Summary
APTrack是为Open Ephys平台开发的软件插件，可实现实时数据可视化和神经元动作电位的闭环电阈值跟踪。我们已经成功地将其用于人类C纤维伤害感受器和小鼠C纤维和Aδ纤维伤害感受器的显微神经造影。
Abstract
伤害感受器是一类初级传入神经元，发出潜在有害的有害刺激信号。伤害感受器兴奋性增加发生在急性和慢性疼痛条件下。这会产生异常的持续活动或降低对有害刺激的激活阈值。确定这种兴奋性增加的原因对于基于机制的治疗的开发和验证是必要的。单神经元电阈值跟踪可以量化伤害感受器的兴奋性。因此，我们开发了一个应用程序来允许此类测量并演示其在人类和啮齿动物中的应用。APTrack 使用时态栅格图提供实时数据可视化和动作电位识别。算法通过跨越阈值来检测动作电位，并在电刺激后监测其延迟。然后，该插件使用上下方法调制电刺激幅度，以估计伤害感受器的电阈值。该软件基于Open Ephys系统（V0.54）构建，并使用JUCE框架进行C++编码。它可以在Windows，Linux和Mac操作系统上运行。开源代码可用（https://github.com/
Introduction
伤害感受器是周围神经系统中的主要传入神经元，由明显或潜在的组织损伤事件激活，并在急性疼痛中发挥关键的保护作用1。来自动物模型、健康人类志愿者和患者中 C 纤维和 Aδ 纤维伤害感受器的电生理记录显示，在各种疼痛条件下，敏化和异常自发活动2，3，4，5，6，7。了解患者伤害感受器兴奋性这些变化的机制可以使有针对性的治疗干预成为可能8。然而，很少有工具可以直接评估伤害感受器的兴奋性，特别是在患者中9，但这些工具的实用潜力是公认的10，11。
全神经电阈值跟踪可用于检查人类的轴突兴奋性12。然而，由于大的、有髓鞘的外周神经元对感觉复合动作电位的幅度贡献不成比例，全神经电阈值跟踪不允许评估 C 纤维功能11，13。事实上，在之前的一项研究中，患有糖尿病神经病变和化疗诱导的多发性神经病的慢性神经性疼痛队列的全神经电阈值跟踪显示轴突兴奋性没有差异11。
在之前的一项研究中，单神经元水平的电阈值跟踪用于检查离 体 大鼠皮肤神经制剂中逗弄纤维记录期间 C 纤维伤害感受器的兴奋性14。作者证明，钾浓度增加，酸性条件和缓激肽都增加了C纤维伤害感受器的兴奋性，这反映在动作电位产生的电阈值降低。此外，加热热敏伤害感受器的感受野降低了其电阈值，而热不敏感伤害感受器的电阈值增加14。这提供了重要的证据，证明单神经元电阈值跟踪是可能的，并且可以是有用的，但目前没有软件和/或硬件解决方案可用于此类研究，特别是对于人体研究。
在人类中，显微神经造影是直接评估C纤维电生理特性的唯一可用方法15。这种方法已被用于证明慢性疼痛患者的伤害感受器功能障碍2，3，4，5，6，7。显微神经造影可以检测单神经元动作电位;然而，由于信噪比低，研究人员使用标记技术来表征C纤维活性16。在标记技术中，将超阈值电刺激应用于皮肤中的C纤维感受野。这种电刺激产生在恒定延迟下发生的动作电位，该电位由C光纤的传导速度决定。C纤维表现出活动依赖性减慢，因此它们的传导速度降低，因此，它们的传导潜伏期在动作电位放电期间增加17。在基础条件下，C纤维在没有有害刺激的情况下通常不会产生动作电位，因此，它们响应低频电刺激的传导潜伏期是恒定的。引起放电的机械、热或药理学刺激会诱发活动依赖性减慢，从而增加伴随的低频电刺激引起的动作电位的潜伏期。这允许在低信噪比的背景下客观识别对所施加的非电刺激的响应。因此，活性依赖性减慢可用于在功能上表征C纤维16。事实上，C纤维的不同功能类别在涉及改变刺激频率的电刺激范式中表现出独特的活动依赖性减慢模式18，19。C光纤动作电位延迟的这种变化给旨在监测它们的算法带来了挑战。
