Visualisierung von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in patienteneigenen Ovarialkarzinom-Organoiden mittels Immunfluoreszenz-Assays

Eierstockkrebs ist die häufigste Todesursache aufgrund gynäkologischer Malignität. Die Mehrzahl der Patienten wird mit DNA-schädigenden Medikamenten wie Carboplatin behandelt, und Patienten mit Tumoren mit homologer Rekombinationsreparatur (HRR) können Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) -^{Inhibitoren 1,2} verabreicht werden. Die meisten Patienten entwickeln jedoch eine Resistenz gegen diese Therapien und sterben innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose. Eine Dysregulation der DNA-Schadensantwort (DDR) wurde mit der Entwicklung von Eierstockkrebs und sowohl Chemotherapie als auch PARP-Inhibitor-Resistenz in Verbindung gebracht³. Daher ist die Untersuchung der DDR unerlässlich, um die Pathophysiologie von Eierstockkrebs, potenzielle Biomarker und neuartige zielgerichtete Therapien zu verstehen.

Aktuelle Methoden zur Bewertung der DDR verwenden Immunfluoreszenz (IF), da dies die genaue Identifizierung und Lokalisierung von DNA-schädigenden Proteinen und Nukleotidanaloga ermöglicht. Sobald es einen Doppelstrangbruch (DSB) in der DNA gibt, wird das Histonprotein H2AX schnell phosphoryliert und bildet einen Fokus, in dem sich DNA-Schadensreparaturproteine versammeln⁴. Diese Phosphorylierung kann leicht mit Hilfe von IF identifiziert werden; Tatsächlich wurde der ɣ-H2AX-Assay üblicherweise verwendet, um die Induktion eines DSB 5,6,7,8,9 zu bestätigen. Erhöhte DNA-Schäden wurden mit der Platinsensitivität und Wirksamkeit von DNA-schädigenden Stoffen in Verbindung gebracht 10,11,12, und ɣ-H2AX wurde als Biomarker vorgeschlagen^, der mit dem Ansprechen auf eine Chemotherapie bei anderen Krebsbehandlungen assoziiert ist ¹³. Bei einem DSB führt eine Zelle, die HRR beherrscht, eine Reihe von Ereignissen durch, die dazu führen, dass BRCA1 und BRCA2 RAD51 rekrutieren, um das Replikationsprotein A (RPA) zu ersetzen und an die DNA zu binden. Bei der HRR-Reparatur wird eine DNA-Vorlage verwendet, um das DSB originalgetreu zu reparieren. Wenn Tumoren jedoch einen Mangel an HRR aufweisen, sind sie auf alternative Reparaturwege wie die nicht-homologe Endverbindung (NHEJ) angewiesen. Es ist bekannt, dass NHEJ fehleranfällig ist und eine hohe Mutationslast für die Zelle erzeugt, die 53BP1 als positiven Regulator verwendet¹⁴. Diese DNA-schädigenden Proteine können alle mit Hilfe von IF genau als Herde identifiziert werden. Zusätzlich zur Färbung von Proteinen kann IF verwendet werden, um den Gabelschutz und die Bildung einzelsträngiger DNA-Lücken zu untersuchen. Die Fähigkeit, stabile Gabeln zu haben, wurde mit dem Ansprechen von Platin korreliert, und in jüngster Zeit haben Gap-Assays das Potenzial gezeigt, das Ansprechen auf PARP-Inhibitoren 6,15,16,17 vorherzusagen. Daher ist die Färbung der Nukleotidanaloga nach der Einführung in das Genom eine weitere Möglichkeit, die DDR zu untersuchen.

Bisher war die Bewertung der DDR bei Ovarialkarzinomen weitgehend auf homogene 2D-Zelllinien beschränkt, die die klonale Heterogenität, Mikroumgebung oder Architektur von In-vivo-Tumoren nicht rekapitulieren^18,19. Neuere Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass Organoide 2D-Zelllinien bei der Untersuchung komplexer biologischer Prozesse wie DDR-Mechanismen überlegen sind⁶. Die vorliegende Methodik bewertet RAD51, ɣ-H2AX, 53BP1, RPA und Geminin in PDOs. Diese Methoden beurteilen das intakte Organoid und ermöglichen die Untersuchung von DDR-Mechanismen in einer Umgebung, die der Mikroumgebung des In-vivo-Tumors ähnlicher ist. Zusammen mit der konfokalen Mikroskopie und der automatisierten Herdzählung kann diese Methodik dazu beitragen, den DDR-Signalweg bei Eierstockkrebs zu verstehen und Behandlungspläne für Patienten zu personalisieren.

