliggjort rapport7.
BEMÆRK: R-spondin-1 / Noggin konditioneret medium er et mere overkommeligt alternativ til kommercielt tilgængelige rekombinante proteiner. HEK293T-celler, der stabilt udskiller R-spondin-1 og Noggin via lentivirusmedieret transduktion, var en generøs gave fra Ron Bose, Washington University School of Medicine i St. Louis, og Anil Rustgi, New York-Presbyterian / Columbia University Irving Medical Center 8,9,10. Kommercielt konditioneret medium kan anvendes som erstatning (se materialetabel).
- Forbered R-spondin 1/Noggin konditioneret medium efter en tidligere offentliggjort rapport7.
- For at fremstille det komplette organoidmedium kombineres 10% R-spondin 1/Noggin konditioneret medium, 50 ng/ml EGF, 10 ng/ml FGF-10, 10 ng/ml FGF2, 1x B27, 10 mmol/L nikotinamid, 1,25 mmol/L N-acetylcystein, 1 μmol/L prostaglandin E2, 10 μmol/L SB202190, 500 nmol/L A83-01 og 10 μM ROCK-hæmmer (se materialetabel).
BEMÆRK: Mediet kan opbevares ved 4 °C i op til 3 måneder. Dette medium blev tilpasset fra Hill et al.11. Koncentrationerne og ingredienserne i mediet er de samme med tilsætning af en ROCK-hæmmer. - Forbered organoidbasemedium ved at kombinere 500 ml af en avanceret formulering af DMEM / F12 med 1% penicillin-streptomycin, 1x dipeptid, L-alanyl-L-glutamin og 1x HEPES (10 mM) (se materialetabel).
2. Høstning af organoider fra ascites og pleurvæske
BEMÆRK: Ascites og pleurvæske skal behandles så hurtigt som muligt for det bedste udbytte af organoider. Optøning har tidligere aliquoteret BME, DNase I og DNase I reaktionsbuffer (se materialetabel) ved at lægge den på is, indtil indholdet er flydende.
- Få ascites og pleurvæske fra samtykkende patienter på tidspunktet for standardplejeoperationer eller procedurer, og transporter ved stuetemperatur i en rejsebeholder til laboratoriet.
BEMÆRK: Al behandling af ascites eller pleurvæske skal udføres i et sterilt miljø. - Overfør 50 ml ascites eller pleurvæske til 50 ml koniske rør (antallet af rør afhænger af mængden af opnåede ascites). Der centrifugeres ved 1.650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Efter centrifugering aspireres supernatanten forsigtigt med en Pasteur-pipette af glas.
- Fortsæt med at tilsætte 50 ml ascites eller pleurvæske til den tidligere centrifugerede pellet, og centrifuger igen ved 1.650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Supernatanten suges forsigtigt til med en Pasteur-pipette af glas. Gentag dette trin, indtil alle ascites eller pleurvæske er blevet behandlet.
- Forbered en 100 μg/ml DNase I-opløsning ved at kombinere 1.000 μL nukleasefrit vand, 100 μL DNase I-reaktionsbuffer og 10 μL DNase I.
BEMÆRK: DNase I-behandlingen er tilstrækkelig til at fremstille en enkeltcellesuspension uanset tilstedeværelsen af celleaggregater i nogle patientprøver12. - Hver cellepellet resuspenderes i 1 ml 100 μg/ml DNase I-opløsning. Tilsæt forsigtigt DNase I-opløsningen dråbevis, og lad røret inkubere i 15 minutter ved stuetemperatur.
BEMÆRK: Tilføj mindst 1 ml DNase I-opløsning. Hvis 1 ml ikke er nok til at forstyrre pelleten, tilsættes yderligere 1 ml. - Efter inkubation tilsættes 25 ml organoid basemedium (trin 1.3) til cellerne og inverteres forsigtigt for at blande. Derefter centrifugeres ved 1.650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Efter centrifugeringen suges supernatanten forsigtigt til med en Pasteur-pipette af glas.