伤害感受器中的持续活动导致其在低频电刺激期间潜伏期的变异性增加，这再次是由于活动依赖性减慢。这种增加的变异性或抖动是兴奋性的可量化代理度量2。动作电位潜伏期变异的进一步原因包括触发器，其中单个神经元的交替末端分支受到刺激，这导致诱发动作电位具有两个（或更多）相互排斥的基线潜伏期20。最后，外周神经元末端分支的温度变化也以热力学方式引起动作潜伏期变化，变暖增加传导速度，冷却减慢传导速度19。因此，任何寻求对伤害性C纤维进行闭环电阈值跟踪的软件都必须允许电诱发动作电位的延迟变化。
为了实现 C 纤维伤害感受器跨物种电阈值跟踪的目标，我们开发了 APTrack，这是一个用于 Open Ephys 平台21 的开源软件插件，以实现实时、闭环、电阈值跟踪和延迟跟踪。我们提供的概念验证数据表明，在人类显微神经造影期间进行C纤维伤害感受器电阈值跟踪是可能的。此外，我们表明该工具可用于啮齿动物 离体 梳理纤维电生理学，从而使人类和啮齿动物之间的转化研究成为可能。在这里，我们将详细描述研究人员如何实施和使用该工具来帮助他们研究伤害感受器功能和兴奋性。
Protocol
人体显微神经造影实验得到了布里斯托大学生命科学学院研究伦理委员会的批准（参考编号：51882）。所有研究参与者都给予了书面知情同意。动物实验是在布里斯托大学动物福利和伦理审查委员会批准后，根据1986年英国动物（科学程序）法案在布里斯托尔大学进行的，并受到项目许可证的保护。
1. 安装开放 Ephys GUI 和 APTrack
- 查看软件文档以查找支持的最新版本的 Open Ephys 图形用户界面 （GUI） （https://github.com/Microneurography/APTrack#readme），然后下载并安装 GUI。
- 从以下 URL 安装兼容版本的 GUI：https://github.com/open-ephys/plugin-GUI/releases。
- 从 GitHub 下载最新版本：https://github.com/Microneurography/APTrack/releases。对于 Windows 计算机，将.dll文件复制到插件文件夹中，该文件夹通常位于 C：\Program Files\Open Ephys\plugins。对于 MacOS 计算机，请将 .bundle 文件复制到程序包的“内容/插件”文件夹中。
2. 记录和刺激装置的组装
- 使用制造商提供的电缆将采集板连接到计算机，然后打开电源。
注意：对于人体显微神经造影，使用USB 3.0隔离器将参与者与计算机电隔离，采集板由便携式电池供电，而不是用于啮齿动物研究的电源电压电源。在人体研究期间，除步进电机控制板外，所有USB连接都通过USB隔离器。 - 将 I/O 板连接到采集板上的模拟输入端口。使用串行外设接口 （SPI） 电缆将 Intan RHD 录音主机连接到采集板。
注意：这里使用的是 Intan 16 通道双极云台，但也可以使用其他单极 RHD2000 系列云台。 - 将PulsePal连接到计算机22。对于使用PulsePal的模拟电压控制刺激器（例如DS4）的组装，与鼠标挑逗光纤记录一样，请按照以下步骤2.5.1-2.5.3;对于使用步进电机的基于旋转编码器的刺激器（例如DS7）组装，与人体微神经造影记录一样，请执行以下步骤2.6.1-2.6.8（图1）。
- 如下所述，在GUI中构建信号链。
- 将 Rhythm FPGA 插件插入信号链，方法是左键单击并将其拖动到信号链中;这将GUI连接到采集板。确保已单击ADC按钮以启动从I/O板记录ADC通道。ADC 按钮在打开时将呈橙色亮起。
注意：如果您希望播放以前记录的实验数据，可以在开始时使用文件阅读器插件而不是Rhythm FPGA。将其与APTrack结合使用将允许对先前实验中的动作电位进行可视化和延迟跟踪。 - 在信号链中插入带通滤波器;300-6，000 Hz的默认设置适用于人类和鼠标记录。此外，在其后插入一个拆分器。
- 将 APTrack 插件插入分路器一侧的信号链和另一侧的 LFP 查看器。LFP 查看器提供传统的类似示波器的电压迹线视图，在实验期间非常有用。