Tumorgewebe und Aszites wurden nach Einholung der Zustimmung der Patientin im Rahmen eines gynäkologischen Onkologie-Biorepositorys gewonnen, das vom Institutional Review Board (IRB) der Washington University in St. Louis zugelassen wurde. Es wurden Patienten eingeschlossen, die einen hochgradigen serösen Ovarialkarzinom (HGSOC) im fortgeschrittenen Stadium hatten. Alle Eingriffe wurden bei Raumtemperatur auf der Werkbank durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle Reagenzien wurden bei Raumtemperatur (sofern nicht anders angegeben) hergestellt und bei 4 °C gelagert.

1. Organoid-Erzeugung

1. Generieren Sie die Organoide gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht²⁰.

2. Beschichtung und Bestrahlung von Organoiden

1. Verwenden Sie Organoide in Kultur, entfernen Sie die Laschen der Organoide aus der Kulturschale durch manuelle Manipulation einer Pipettenspitze. Sammeln Sie die Organoide in einem konischen 15-ml-Röhrchen.
2. Zentrifugieren Sie das konische Röhrchen bei 1.650 x g für 5 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette vorsichtig ab.
3. Fügen Sie dem Pellet 1.000 μl eines rekombinanten Enzyms tierischen Ursprungs hinzu (siehe Materialtabelle). Die Lösung wird gemischt und 15 min bei 37 °C inkubiert.
4. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 1.650 x g für 5 min bei 4 °C. Saugen Sie den Überstand mit einer Pipette vorsichtig ab.
5. Nach Zentrifugation und Aspiration resuspendieren Sie das Pellet in 1.000 μl phosphatgepufferter Kochsalzlösung.
6. 10 μl der Lösung werden in ein 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegeben und mit 10 μl Trypanblau gemischt.
7. 10 μl der Trypanblau-Zelllösung werden in einen Objektträger der Zellzählkammer gegeben und in die Zellzählmaschine eingeführt (siehe Materialtabelle).
8. 40.000 Zellen pro 20 μl Basalmembranextrakt (BME) in einen 8-Well-Glaskammerobjektträger geben (siehe Materialtabelle). Dadurch bleiben die Organoide 3-5 Tage lang erhalten, damit die Zellen Organoide bilden und auf eine geeignete Größe wachsen können.
9. Um Doppelstrang-DNA-Brüche zu induzieren, bestrahlen Sie die plattierten Organoide mit 10 Gray (Gy) ɣ-Bestrahlung (siehe Materialtabelle für Details zur Bestrahlung).
   HINWEIS: Dies kann bis zu 5-10 Minuten dauern.
10. Inkubation der Organoide in ihren Nährmedien in einem befeuchteten Inkubator bei 37 °C und 5% CO₂ für 4 h.

3. Immunfluoreszenzfärbung

HINWEIS: Die Volumina beziehen sich auf die Menge pro Well des 8-Well-Kammerobjektträgers (~300 μl).