- Resuspender de nydannede cellepiller i forvarmede 5 ml 1x røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer (se materialetabel). Indstil hvirvelstrømmen til 458 x g, og hvirvel opløsningerne i hvert konisk rør. Når opløsningerne er homogene, skal du bruge en serologisk pipet til at kombinere indholdet af alle de koniske rør i et enkelt 50 ml konisk rør.
- Inkuber det koniske rør indeholdende hvirvelopløsningen ved stuetemperatur i 5 min. Når inkubationen er afsluttet, centrifugeres ved 1 650 x g i 5 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Undersøg pelleten. En lyserød / rød pellet indikerer tilstedeværelsen af RBC'er, hvilket ville kræve, at RBC-lysisbuffertrinnet gentages, indtil pelleten ikke længere er rød. - Efter centrifugeringen suges supernatanten forsigtigt til med en Pasteur-pipette af glas. Derefter vaskes pelleten med 10 ml PBS, hvirvelopløsningen ved 458 x g og centrifugeres ved 1.650 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Hvis der dannes en storcellet pellet, aspireres PBS ved hjælp af en glaspasteurpipette, og der tilsættes 1 ml organoidt basemedium (trin 1.3) oven på pelleten. Vortex opløsningen ved 458 x g, og overfør 300-400 μL til et mikrocentrifugerør. Mikrocentrifugeglasset centrifugeres ved 1,650 x g i 5 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Den del af cellepelleten, der ikke placeres i mikrocentrifugerøret, kan fryses ned til fremtidig brug (500 μL celler til 1 ml 10% DMSO i FBS). Den frosne cellepille kan opbevares i uger ved -80 °C og i årevis, hvis den placeres i flydende nitrogen13. - Det organoide basismedium (trin 1.3) aspireres forsigtigt med en Pasteur-pipette af glas, og det opslæmmes igen i BME (se materialetabellen) med kolde spidser.
BEMÆRK: Mængden af BME er baseret på pelletens størrelse. Det anbefales at anvende 25 % organoidbasemedium (trin 1.3) med resuspenderede celler til 75 % BME. - Plade 40 μL alikvoter af den opslæmmede celleopløsning på en 6-brønds plade. Plade op til fem delprøver pr. hul (figur 1).
- Pladen anbringes straks i en 37 °C inkubator i 20 minutter for at lade BME størkne. Efter inkubation tilsættes forsigtigt 2 ml komplet organoidmedium (trin 1.2) i hvert hul.
Figur 1: Plating af patientafledte ovariecancerorganoider. Repræsentativt billede af organoidbelægningen. Alikvoter af organoidblandingen er omhyggeligt belagt, hvilket sikrer, at der ikke dannes bobler. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Høstning af organoider fra væv
BEMÆRK: Væv skal behandles så hurtigt som muligt for det bedste udbytte af organoider.
- Saml og transporter tumoren på is i en rejsebeholder indeholdende PBS.
- Prøven anbringes på en 10 cm vævskulturskål (figur 2). Brug en engangsskalpel til at hakke vævet. Brug derefter den kedelige ende af en engangssprøjte til at knuse vævet, indtil der er skabt en homogen blanding.
- Brug tang til at placere den homogene vævsblanding i et dissociationsrør. For hver 1-2 ml homogeniseret væv tilsættes 7-8 ml 1 mg/ml type II collagenaseopløsning (se materialetabel) i organoid basemedium (trin 1.3) og 1 ml DNase I-opløsning. Vortex opløsningen ved 458 x g.
BEMÆRK: Mængden af væv bestemmer mængden af kollagenaseopløsning og antallet af nødvendige rør. - Brug dissociationsmaskinen (se materialetabellen) til at gøre vævet flydende, mens det er i kollagenaseopløsningen. Kør programmet 37C_h_TDK3 (1 time), indtil det er en enkeltcellesuspension.
BEMÆRK: Programmet skal køres igen, hvis den resulterende blanding ikke er homogen (dvs. hvis vævsstykker stadig er til stede i blandingen). Hvis vævet fordøjes, men opløsningen er tyktflydende, fortyndes med organoid basemedium (trin 1.3). - Den homogeniserede blanding overføres til et nyt 50 ml konisk rør, og der tilsættes 20-40 ml organoidt basemedium (trin 1.3). Derefter filtreres opløsningen gennem en 100 μm cellesil i et nyligt mærket 50 ml konisk rør.