- 在插件后插入一个记录节点。在下拉菜单中，将数据保存格式从二进制更改为 Open Ephys。这样就完成了一个简单的信号链，运行良好（图 2）;但是，可以根据实验要求添加其他组件。
注意： 如果记录节点放置在信号链中的插件之前，则不会保存动作电位跟踪信息。 - 在GUI的右上角，单击播放按钮开始从采集板传输数据并将其可视化。要开始录制，请单击播放按钮旁边的圆形录制按钮。
注意：很容易忘记单击记录;我们从开始获取的那一刻起就记录数据，以防止这种情况发生。
- 将 Rhythm FPGA 插件插入信号链，方法是左键单击并将其拖动到信号链中;这将GUI连接到采集板。确保已单击ADC按钮以启动从I/O板记录ADC通道。ADC 按钮在打开时将呈橙色亮起。
- 对于使用模拟电压控制刺激器的组装，请按照以下步骤操作。
- 打开恒流刺激器的电源，其刺激幅度由模拟电压输入控制。本例使用DS4（图1）。
- PulsePal输出通道1用于模拟电压命令。使用 BNC T 型分配器分离此信号，然后将其连接到恒流激励器输入和 I/O 板，以便记录命令电压。
- PulsePal输出通道2用于电刺激TTL事件标记。将其连接到 I/O 板，以便记录刺激 TTL 事件标记，供插件使用和事后分析。
- 对于使用模拟电压控制刺激器的组装，请按照以下步骤操作。
- 打开恒流刺激器的电源，其刺激幅度由旋转编码拨盘控制。本例使用DS7（图1）。
- 使用制造商提供的电缆和磁性支架将步进电机控制板连接到步进电机。
- 使用任何标准 USB A 到 USB 微型 B 电缆将控制板直接连接到计算机。请勿连接 USB 隔离器参与者侧的控制板，因为它也连接到 12 V 主电源。
- 如果是第一次使用控制板，将步进电机脚本从 GitHub 上传到控制板;这只需要执行一次，或者如果发布了步进电机脚本的任何软件更新。
- 将恒流刺激器上的刺激幅度拨盘设置为 0 mA。使用定制的安装支架连接步进电机和刺激振幅拨盘。这些可以3D打印，从而实现廉价，快速和可定制的安装解决方案。请查阅 GitHub 以查看是否已为所选刺激器设计了支架。
- 使用定制的桶适配器将步进电机桶连接到刺激幅度控制拨盘。出于强度和耐用性的原因，这些适配器应由金属制成;然而，3D打印部件也是合适的，尽管它们可能需要定期更换。请查阅 GitHub 以查看是否已经为所选刺激器设计了桶形适配器。
- 使用自定义安装和桶形适配器将控制板/步进电机设备松散地连接到刺激器控制旋钮上。
注意：启动软件后，安装和桶适配器将稍后拧紧，步进电机自动设置为位置零。 - 按照协议步骤2.5.2-2.5.3（减去将输出通道1连接到刺激器）中所述连接PulsePal，因为仍然需要生成TTL事件标记才能进行分析和插件运行。此外，将输出通道2连接到DS7激励器以触发它。
- 如下所述准备小鼠皮肤神经制剂。
- 随意向2-4个月大和两性的C57BL / 6J小鼠（英国查尔斯河实验室）提供食物和水。
- 通过腹膜内注射戊巴比妥钠（≥200mg / kg）通过麻醉剂过量剔除并确认循环停止后，使用Zimmermann等人描述的方法从小鼠后爪的背侧解剖皮肤和支配该区域的隐神经23。
- 在定制的双室丙烯酸浴（15 mL / min灌注速率，30 mL体积）的一半中将碳化合成组织液（表1）中的皮肤 - 神经制剂保持在30-32°C。将神经穿过一个小孔进入充满矿物油的腔室，并用凡士林密封。该油提供绝缘的记录环境。
- 使用超细镊子从神经躯干上梳理出两根细丝，并在双极银/氯化银记录电极的每一侧悬挂一根。
- 使用 RHD2216 16 通道双极头级对神经信号进行数字化和放大，并使用采集板对其进行处理。使用300-6，000 Hz的带通滤波器对30 kHz的信号进行采样，并使用GUI对其进行可视化。
- 使用钝玻璃棒，抚摸制剂的皮肤。使用低振幅质量数活动来确认制剂是否有效。
- 如下所述进行人 C 纤维显微神经造影。
- 与提供书面知情同意书的参与者进行显微神经造影，如前所述24.