1. Nach Bestrahlung und Inkubation der Organoide saugen Sie das Medium vorsichtig mit einer Pipette ab, um die 3D-Matrix nicht zu stören. Mit 300 μl PBS waschen.
2. Fixieren Sie die Organoide in 300 μl 2% Paraformaldehyd (PFA) für 10 min.
   HINWEISE: Nicht zu lange stehen lassen, da der BME depolymerisiert und abgesaugt werden könnte.
3. Waschen Sie die Organoide mit 300 μl Färbepuffer (siehe Materialtabelle). 5 Minuten auf einen Shaker geben.
4. Für die Permeabilisierung vorsichtig 300 μl Permeabilisierungspuffer (siehe Materialtabelle) zugeben und 20 min inkubieren. Mit 300 μl Färbepuffer waschen. 5 Minuten auf einen Shaker geben.
5. Fügen Sie 300 μl Färbepuffer hinzu, um den Permeabilisierungsschritt zu blockieren. 30 Minuten auf einen Shaker geben. Saugen Sie den Färbepuffer mit einer Pipette ab.
6. 300 μl Primärantikörper (Kaninchen-Anti-RAD51, Maus-Anti-Geminin, Kaninchen-Anti-RPA, Maus-Anti-ƔH2AX, Kaninchen-Anti-Geminin, Maus-Anti-53BP1; siehe Materialtabelle) werden in Färbepuffer verdünnt. Bei 4 °C 16 h inkubieren.
   HINWEIS: Vermeiden Sie eine Co-Färbung mit demselben Wirtstier. Lassen Sie den Deckel geschlossen, um zu vermeiden, dass sich die Antikörper in benachbarte Vertiefungen mischen.
7. Entfernen Sie die primäre Antikörperlösung. Führen Sie drei Wäschen mit 300 μl Färbepuffer für jeweils 5 Minuten auf dem Shaker durch.
8. 300 μl Sekundärantikörper (Ziegen-Anti-Maus-Alexa-Fluor 488 und Ziegen-Anti-Kaninchen-Alexa-Fluor 647; siehe Materialtabelle) in Färbepuffer verdünnte Lösung zugeben und 1 h im Dunkeln inkubieren.
   HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte müssen im Dunkeln ausgeführt werden.
9. Aspirieren Sie die sekundäre Antikörperlösung. Fügen Sie 300 μl verdünntes DAPI hinzu. 5 Minuten auf einen Shaker geben.
10. Führen Sie drei Wäschen mit 300 μl Färbepuffer für jeweils 5 Minuten auf dem Shaker durch. Entfernen Sie den Färbepuffer und lösen Sie die Kammern mit dem Entnahmeset, das den Objektträgern beiliegt (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie nicht zu weit nach vorne drücken, um die 3D-Matrix zu stören.
11. Fügen Sie mit einer p200-Pipettenspitze mit abgeschnittener Spitze Einlagemedium hinzu (siehe Materialtabelle), um jede Vertiefung mit einer Organoidlasche abzudecken (z. B. 20-30 μl für jede Organoidlasche).
12. Legen Sie ein Deckglas über die Probe, um Blasen zu vermeiden.
13. Nehmen Sie durchsichtigen Nagellack und malen Sie ihn auf die Seiten des Deckglases, um den Objektträger zu versiegeln. 1 h aushärten lassen und bei -20 °C platzieren.
    HINWEIS: Nach der Bildgebung kann der Objektträger mindestens 6 Monate mit minimalem Fluoreszenzverlust gelagert werden.

4. Bildgebung

1. Nehmen Sie Bilder mit einem konfokalen Mikroskop (siehe Materialtabelle) bei 63-fachem Objektiv mit Immersionsöl auf.
   HINWEIS: Bei der Abbildung von Kernproteinen ist 63x vorteilhaft, aber 40x ist auch akzeptabel.
2. Verwenden Sie DAPI, um die Organoide durch das Okular zu lokalisieren. Wählen Sie die geeigneten Filter für die Mikroskopie basierend auf den verwendeten Fluorophoren aus. Legen Sie die Parameter für die Erfassung der Z-Stack-Images fest.
   HINWEIS: Die in der Studie verwendeten Fluorophore waren DAPI, 488 und 647. Die Laser 405, 488 und 638 wurden eingeschaltet, um die Färbung zu visualisieren.
   HINWEIS: Der empfohlene Z-Stack hängt vom Auflösungsvermögen des Objektivs ab.
3. Passen Sie das Livebild an: Stellen Sie Fokus, Laserintensität usw. ein.
   HINWEIS: Je höher die Laserintensität, desto wahrscheinlicher ist es, dass die Probe photobleichen wird. Wählen Sie daher eine optimale Laserintensität.
4. Erwerben Sie den Z-Stack.
   HINWEIS: Dies kann bis zu 5-10 Minuten dauern.
5. Machen Sie aus den im Z-Stapel gesammelten Bildern mindestens drei Bilder pro Stapel.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie Screenshots im gesamten Stapel erhalten, um die Kerne bei der Quantifizierung nicht zu duplizieren.
6. Speichern Sie jede Datei als TIFF und fahren Sie mit der Analyse fort (Schritt 5).

5. Würdigung

HINWEIS: Verwenden Sie JCountPro für alle Bildanalysen nach dem zuvor veröffentlichten Bericht²¹. Um diese Software zu erhalten, verweisen Sie auf die zugehörige Publikation.