- Den filtrerede blanding centrifugeres ved 1,650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Derefter suges supernatanten forsigtigt til med en Pasteur-pipette af glas.
- Forbered en 100 μg/ml DNase I-opløsning ved at kombinere 1.000 μL nukleasefrit vand, 100 μL DNase I-reaktionsbuffer og 10 μL DNase I.
BEMÆRK: DNase I-behandlingen er tilstrækkelig til at fremstille en enkeltcellesuspension uanset tilstedeværelsen af celleaggregater i nogle patientprøver12. - Resuspender cellerne i 1 ml 100 ug/ml DNase I-opløsning. Tilsæt forsigtigt DNase I-opløsningen dråbevis, og lad røret inkubere i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Efter inkubation tilsættes 25 ml organoid basemedium (trin 1.3) til cellerne og inverteres forsigtigt for at blande. Derefter centrifugeres ved 1.650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Efter centrifugeringen suges supernatanten forsigtigt til med en Pasteur-pipette af glas.
- Den nydannede cellepellet resuspenderes i 5 ml forvarmet 1x RBC-lysisbuffer. Vortex opløsningerne i hvert konisk rør ved 458 x g.
- Inkuber det koniske rør indeholdende cellepelleten resuspenderet i RBC-lysebufferen i 5 minutter. Når inkubationen er afsluttet, centrifugeres ved 1 650 x g i 5 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Undersøg pelleten. En lyserød / rød pellet indikerer tilstedeværelsen af RBC'er, hvilket ville kræve, at RBC-lysisbuffertrinnet gentages, indtil pelleten ser hvid ud. - Efter centrifugeringen suges supernatanten forsigtigt til med en Pasteur-pipette af glas. Derefter vaskes pelleten med 10 ml PBS, hvirvelopløsningen ved 458 x g og centrifugeres ved 1.650 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Hvis der dannes en storcellet pellet, aspireres PBS ved hjælp af en glaspasteurpipette, og der tilsættes 1 ml organoidt basemedium (trin 1.3) oven på pelleten. Vortex opløsningen ved 458 x g, og overfør 300-400 μL til et mikrocentrifugerør. Der centrifugeres ved 1.650 x g i 5 minutter ved 4 °C.
BEMÆRK: Den del af cellepelleten, der ikke er placeret i mikrocentrifugerøret, kan fryses ned til fremtidig brug (500 μL celler til 1 ml 10% DMSO i FBS) (trin 5.1). Den frosne cellepille kan opbevares i uger ved -80 °C og i årevis, hvis den placeres i flydende nitrogen13. - Aspirer forsigtigt det organoide basemedium ved hjælp af en glaspasteurpipette, og resuspender i BME ved hjælp af kolde spidser.
BEMÆRK: Mængden af BME er baseret på pelletens størrelse. Det anbefales at tilføje 25 % organoid basemedium (trin 1.3) med resuspenderede celler til 75 % BME. - Den opslæmmede celleopløsning anbringes på en 6-brønds plade i 40 μL alikvoter. Pladen op til fem alikvoter pr. hul.
- Placer straks brøndpladen i inkubatoren i 20 min. Efter inkubation tilsættes forsigtigt 2 ml komplet organoidmedium (trin 1.2) i hvert hul.
Figur 2: Tumorvæv før dissektion. Repræsentativt billede af tumorvæv opnået til organoidgenerering. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Passaging af organoider
BEMÆRK: Hvis prøven er sammenflydende, kan hver organoid brønd passeres ugentligt til to nye brønde.
- Brug en 1 ml pipette til at tilføje 1 ml organoid basemedium (trin 1.3) til hvert hul, og pipette mediet op og ned direkte på organoidtapperne for at adskille det. Alle mediet indeholdende de resuspenderede pellets opsamles i et 15 ml konisk rør.
- Det koniske rør indeholdende blandingen på 15 ml centrifugeres ved 1,650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Derefter suges supernatanten forsigtigt til med en Pasteur-pipette af glas.