- 参与者舒适地坐在床上并用枕头支撑，使用超声扫描仪识别腓浅神经，并在胫骨中部附近标记外踝近端约 5-10 厘米的目标区域。
- 使用2%氯己定在70%酒精擦拭布中对目标区域周围的皮肤进行消毒，并在胫骨中部水平的预期记录部位附近皮下插入无菌参比电极。
- 在目标区域内的超声引导下将无菌记录电极插入腓浅神经。
- 使用 RHD2216 16 通道双极头级对神经信号进行数字化和放大，并使用采集板对其进行处理。使用300-6，000 Hz的带通滤波器对30 kHz的信号进行采样，并使用GUI对其进行可视化。
注意：采集设备通过具有 5 kV RMS 隔离的 USB 3.0 隔离器与笔记本电脑电气隔离，并通过定制的 12 V 电池电源 供电 。 - 通过轻轻抚摸皮肤以揭示机械诱发的大规模活动来确认成功的神经内定位。此外，参与者通常在成功进行神经内定位后报告足背外侧感觉异常。
3. 外周神经元的软件设置和识别及表型
- 按如下所述设置软件。
- 打开图形用户界面（图3）。如果步进电机控制板连接到您的PC，则会检测到它并将其自身设置为零位置。拧紧步骤 2.6.5-2.6.7 中所述的定制支架和桶形适配器，因为刺激器的刺激振幅拨盘和步进电机均设置为零。
注意： 如果步进电机和刺激振幅拨盘未同时“归零”，则可能导致步进电机试图将控制拨盘调出其范围，从而可能导致损坏。 - 在选项菜单中，选择 触发通道。从 PulsePal 输出通道 2 中选择包含电刺激 TTL 标记的 ADC 通道 。
- 在选项菜单中，选择数据通道，然后选择包含电生理数据的 通道。
- 在刺激控制面板中，使用滑块定义初始、最小和最大刺激幅度。确保电流刺激设置为高于 0，以便生成 TTL 标记。
注意：某些刺激器的输入输出缩放比不是 1：1;在选择合适的刺激幅度时，请考虑这一点。例如，在某些刺激系统上可以选择1：10的输出比，以实现恒流刺激器的更高输出。 - 在刺激控制面板中，单击 F 以加载包含刺激指令的文件。电刺激协议存储为逗号分隔值（CSV）文件，该文件由所需的刺激频率和持续时间组成，允许用户为其实验创建复杂的刺激范式。此处提供了一个示例模板：https://github.com/Microneurography/APTrack/blob/main/example_playlist.csv
- 在刺激控制面板中，单击>以开始加载的刺激范例。默认情况下，APTrack 请求 PulsePal 生成持续时间为 0.5 毫秒的不同振幅的正方波脉冲，以控制恒流刺激器的刺激幅度。
- 时态栅格图将根据对电刺激的响应开始更新，每个新的刺激响应都将在右侧显示为一个新列。
- 打开图形用户界面（图3）。如果步进电机控制板连接到您的PC，则会检测到它并将其自身设置为零位置。拧紧步骤 2.6.5-2.6.7 中所述的定制支架和桶形适配器，因为刺激器的刺激振幅拨盘和步进电机均设置为零。
- 可视化和识别单神经元动作电位。
- 为了成功检测单神经元动作电位，设置合适的图像阈值非常重要。在时态栅格绘图面板中，调整低、检测和高影像阈值。
- 在选项菜单中选择配色方案。在WHOT（白热）模式（默认）下，低于低图像阈值的电压以黑色编码。低图像阈值和检测阈值之间的电压以灰度编码。高于检测阈值的电压以绿色编码，高于高图像阈值的电压以红色编码。
- 外周神经元在低刺激频率（<0.25 Hz）下表现出恒定的潜伏期反应，这些反应由它们的传导速度和刺激和记录位点之间的距离决定。设置合适的图像阈值后，算法检测到的阈值交叉事件将以绿色编码（图 4）。
