Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung von DNA-Schadensreparaturproteinen in von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden. Dazu gehören umfassende Plattierungs- und Färbemethoden sowie detaillierte, objektive Quantifizierungsverfahren.
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Methodenartikel
Visualisierung von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in patienteneigenen Ovarialkarzinom-Organoiden mittels Immunfluoreszenz-Assays
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Immunfluoreszenz ist eine der am weitesten verbreiteten Techniken zur Visualisierung von Zielantigenen mit hoher Sensitivität und Spezifität, die die genaue Identifizierung und Lokalisierung von Proteinen, Glykanen und kleinen Molekülen ermöglicht. Während diese Technik in der zweidimensionalen (2D) Zellkultur gut etabliert ist, ist weniger über ihre Verwendung in dreidimensionalen (3D) Zellmodellen bekannt. Ovarialkarzinom-Organoide sind 3D-Tumormodelle, die die klonale Heterogenität von Tumorzellen, die Tumormikroumgebung sowie Zell-Zell- und Zell-Matrix-Interaktionen rekapitulieren. Damit sind sie Zelllinien bei der Bewertung von Wirkstoffsensitivität und funktionellen Biomarkern überlegen. Daher ist die Fähigkeit, Immunfluoreszenz an primären Ovarialkarzinom-Organoiden zu verwenden, äußerst vorteilhaft für das Verständnis der Biologie dieses Krebses. Die aktuelle Studie beschreibt die Technik der Immunfluoreszenz zum Nachweis von Proteinen zur Reparatur von DNA-Schäden in hochgradigen serösen, von Patientinnen stammenden Ovarialkarzinom-Organoiden (PDOs). Nachdem die PDOs ionisierender Strahlung ausgesetzt wurden, wird eine Immunfluoreszenz an intakten Organoiden durchgeführt, um Kernproteine als Herde zu bewerten. Die Bilder werden mit Hilfe der Z-Stack-Bildgebung auf konfokaler Mikroskopie gesammelt und mit einer automatisierten Herdzählsoftware analysiert. Die beschriebenen Methoden ermöglichen die Analyse der zeitlichen und speziellen Rekrutierung von DNA-Schadensreparaturproteinen und die Kolokalisation dieser Proteine mit Zellzyklusmarkern.
Einleitung
Eierstockkrebs ist die häufigste Todesursache aufgrund gynäkologischer Malignität. Die Mehrzahl der Patienten wird mit DNA-schädigenden Medikamenten wie Carboplatin behandelt, und Patienten mit Tumoren mit homologer Rekombinationsreparatur (HRR) können Poly (ADP-Ribose) Polymerase (PARP) -Inhibitoren 1,2 verabreicht werden. Die meisten Patienten entwickeln jedoch eine Resistenz gegen diese Therapien und sterben innerhalb von 5 Jahren nach der Diagnose. Eine Dysregulation der DNA-Schadensantwort (DDR) wurde mit der Entwicklung von Eierstockkrebs und sowohl Chemotherapie als auch PARP-Inhibitor-Resistenz in Verb....
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Protokoll
Tumorgewebe und Aszites wurden nach Einholung der Zustimmung der Patientin im Rahmen eines gynäkologischen Onkologie-Biorepositorys gewonnen, das vom Institutional Review Board (IRB) der Washington University in St. Louis zugelassen wurde. Es wurden Patienten eingeschlossen, die einen hochgradigen serösen Ovarialkarzinom (HGSOC) im fortgeschrittenen Stadium hatten. Alle Eingriffe wurden bei Raumtemperatur auf der Werkbank durchgeführt, sofern nicht anders angegeben. Alle Reagenzien wurden bei Raumtemperatur (sofern nicht anders angegeben) hergestellt und bei 4 °C gelagert.
1. Organoid-Erzeugung
- Generieren Sie die ....
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Ergebnisse
Das vorgestellte Protokoll kann erfolgreich Proteine zur Reparatur von DNA-Schäden in Organoiden färben, visualisieren und quantifizieren. Diese Technik wurde verwendet, um PDOs sowohl vor als auch nach der Bestrahlung zu färben und zu bewerten. PDOs wurden 10 Gy Strahlung ausgesetzt und auf die folgenden Biomarker untersucht: ɣ-H2AX (Abbildung 1), ein Marker für DNA-Schäden; RAD51 (Abbildung 2), ein Marker für HRR; 53BP1, ein Marker für NHEJ; RPA, ein Marker fü.......