- Tilsæt 1 ml animalsk oprindelse-fri, rekombinant enzym (se tabel over materialer) til cellepellet, hvirvel opløsningen ved 458 x g, og overfør til et 1,5 ml mikrocentrifugerør. Lad røret inkubere i 15 minutter i et 37 °C vandbad.
- Efter inkubation centrifugeres ved 1.650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Derefter suges supernatanten forsigtigt til med en Pasteur-pipette af glas.
- Resuspender pellet i BME.
BEMÆRK: Mængden af BME er baseret på pelletens størrelse. Det anbefales at tilføje 25 % organoidbasemedier (trin 1.3) med resuspenderede celler til 75 % BME. - Den opslæmmede celleopløsning plades i en 6-brønds plade i 40 μL alikvoter. Pladen op til fem alikvoter pr. hul. Når alle delprøverne er belagt, anbringes brøndpladen straks i inkubatoren i 20 minutter. Efter inkubation tilsættes forsigtigt 2 ml komplet organoidmedium (trin 1.2) i hvert hul.
5. Frysning og optøning af organoider
- Frysning af organoider
- Begynd med trin 4.1-4.4.
- Resuspender cellepellet i 0,5-1 ml genvindingscellekulturfrysemedium (se materialetabel), og overfør 1 ml til hver kryovial.
- Derefter anbringes kryoialerne i en isopropanolfyldt beholder ved -80 °C i op til 2 uger, før de overføres til en flydende nitrogentank til langtidsopbevaring13.
- Optøning af organoider
- Prøverne fjernes fra væskenitrogentanken, og optøningen foretages ved 37 °C vandbad.
- Når det er optøet, overføres det til et 15 ml konisk rør, og centrifugeres ved 1.650 x g i 5 minutter ved 4 °C. Efter centrifugeringen suges supernatanten forsigtigt til med en Pasteur-pipette af glas.
- Resuspender pellet i BME.
BEMÆRK: Mængden af BME er baseret på pelletens størrelse. Det anbefales at tilføje 25 % organoidbasemedier (trin 1.3) med resuspenderede celler til 75 % BME. - Den opslæmmede celleopløsning anbringes på en 6-brønds plade i 40 μL alikvoter. Anbring op til fem delprøver pr. hul.
- Placer straks pladen i inkubatoren i 20 min. Efter inkubation tilsættes forsigtigt 2 ml komplet organoidmedium (trin 1.2) til brøndene.
6. Indlejring og generering af formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) dias til evaluering af organoidsammensætningen
- Efter dyrkning af organoider i mindst 10 dage for at sikre tilstrækkelig størrelse, fjernes det komplette organoidmedium fra hullerne og tilsættes 1 ml 2% paraformaldehydfikseringsmiddel (PFA). Inkuber ved stuetemperatur i 5-10 min.
- Efter inkubation vaskes de dyrkede organoidalikvoter 3x i 5 minutter hver gang med 1 ml PBS.
- PBS fjernes fra hvert hul, og der tilsættes 1 ml varm 2% agar i deioniseret H2O til hvert hul. Når agaren tilsættes, løftes de dyrkede organoidalikvoter fra pladen ved hjælp af en spatel.
BEMÆRK: Det er vigtigt ikke at lade agaren hærde, før de dyrkede organoidalikvoter løftes.- Lad agaren størkne i brønden ved stuetemperatur.
- Brug en lille spatel til at frigøre den størknede agar fra brønden og opbevare den i en kassette i op til 48 timer (se materialetabellen) ved 4 °C i 70% ethanol, indtil den behandles14.
- Integrer prøverne i paraffin 15, skær diasene til en tykkelse på 5 μm, og pletter diasene med hæmatoxylin og eosin (H&E, se materialetabel) farvning ved hjælp af en standardprotokol15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at generere BDO'er blev prøverne fordøjet mekanisk og enzymatisk i enkeltcellesuspensioner. Cellerne blev derefter resuspenderet i BME og suppleret med specifikt konstruerede medier (figur 3). Organoider etableres typisk over en tidsramme på 10 dage, hvorefter de demonstrerer diskrete organoider i kultur (figur 4).