- 系统地在被记录的神经支配的皮肤区域周围移动刺激电极，允许每个部位至少发生三次刺激事件。监视时间栅格图，以了解在每个电刺激事件后同一时间点发生的阈值交叉事件（标记为绿色）。
注意：在小鼠中，使用5mA的搜索刺激。在人类中，经皮电搜索刺激的振幅被滴定为言语疼痛等级，使其从未超过7/10。 - 检查在相同潜伏期和相同刺激位置连续出现的三个阈值交叉事件（绿色条）;这表明周围神经元动作电位的识别。
- 通过识别目标神经元感受野中最敏感的点来优化刺激电极位置，然后将电极固定到位。在人体显微神经造影的这一点上，切换到使用皮内电针针（直径0.2毫米）进行双极电刺激，在小鼠中，使用定制的经皮刺激探针，以使刺激位置恒定。
- 为了成功检测单神经元动作电位，设置合适的图像阈值非常重要。在时态栅格绘图面板中，调整低、检测和高影像阈值。
- 对周围神经元进行分类和感觉表型分析。
- 通过手动调整模拟幅度或使用APTrack（如果需要）来估计目标动作电位的电阈值（如步骤4.1-4.2中所述）。
- 在整个感觉表型方案中，以 0.25 Hz 的频率以估计电阈值的 2 倍刺激感受野。
- 通过将传导距离除以传导潜伏期来计算神经元的传导速度。C-光纤可以通过≤2 m/s的传导速度来识别。
- 使用冯弗雷细丝机械刺激感受野，以确定激活的机械阈值。机械感觉可以通过电压迹线上可见的诱发动作电位和神经元潜伏期的增加来识别，如果它是 C 纤维，则在足够的力下。
- 加热神经元的感受野，再次观察电压迹线上可见的动作电位，以及在充分施加热量时神经元（如果是 C 纤维）的潜伏期增加。由于对轴突传播的热力学效应，热不敏感的神经元将表现出潜伏期的降低。
注意：在人体显微神经造影中，请使用TSC-II进行快速准确的热控制。在小鼠制备中，将加热或冷却的合成组织液添加到放置在感受野上的铝隔离室中，以允许进入神经元末端，同时限制快速散热到周围流体中。使用热电偶记录温度。 - 冷却感受野，再次观察电压迹线上可见的动作电位，以及神经元潜伏期的显着增加，如果是C光纤，在足够的冷施用下。由于对轴突传播的热力学效应，所有神经元都会表现出潜伏期增加，因此在仅根据潜伏期增加将神经元标记为冷敏感时要小心。
4. 延迟和电阈值跟踪
- 执行延迟跟踪，如下所述。
- 在识别时态栅格图上的单神经元动作电位后，移动时态栅格图右侧的灰色线性滑块以调整搜索框的位置。
- 在时态栅格图下方，将搜索框宽度旋转滑块调整为适当的宽度。使搜索框宽度变窄，以减少瞬态噪声尖峰、自发触发动作电位或其他附近的恒定延迟动作电位被错误识别为感兴趣的动作电位的机会。
- 要开始跟踪目标动作电位，请单击多单元跟踪表下方的 +。表中将添加一个新行，其中包含目标动作电位的详细信息，包括潜伏位置、在 2-10 个刺激上发射的百分比（在选项菜单中调整）以及检测到的峰值幅度。
- 一旦将动作电位添加到多单元跟踪表中，延迟跟踪算法（图5）将在每次后续电刺激时自动执行。
- 如果时态栅格图上有多个离散动作电位可见，请如上所述将它们添加到多单元追踪表中。可以添加到表中以进行同时延迟跟踪的理论最大动作电位数是最大 32 位整数值。
- 选中多单元跟踪表中的跟踪峰值框，将搜索框移动到该特定动作潜力的适当位置，具体取决于延迟 跟踪 算法。这将允许实时监控延迟跟踪，并确保跟踪按预期遵循动作电位。其他峰值的延迟跟踪将在后台照常进行。
- 使用每行末尾的删除按钮从多单元跟踪表中删除跟踪的动作电位。
- 执行电气阈值跟踪，如下所述。
- 在0.1 V和0.5 V之间调整刺激控制面板中的增量和递减率。 保持这些值相等，除非这是实验范式的一部分，否则不要在实验过程中调整它们。