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Diskussion
Die DNA-Schadensantwort spielt eine wesentliche Rolle sowohl bei der Entwicklung von Eierstockkrebs als auch bei der Chemotherapieresistenz. Daher ist ein gründliches Verständnis der DNA-Reparaturmechanismen unerlässlich. Hier wird eine Methodik vorgestellt, um DNA-Schadensreparaturproteine in intakten 3D-Organoiden zu untersuchen. Es wird ein reproduzierbares, zuverlässiges Protokoll entwickelt, das charakteristische Antikörper verwendet, um DNA-Schäden, homologe Rekombination, nicht-homologe Endverbindungen und Replika.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Danksagungen
Wir sind dankbar für die Anleitung von Pavel Lobachevsky, PhD, bei der Erstellung dieses Protokolls. Wir möchten uns auch bei der School of Medicine der Washington University in St. Louis, der Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie und der Abteilung für gynäkologische Onkologie, dem Dean's Scholar Program der Washington University, der Gynäkologischen Onkologie Group Foundation und dem Reproductive Scientist Development Program für ihre Unterstützung dieses Projekts bedanken.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Calcium und Magnesium (PBS++) | Sigma | 14-040-133 | |
| 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung ohne Calcium und Magnesium (PBS) | Fisher Scientific | ||
| Ant-53BP1 Antikörper | BD Biosciences | 612522 | auf 1:500 in |
| Ant-Geminin-Antikörper | Abcam | ab104306 | verdünnt auf 1:200 in Färbepuffer |
| Anti-Geminin-Antikörper | ProteinTech | 10802-1-AP | verdünnt auf 1:400 in Färbepuffer |
| Anti-RAD51 Antikörper | Abcam | ab133534 | verdünnt auf 1:1000 in Färbepuffer |
| Anti-yH2AX Antikörper | Millipore-Sigma | 05-636 | verdünnt auf 1:500 in Färbepuffer |
| Ant-phospho-RPA32 (S4/S8) Antikörper | Bethyl Laboratories | A300-245A-M | verdünnt auf 1:200 in Färbepuffer |
| Rinderserumalbumin (BSA) | Fisher Scientific | BP1605 100 | |
| Zentrifuge; Sorvall St 16R Zentrifuge | Thermo Scientific | ||
| Konfokalmikroskop, Konfokales Leica SP5 System DMI4000 | Leica | ||
| konische Röhrchen, 15 mL | Corning | 14-959-53A | |
| Countess 3 FL Automatisierter Zellzähler (Zellzählmaschine) | Thermo Scientific | ||
| Countess Zellzählkammer Objektträger | Thermo Scientific | C10228 | |
| Deckglas | LA Farben | Jeder klare Nagellack genügt | |
| Cultrex RGF Basalmembran-Extrakt, Typ 2 | Forschung & Forschung D Systems | 3533-010-02 | Könnte wahrscheinlich Matrigel oder eine andere BME-Matrix verwenden |
| DAPI | Thermo Scientific | R37606 | NucBlue Reagenz für festzellige ReadyProbes, verdünnt in 1x PBS |
| Glycin | Fisher Wissenschaftlich | ||
| JCountPro | JCountPro | Für den Zugriff auf die Software, E-Mail: jcountpro@gmail.com | |
| Mikrozentrifugen-Röhrchen | Fisher Wissenschaftlich | 07-000-243 | |
| Nagellack | StatLab | SL102450 | |
| Parafomraldehyd (PFA), 2% | Elektronenmikroskopische Wissenschaften | 157-4 | Verdünnung auf 4 % PFA in PBS++ zur Gewinnung von 2 % PFA |
| Permeabilisierungspuffer | Hergestellt im Labor | 0,2 % X-100 Triton in PBS++ | |
| Pipette | Rainin | 17014382 | |
| Pipettenspitzen | Rainin | ||
| ProLong Gold Antifading-Eindeckmittel | Thermo Scientific | P36930 | |
| Färbepuffer | Hergestellt im Labor | 0,5 % BSA, 0,15 % Glycin, 0,1 % X-100 Triton in PBS++ | |
| Thermo Scientific Nunc Lab-Tek II Kammer-Gleitsystem | Thermo Scientific | 12-565-8 | |
| Triton X-100 | Sigma-Alderich | ||
| Trypanblau-Lösung, 0,4 % | Thermo Scientific | ||
| TrypLE Express | Invitrogen | 12604013 | rekombinantes Enzym |
| X-RAD 320 ohne | Präzise Röntgenbestrahlung | X-RAD320 |
Referenzen
- Lheureux, S., Gourley, C., Vergote, I., Oza, A. M. Epithelial ovarian cancer. Lancet Oncology. 393 (10177), 1240-1253 (2019).
- Tew, W. P., et al. PARP inhibitors in the management of ovarian cancer: ASCO guideline. Journal of Clinical Oncology. 38 (30), 3468-3493 (2....
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Nachdrucke und Genehmigungen