Figur 3: Skematisk oversigt over patientsamlinger dannet til organoider. Patientvæv, ascites eller pleurvæske fordøjes mekanisk eller enzymatisk. Enkeltcellesuspensionen forgyldes derefter til BME, hvor kulturen formerer sig ved hjælp af specialiserede vækstmedier, der er skræddersyet til HGSOC. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Repræsentative billeder af to unikke patientafledte ovariecancerorganoider efter 7 dages vækst. De organoide billeder blev taget på 40x. Brightfield-skalabjælken på venstre billede er 100 μm og på højre billede er 200 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Fra den præsenterede protokol blev en biobank med 23 organoider produceret og dyrket i over 5 måneder med regelmæssig passage. De kliniske egenskaber ved oprindelsestumorerne er vist i tabel 1. Størstedelen af tumorerne var fremskredne stadier (100%), højkvalitets serøst karcinom (92,9%) og behandling naiv (85,7%).
| N = 23 | |
| Alder (år) | 63,5 ± 9,7 |
| FIGO-scenen III IV Ventende |
13 (56.5) 9 (39.2) 1 (4.3) |
| Histologi Serøs af høj kvalitet Carcinosarcoma Lav kvalitet serøs |
21 (92.9) 1 (7.1) 1 (4.3) |
| BRCA-mutation Ja Nej |
1 (4.3) 22 (95.7) |
| Tidligere linjer af kemoterapi 0 1-5 ≥5 |
20 (85.7) 0 2 (14.2) |
Tabel 1: BOB-biobankens karakteristika. Tabellen indeholder de specifikke egenskaber ved de organoider, der genereres ved hjælp af denne protokol. Disse karakteristika omfatter alder, FIGO (International Federation of Gynecology and Obstetrics) stadium, histologi, BRCA (BReast CAncer gen) mutation status, og tidligere linjer af kemoterapi.
Organoidkulturer kan evalueres ved indlejring i agarose og evaluering med H&E (figur 5).
Figur 5: Hæmatoxylin og eosin farvning af BOB. Repræsentativt billede af H&E-farvning af en organoid for kræft i æggestokkene genereret fra en patientprøve. Billedet blev taget ved 40x, og skalabjælken er 50 μm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kræft i æggestokkene er ekstremt dødelig på grund af dets avancerede stadium ved diagnosen samt den almindelige udvikling af kemoterapiresistens. Mange fremskridt inden for forskning i kræft i æggestokkene er blevet gjort ved at udnytte kræftcellelinjer og PDX-modeller; Der er imidlertid et indlysende behov for en mere repræsentativ og økonomisk overkommelig in vitro-model . BDO'er har vist sig nøjagtigt at repræsentere tumorheterogeniteten, tumormikromiljøet og de genomiske og transkriptomiske træk ved deres primære tumorer og er således ideelle prækliniske modeller for forskellige forskningsmetoder, såsom implementering af organoidmodeller i lægemiddelterapi16.
Protokollen beskrevet her er meget effektiv og pålidelig, som det fremgår af succesraten på 97%. Det er vigtigt at understrege, at den nuværende protokol indeholder kritiske skridt, som man bør være meget opmærksom på. For det første er det vigtigt at sikre, at prøven er fuldstændig homogeniseret ved høstning af organoider fra væv. Dette kan kræve, at dissociationsprogrammet køres mere end én gang, hvis det er nødvendigt. Hvis prøven ikke er homogen, kan de resterende stykker væv kompromittere organoid vækst. For det andet, da BME's arbejdstemperatur er 2-8 ° C, er det vigtigt at udføre alle trin, der involverer dette reagens på is for at undgå polymerisering. Derudover er det afgørende at undgå bobler ved resuspendering og plettering med BME, da dette gør de belagte organoide alikvoter ustabile, hvilket får dem til at løsne sig fra pladen. Endelig blev BME, der blev anvendt i denne protokol, genereret fra Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) tumoren og har derfor potentialet for inkonsekvent sammensætning mellem batcher. Disse forskelle kan påvirke organoid generation og vækst. Der er ingen specifik måde at overvinde denne begrænsning på, da forfatterne ikke er opmærksomme på alternative BME-muligheder17. Fremtidig forskning er nødvendig for at etablere alternative materialer til BME eller 3D-stilladser. På baggrund af ovenstående overvejelser er det vigtigt at understrege, at disse metoder skal tilpasses og testes til forskellige laboratorieindstillinger og udstyr.
