Obwohl die Isolierung von pulmonalen Endothelzellen eine Herausforderung darstellt, ist sie für Studien zur Lungenentzündung unerlässlich. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur hochwirksamen, hochreinen Isolierung von makrovaskulären und mikrovaskulären Endothelzellen.
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Methodenartikel
Mikrovaskuläre und makrovaskuläre Endothelzellisolierung und -reinigung aus Lungenproben
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Verfügbarkeit von Zellen, die aus gesunden und kranken Geweben und Organen isoliert wurden, stellt ein Schlüsselelement für Ansätze der personalisierten Medizin dar. Obwohl Biobanken eine große Sammlung von primären und immortalisierten Zellen für die biomedizinische Forschung bereitstellen können, decken diese nicht alle experimentellen Bedürfnisse ab, insbesondere nicht solche, die sich auf bestimmte Krankheiten oder Genotypen beziehen. Vaskuläre Endothelzellen (ECs) sind Schlüsselkomponenten der immunen Entzündungsreaktion und spielen daher eine zentrale Rolle in der Pathogenese einer Vielzahl von Erkrankungen. Bemerkenswert ist, dass ECs von verschiedenen Standorten unterschiedliche biochemische und funktionelle Eigenschaften aufweisen, so dass die Verfügbarkeit spezifischer EC-Typen (d. h. makrovaskulär, mikrovaskulär, arteriell und venös) für die Planung zuverlässiger Experimente unerlässlich ist. Hier werden einfache Verfahren zur Gewinnung hochergiebiger, nahezu reiner humaner makrovaskulärer und mikrovaskulärer Endothelzellen aus der Pulmonalarterie und dem Lungenparenchym detailliert dargestellt. Diese Methodik kann von jedem Labor zu relativ geringen Kosten leicht reproduziert werden, um Unabhängigkeit von kommerziellen Quellen zu erreichen und EC-Phänotypen/Genotypen zu erhalten, die noch nicht verfügbar sind.
Einleitung
Das vaskuläre Endothel kleidet die innere Oberfläche der Blutgefäße aus. Es spielt eine Schlüsselrolle bei der Regulierung der Blutgerinnung, des Gefäßtonus und der immuninflammatorischen Reaktionen 1,2,3,4. Obwohl die Kultivierung von Endothelzellen (ECs), die aus menschlichen Proben isoliert wurden, für Forschungszwecke unerlässlich ist, muss beachtet werden, dass die ECs aus verschiedenen Blutgefäßen (Arterien, Venen, Kapillaren) spezifische Funktionen haben. Diese können von humanen Nabelvenen-Endothelzellen (HUVEC), die leicht verfügbar....
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Protokoll
Diese Studie wurde genehmigt und das Protokoll folgte den Richtlinien der Ethikkommission für Humanforschung der Universität Chieti-Pescara (#237_2018bis). Abbildung 1 zeigt die Isolierung von Endothelzellen aus Segmenten (1-3 cm lang) des Lungenparenchyms oder der Pulmonalarterie von nicht identifizierten menschlichen Probanden (mit schriftlicher Zustimmung), die sich aus verschiedenen Gründen, wie z. B. Pneumothorax oder Lobektomie, einer Thoraxoperation unterziehen. In letzterem Fall entnahmen die Chirurgen auch ein Lungenarteriensegment. Bemerkenswert ist, dass die Chirurgen genau angewiesen wurden, krebsfreie Proben zu entnehmen. Das....
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Ergebnisse
HLMEC-Isolation
Das Hauptproblem bei der Isolierung von HLMVECs ist das Vorhandensein kontaminierender Zellen, da die mikroskopisch kleinen Kapillaren nicht leicht vom Stromagewebe getrennt werden können. Daher ist es entscheidend, in den frühesten Phasen des Isolationsprozesses eine möglichst hohe Reinheit zu erreichen, um die Kulturpassagen und damit die Zellalterung zu reduzieren. Ebenso sollte ein optimales Isolationsprotokoll die höchstmögliche Ausbeute an reinen HLMVECs liefern. Um diese Ziele z.......
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Diskussion
Die vielfältigen Rollen, die vaskuläre Endothelzellen in der humanen Pathophysiologie spielen, machen diese Zellen zu einem unverzichtbaren Werkzeug für pathogenetische und pharmakologische In-vitro-Studien . Da ECs aus verschiedenen Gefäßstellen/Organen besondere Merkmale und Funktionen aufweisen, wäre die Verfügbarkeit von gesunden und kranken ECs aus dem interessierenden Organ ideal für Forschungszwecke. Zum Beispiel sind HLMVECs für Studien zu Lungenentzündungen unerlässlich; Daher wird eine Methodik für die.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, dass die Untersuchung ohne kommerzielle oder finanzielle Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt ausgelegt werden könnten.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch Mittel des italienischen Ministeriums für Universität und Forschung (ex 60% 2021 und 2022) an R. P. und durch Zuschüsse der italienischen Mukoviszidose-Stiftung (FFC#23/2014) und des italienischen Gesundheitsministeriums (L548/93) an M. R. unterstützt.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,05 % Trypsin-EDTA 1X | GIBCO | 25300-054 | Wird verwendet, um Zellen von den Kulturplatten zu lösen |
| Anti-CD31-Antikörper, Klon WM59 | Dako | M0823 | Wird für die CD-31-Färbung in der Immunzytochemie verwendet. Verwendete Verdünnung: 1:50 |
| Anti vWF Antikörper | Thermo Fisher Scientific | MA5-14029 | Wird für die Färbung des von-Willebrand-Faktors in der Immunzytochemie verwendet. Arbeitsverdünnung: 1:100 |
| Autoklavierbare chirurgische Schere | Beliebig | Wird zum Zerkleinern von Proben | |
| verwendet Zellsiebe 40 & Mikro; m | Corning | 431750 | Wird während der zweiten Filtration |
| verwendet Zellensiebe 70 & Mikro; m | Corning | 431751 | Verwendung von |
| Kollagenase Typ 2 | Worthington | LS004177 | Typ 2 Kollagenase für den enzymatischen Verdau. Arbeitskonzentration: 2 mg/mL |
| Konjugierter Anti-CD31-Antikörper | BD Biosciences | 555445 | Zur Zellsortierung (1:20 Verdünnung) |
| Dulbecco′ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit CaCl2 und MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8662 | Wird zum Waschen von Zellen vor dem Mediumwechsel |
| verwendet Dulbecco′ s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) ohne CaCl2 und MgCl2 | Sigma-Aldrich | D8537 | Wird zum Waschen von chirurgischen Proben und Zellen vor der Trypsinisierung verwendet |
| Endothelzellwachstumsmedium MV | PromoCell | C-22020 | HLMVEC-Wachstumsmedium |
| Fibronektin | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronektin aus menschlichem Plasma, das für die Plattenbeschichtung verwendet wird. Arbeitsschwerpunkt: 50 &Mikro; g/mL |
| Gelatine aus Schweinehaut, Typ A | Sigma-Aldrich | G2500 | Wird für die Plattenbeschichtung |
| A Gelatine | Sigma-Aldrich | g-2500 | Gelatine aus Schweinehaut, die für die Plattenbeschichtung verwendet wird. Arbeitskonzentration: 1,5 % |
Referenzen
- Muller, W. A. Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology. 24 (6), 326-333 (2003).
- Sumpio, B. E., Timothy Riley, J., Dardik, A. Cells in focus: Endothelial ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