1. Wählen Sie im Bereich "Objektanalyse" (oben im Programm) auf der Registerkarte "Dateiauswahl" (unten im Programm) die TIFF-Dateien aus.
2. Klicken Sie auf Hinzufügen , um die ausgewählten Dateien in die Gruppe der ausgewählten Dateien zu verschieben. Wählen Sie Anzeige aus.
3. Wählen Sie auf der Registerkarte Segmentierung Blau als Farbe der Kerne aus. Wählen Sie Automatische Segmentierung , um den Schwellenwert der Kerne zu optimieren.
   HINWEIS: Wenn die automatische Segmentierung die Objekte nicht genau identifiziert, kann der Benutzer die Feinabstimmung und die Rohabstimmung an das Bild anpassen oder das Benutzerhandbuch einsehen, um die Segmentierung weiter zu optimieren.
4. Wählen Sie im Objektbereich die Option Große Objekte automatisch aufteilen und die Größe der Kerne optimieren.
   Hinweis: Die Kerne haben in der Regel eine unbedingte Größe von 5.000 Pixeln, während die bedingte Größe 1.500 Pixel beträgt. Lesen Sie das Benutzerhandbuch, um die Größe der Objekte weiter zu optimieren.
5. Wählen Sie Objekte identifizieren aus, um die Parameter zu testen.
   HINWEIS: Wenn diese Parameter nicht genau sind, können Größe und Abstimmung zusammen mit anderen Einstellungen angepasst werden. Im Benutzerhandbuch finden Sie Anweisungen zur weiteren Optimierung.
6. Nachdem Sie die Parameter an das Bild angepasst haben, wählen Sie Objekte in allen Bildern identifizieren, um die Kerne in allen ausgewählten Bildern zu identifizieren .
7. Wählen Sie das Bedienfeld "Fokusanalyse" (oben im Programm) aus.
8. Wählen Sie auf der Registerkarte Dateien auswählen (unten im Programm) die TIFF-Dateien aus, die für die Objektanalyse verwendet wurden, und klicken Sie auf die Pfeilschaltflächen (>>), um die Bilder in die Gruppe Bilddateien zu verschieben.
9. Doppelklicken Sie in der Verzeichnisgruppe unter den verschobenen Bilddateien auf den Ordner Manuelle Bearbeitung , und wählen Sie aus, ob die IOC-Dateien in die Gruppe Objektsammlungsdateien verschoben werden sollen.
   HINWEIS: Alle ausgewählten TIFFs müssen mit den IOC-Dateien übereinstimmen.
10. Klicken Sie auf Auswählen , um die Dateien in die ausgewählte Dateigruppe zu verschieben. Wählen Sie die Registerkarte Foci-Zählung am unteren Rand des Programms.
11. Optimieren Sie die Parameter, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
    1. Index der Zylindereinstellungen: 12.
    2. Fokuskanal: Wählen Sie die Farbe der Brennpunkte (grün: ɣ-H2AX; rot: RAD51).
    3. H-Kuppeleinstellungen: Kuppelhöhe %: 30; Schwellenwert %: 28 und 28.
    4. Form-/Größeneinstellung: Minimale Fokusgröße, Pixel: 5. Wählen Sie Form/Größe anwenden. Maximale Fokusgröße (bedingt): 32. Minimale Rundheit, x100: 96. Max. Fokus, Pixel: 60.
    5. Rauschfilter: Größe 1.
       HINWEIS: Wenn Sie feststellen, ob ein Kern positiv für die Gemininfärbung ist, wählen Sie unter dem zweiten Kanal Grün und unter Analyse die Intensität aus.
12. Um die eingestellten Parameter zu testen, wählen Sie die folgenden Schaltflächen in der angegebenen Reihenfolge aus: Top Hat > H-Dome > Foci Count.
    HINWEIS: Wenn diese Parameter nicht funktionieren, können Größe und Abstimmung zusammen mit anderen Einstellungen angepasst werden. Lesen Sie das Benutzerhandbuch, um mehr darüber zu erfahren, wie das Bild weiter optimiert werden kann.
13. Sobald die Parameter für die ausgewählten Bilder optimiert sind, wählen Sie Automatische Zählung , um die Brennpunkte in jedem Bild pro Kern zu zählen. Wenn der zweite Kanal gewünscht wird, bestimmt das Programm die Intensität, die verwendet werden kann.