På trods af de fremskridt, som organoider kan give til forskning i kræft i æggestokkene, er der begrænsninger for implementeringen til organoidmodeller. Organoid generering og vedligeholdelse er både langvarige og dyre processer. Den tid, der kræves til organoidvækst, muliggør indførelse af forurening. Endvidere kræver vækstvariabilitet konstant overvågning for at sikre, at mængden af tilgængelige medier er tilstrækkelig til organoidudvikling, og at kontaminering ikke er til stede. Derudover er organoidernes cellulære sammensætning variabel. Immunceller er til stede oprindeligt, men fortsætter normalt ikke forbi den anden passage. Dette kan overvindes med cytokintilskud i medierne, men ligger uden for rammerne af vores nuværende arbejde. Stromaceller ser ud til at fortsætte gennem passaging, men komponenterne afhænger meget af den oprindelige prøve18,19. Yderligere arbejde er nødvendigt for bedre at forstå hver celletypes nøjagtige cellulære komponenter og vedholdenhed. Generering af organoider fra patienter, der gennemgår flere kemoterapilinjer, er udfordrende og problematisk. Yderligere undersøgelser er nødvendige for at forstå virkningen af kemoterapi på organoid generation og udvikling. Endelig er det vores erfaring, at antallet af organoider, der genereres fra en bestemt mængde væv, ascites eller pleurvæske, er uforudsigeligt. For eksempel vil den samme mængde tumor, ascites eller pleurvæske indsamlet fra to forskellige patienter resultere i forskellige mængder organoider. Yderligere forskning udføres for at få indsigt i de bedste celletyper til organoid overlevelse og levedygtighed.
Ikke desto mindre tilbyder BDO'er unikke muligheder for præklinisk forskning sammenlignet med cellelinjer og PDX-modeller. Selv om der er gjort fremskridt med hensyn til diagnosticering og behandling af kræft i æggestokkene, er der stadig et betydeligt arbejde, der skal gøres, og BOB'er er et særligt redskab, der er nødvendigt for at fremme forskning i kræft i æggestokkene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Vi er taknemmelige for vejledningen fra Ron Bose, MD, PhD, og hjælp fra Barbara Blachut, MD, til at etablere denne protokol. Vi vil også gerne anerkende Washington University's School of Medicine i St. Louis's Department of Obstetrics and Gynecology og Division of Gynecologic Oncology, Washington University's Dean's Scholar Program og Reproductive Scientist Development Program for deres støtte til dette projekt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1% HEPES | Life Technologies | 15630080 | |
| 1% Penicillin-Streptomycin | Fisher Scientific | 30002CI | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Genesee Scientific | 14125 | |
| 10 cm Tissue Culture Dish | TPP | 93100 | |
| 10 mL Serological Pipet | |||
| 100 µm Cell Filter | MidSci | 100ICS | |
| 15 mL centrifuge tubes | Corning | 430052 | |
| 2 mL Cryovial | Simport Scientific | T301-2 | |
| 2% Paraformaldehyde Fixative | Sigma-Aldrich | ||
| 37 °C water bath | NEST | 602052 | |
| 3dGRO R-Spondin-1 Conditioned Media Supplement | Millipore Sigma | SCM104 | |
| 6 well plates | TPP | 92006 | |
| 70% Ethanol | Sigma-Aldrich | R31541GA | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM/F12 | ThermoFisher | 12634028 | |
| Agar | Lamda Biotech | C121 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504044 | |
| Centrifuge | |||
| Cultrex Type 2 | R&D Systems | 3533-010-02 | basement membrane extract |
| DNase I | New England Bio Labs | M0303S | |
| DNase I Reaction Buffer | New England Bio Labs | M0303S | |
| EGF | PeproTech | AF-100-15 | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FGF-10 | PeproTech | 100-26 | |
| FGF2 | PeproTech | 100-18B | |
| gentleMACS C Tubes | Miltenyi BioTech | 130-096-334 | |
| gentleMACS Octo Dissociator with Heaters | Miltenyi BioTech | 130-096-427 | We use the manufacturers protocol. |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | dipeptide, L-alanyl-L-glutamine |