- 确保将刺激频率设置为适当的速率，通常为0.25-0.5 Hz，除非刺激频率的调制是实验范式的一部分。增加伤害感受器放电率可能会改变伤害感受器的电阈值。
- 成功跟踪动作电位后，选中多单元跟踪表中的跟踪阈值框，这将启动电 阈值跟踪 算法（图 6）。
注意：电阈值跟踪仅在目标动作电位上运行;事实上，多单元跟踪表中其他动作电位的发射速率将随着刺激幅度的变化而相应更新。 - 手动将刺激幅度调整到电阈值的估计值;这将减少确定电阈值的等待时间。建立可靠的电阈值所需的时间取决于刺激频率、递增和递减率以及从初始刺激到神经元电阈值的刺激幅度差异。
- 该软件使用上下方法来估计神经元的电阈值。在多单元跟踪表中，发射速率是在之前的2-10次刺激（在选项菜单中选择）上确定的。选择要考虑的刺激事件数;较高的数字将提高阈值估计的可靠性，但需要更长的时间才能实现。
- 在人体显微神经造影过程中，监测电刺激的疼痛以防止参与者过度不适很重要;在研究伤害感受器，特别是沉默/睡眠的C纤维时，一些不适是不可避免的。在电阈值跟踪期间，当刺激幅度增加时，定期询问疼痛等级，并保持在恒流刺激器附近，以根据参与者的要求将其脱离。
注意：或者，可以通过用户界面单击刺激控制面板中的 [ ] 按钮来脱离电刺激。 - 50%的点火率表示近似的电阈值已经确定。
- 在电阈值跟踪时，对感受野进行实验操作，例如温度或药物操作。将跟踪这些操作对伤害感受器的电阈值的影响。
注意：在实验操作后，留出足够的时间来识别新的伤害感受器阈值。
Representative Results
用于控制实验的软件的代表性示例如图 7所示。它采用上下法迭代调整刺激幅度，有效找到单个伤害感受器的电阈值。我们首次证明了在微神经造影过程中对人类进行实时单神经元电阈值跟踪的可行性（图7A）。此外，我们显示了鼠标Aδ光纤中的电阈值跟踪（图7B）。此处使用的通过阈值交叉识别动作电位足以跟踪随时间变化的电阈值。我们建议用户采取措施将记录过程中的电噪声降至最低，例如使用法拉第笼和带通滤波器来提高信噪比。
为了证明电阈值跟踪可以用作衡量人类伤害感受器兴奋性变化的指标，在阶梯式加热范式期间进行了电阈值跟踪（图8）。提高伤害感受器终端的温度会降低引发动作电位所需的电刺激电流，反映出伤害感受器兴奋性的增加（图8C）。这可能是由C纤维伤害感受器14中表达的热敏离子通道产生受体电位引起的。在最高温度阶跃44°C时，引起热诱发动作电位（图8A，刺激编号86-96）。这会导致电阈值增加，因为伤害感受器在高频放电后可能处于难治状态。正如预期的那样，跟踪动作电位的潜伏期随着温度的升高而降低。这被认为是由于对传导机械的热力学效应而发生的，这增加了C纤维的传导速度。该 C 光纤也可能表现出触发器（图 8B，刺激编号 47-54），如果动作电位落在算法搜索窗口之外，这可能导致以下电刺激的幅度错误地增加。
图 1：使用APTrack对啮齿动物和人类进行伤害感受器电阈值跟踪所需的设备设置和电缆连接示意图。 请注意两种不同的刺激幅度控制方法：在我们的人类设置中，用于手动调节刺激器的步进电机，以及用于我们啮齿动物设置中的输入电压控制刺激器的PulsePal。（1） 运行 Open Ephys 平台插件的 PC（Windows、Mac 或 Linux）。（2） 操作DS7上的刺激振幅拨盘的步进电机。（3）批准用于人类的恒流刺激器;这里我们使用了 DS7。（4） USB 3.0 光隔离器，将人类参与者与 PC 隔离（可选，仅人类研究需要）。（5） PulsePal V2脉冲发生器，可生成TTL时间戳（输出通道2）和对应于请求的刺激幅度（输出通道1）的电压步长。（6）用于动物的恒流刺激器;在这里，我们使用了DS4。