Das vorgestellte Protokoll kann erfolgreich Proteine zur Reparatur von DNA-Schäden in Organoiden färben, visualisieren und quantifizieren. Diese Technik wurde verwendet, um PDOs sowohl vor als auch nach der Bestrahlung zu färben und zu bewerten. PDOs wurden 10 Gy Strahlung ausgesetzt und auf die folgenden Biomarker untersucht: ɣ-H2AX (Abbildung 1), ein Marker für DNA-Schäden; RAD51 (Abbildung 2), ein Marker für HRR; 53BP1, ein Marker für NHEJ; RPA, ein Marker für Replikationsstress (Abbildung 3); und Geminin, ein G2/S-Phasen-Zellzyklusmarker14. Die Dosis von 10 Gy wurde auf der Grundlage zuvor veröffentlichter Forschungsergebnisse gewählt, die DNA-Schäden bei Eierstockkrebs untersuchten 6,22. Die JCountPro-Software wurde verwendet, um den Kern zu identifizieren und die Anzahl der Herde innerhalb des Kerns mit den dargestellten Parametern13 zu quantifizieren (Abbildung 4). Die Software identifiziert den Zellkern (Abbildung 4A, B), dann die Kernherde (Abbildung 4C) und filtert die Herde von Geminin-positiven Zellen (Abbildung 4D).

Abbildung 1: ɣ-H2AX-Herde in PDOs vor und nach der Bestrahlung. Repräsentative Bilder von DAPI- und ɣ-H2AX-Brennpunkten in PDOs vor und nach der Bestrahlung bei 10x mit 63x Einsätzen. Maßstabsbalken: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: RAD51-Herde und Geminin in PDOs vor und nach der Bestrahlung. Repräsentative Bilder von DAPI, Geminin, RAD51 und Co-Färbung von Geminin/RAD51-Foci PDOs vor und nach der Bestrahlung bei 10x mit 63x Einsätzen. Maßstabsbalken: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: RPA und 53BP1 in PDOs vor und nach der Bestrahlung. Repräsentative Bilder von (A) DAPI, RPA; (B) Geminin, 53BP1 und Co-Färbung von Geminin/53BP1-Foci bei 10x mit 63x Einsätzen. Maßstabsbalken: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Der Quantifizierungs-Workflow der JCountPro-Software. (A) Bei der Objektanalyse wird der blaue Kanal ausgewählt, um die blauen Objekte und Kerne zu identifizieren, und dann automatisch optimiert, indem die automatische Segmentierung ausgewählt wird (roter Pfeil). (B) Bei der automatischen Aufteilung wird die Objektgröße (Kerne) an die Größe des Bildes und die Vergrößerung angepasst. Die Schaltfläche Objekt identifizieren wird ausgewählt, um die Parameter zu testen (1), und die Schaltfläche Objekte in allen Bildern identifizieren (roter Pfeil) wird ausgewählt, um Objekte (Kerne) für jedes Bild zu identifizieren. (C) Auf der Registerkarte Fokusanalyse werden die Bilder eingegeben und die Parameter für die Brennpunktzählung festgelegt: Zuerst wird die Farbe der Brennpunkte unter dem Fokuskanal grün ausgewählt. Der Top Hat Index ist auf 12 eingestellt. Die H-Dome-Einstellungen sind so eingestellt, dass sie einen Kuppelhöhenprozentsatz von 30 und einen Schwellenwertprozentsatz von 28 haben. Die Form und Größe der Brennpunkte werden auf die Bildgröße mit den manuellen Parametern maximaler Fokusgröße Pixel bei 60 und minimaler Rundheit x 100 bei 96 optimiert; Zum Schluss wird der Rauschfilter angewendet. Die Einstellungen werden getestet, indem der Zylinder, die H-Kuppel und die Anzahl der Brennpunkte (1-3) angewendet werden. Um die ɣ-H2AX-Herde pro Zelle zu quantifizieren, drücken Sie Start (roter Pfeil). (D) Für die RAD51-Brennpunkte werden die Einstellungen wie für ɣ-H2AX-Brennpunkte dargestellt angewendet, mit Ausnahme des Fokuskanals, der auf Rot geändert wird. Um jedoch Kerne zu identifizieren, die mit Geminin gefärbt sind, wird der zweite Kanal für Grün ausgewählt und die Analyse wird auf Intensität geändert. Die Parameter werden getestet, indem der Zylinder, die H-Kuppel und die Anzahl der Brennpunkte (1-3) angewendet werden, dann Start (roter Pfeil) gedrückt wird, um alle RAD51-Brennpunkte zu quantifizieren und die Intensität des Grüns pro Zelle in jedem Bild zu bewerten. Maßstabsleiste: 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

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