| Hematoxylin and Eosin Staining Kit | Fisher Scientific | NC1470670 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher Scientific | 22900700 | |
| Microcentrifuge | |||
| Mr. Frosty Freezing Container | Fisher Scientific | 07202363S | |
| N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| p1000 Pipette with Tips | |||
| p200 Pipette with Tips | |||
| Pasteur Pipettes 9" | Fisher Scientific | 1367820D | |
| PBS | Fisher Scientific | MT21031CM | |
| Pipet Controller | |||
| Prostaglandin E2 | R&D Systems | 2296 | |
| Puromycin | ThermoFisher | A1113802 | |
| Recombinant Murine Noggin | PeproTech | 250-38 | |
| Recovery Cell Culture Freezing Medium | Invitrogen | 12648010 | |
| Red Blood Cell Lysis Buffer | BioLegend | 420301 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | R&D Systems | 1254/1 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
| T75 Flask | MidSci | TP90076 | |
| Tissue Culture Hood | |||
| Tissue Embedding Cassette | |||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | animal origin-free, recombinant enzyme |
| Type II Collagenase | Life Technologies | 17101015 | |
| Vortex |
References
- Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA: A Cancer Journal for Clinicians. 68 (6), 394-424 (2018).
- Drost, J., Clevers, H.
- Pauli, C., et al. Personalized in vitro and in vivo cancer models to guide precision medicine. Cancer Discovery. 7 (5), 462-477 (2017).
- Fujii, E., Kato, A., Suzuki, M. Patient-derived xenograft (PDX) models: Characteristics and points to consider for the process of establishment. Journal of Toxicologic Pathology. 33 (3), 153-160 (2020).
- Yang, J., et al. Application of ovarian cancer organoids in precision medicine: Key challenges and current opportunities. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 701429 (2021).
- Yang, H., et al. Patient-derived organoids: A promising model for personalized cancer treatment. Gastroenterology Report. 6 (4), 243-245 (2018).
- Karakasheva, T. A., et al. Generation and characterization of patient-derived head and neck, oral, and esophageal cancer organoids. Current Protocols in Stem Cell Biology. 53 (1), 109 (2020).
- Madison, B. B., et al. Let-7 represses carcinogenesis and a stem cell phenotype in the intestine via regulation of Hmga2. PLoS Genetics. 11 (8), 1005408 (2015).
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Murray, E., et al. HER2 and APC mutations promote altered crypt-villus morphology and marked hyperplasia in the intestinal epithelium. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 12 (3), 1105-1120 (2021).
- Hill, S. J., et al. Prediction of DNA repair inhibitor response in short-term patient-derived ovarian cancer organoids. Cancer Discovery. 8 (11), 1404-1421 (2018).
- Passarelli, M. C., et al. Leucyl-tRNA synthetase is a tumour suppressor in breast cancer and regulates codon-dependent translation dynamics. Nature Cell Biology. 24 (3), 307-315 (2022).
- Pleguezuelos-Manzano, C., et al. Establishment and culture of human intestinal organoids derived from adult stem cells. Current Protocols in Immunology. 130 (1), 106 (2020).
- Stumm, M. M., et al. Validation of a postfixation tissue storage and transport medium to preserve histopathology and molecular pathology analyses (total and phosphoactivated proteins, and FISH). American Journal of Clinical Pathology. 137 (3), 429-436 (2012).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Ooft, S. N., et al. Patient-derived organoids can predict response to chemotherapy in metastatic colorectal cancer patients. Science Translational Medicine. 11 (513), (2019).
- Aisenbrey, E. A., Murphy, W. L.
- Nanki, Y., et al. Patient-derived ovarian cancer organoids capture the genomic profiles of primary tumours applicable for drug sensitivity and resistance testing. Scientific Reports. 10, 12581 (2020).
- Mead, B. E., et al. Screening for modulators of the cellular composition of gut epithelia via organoid models of intestinal stem cell differentiation. Nature Biomedical Engineering. 6 (4), 476-494 (2022).