（7） 系统的直流电源（用于啮齿动物设置的市电直流电源和用于人体设置的电池直流电源）。（8）收购板。（9） I/O板，用于连接承载要记录的信号的BNC同轴电缆，例如热电偶输出和TTL标记。（10）小鼠皮肤神经制剂进行伤害感受器电生理记录。（11）接受腓浅神经C纤维显微神经造影记录的人类参与者。（12） Intan RHD2216 主机，用于采集和数字化录音。（13） Intan电极适配器板，记录电极连接到该板，允许将信号传递到RHD2216头级。（14） 可以通过BNC同轴连接 输出 温度的热刺激系统。（15） 3.3 V 电池供电的按钮/脚踏板，用于标记机械刺激事件和药物应用。 请点击此处查看此图的大图。
图 2：模板信号链。 红色箭头指向用于从I/O板启用ADC输入的按钮。黄色箭头表示用于选择 Open Ephys 文件格式的下拉菜单。绿色箭头表示“播放”和“录制”按钮。 请点击此处查看此图的大图。
图 3：图形用户界面。 GUI 由四个主要组件组成。（1） 时态栅格图面板（绿色），用于数据可视化以及与控制图相关的设置。绿色箭头表示显示逐渐与活动相关的减速的恒定延迟响应。（2） 刺激控制面板（黄色），用于设置刺激幅度参数和加载刺激范式脚本。（3） 多单元跟踪表（蓝色），用于添加用于跟踪和激活延迟和电阈值跟踪的动作电位。（4） 选项菜单，用于选择数据和TTL触发器的颜色样式和输入通道。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：通过使用 APTrack 在时态栅格图上进行实时数据可视化，促进识别恒定延迟动作电位。这是一个高信噪比示例。时间光栅图中提供的数据来自显微神经造影期间腓浅神经的人类 C 纤维记录。电压跟踪是Open Ephys中类似示波器的LFP Viewer插件。APTrack用户界面是插件的图形用户界面。跟踪的动作电位由绿色箭头指示，时态栅格图边界上的圆形滑块用于控制算法将搜索阈值交叉事件的搜索框位置。电刺激伪影在电压迹线上标记为蓝色。模拟电压命令的刺激幅度以红色表示;请注意，这可能与刺激电流幅度不同，具体取决于刺激器上设置的比例因子。请点击此处查看此图的大图。
图 5：延迟跟踪算法的图形表示。 简单来说，如果通过阈值交叉检测到动作电位，搜索框将调整其位置以在峰值电压时居中。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：电阈值跟踪算法的图形表示。 简单来说，如果通过跨越阈值检测到动作电位，则刺激幅度将随着递减速率而减小。如果未检测到动作电位，则刺激幅度将增加增量速率。 请点击此处查看此图的大图。
图 7：在 0.25 Hz 刺激频率下单神经元动作电位的自动电阈值跟踪 。 （A）微神经造影实验中腓浅神经的人C纤维的连续痕迹。（B）在皮肤神经制备过程中隐神经的小鼠Aδ纤维的连续痕迹挑逗纤维电生理学。当识别出动作电位时，迹线被涂成红色，导致刺激幅度减小。软件算法有效地找到了50%的发射可能性所需的刺激幅度。 请点击此处查看此图的大图。
图 8：在人类 C 纤维伤害感受器热刺激期间以 0.25 Hz 刺激频率进行的电阈值跟踪。 y 轴从范式开始对刺激数进行编码。（A） 电刺激后 4，000 ms 的电压轨迹，阈值交叉事件标记为红色。（B） 来自 A 的电压迹线围绕跟踪的动作电位放大。当检测到跟踪的动作电位时，迹线被涂成红色。垂直蓝线是跟踪单元的基线延迟。（C）由APTrack控制的刺激电流。垂直蓝线是基线电阈值。（D）感受野TCS-II热刺激探头温度。 请点击此处查看此图的大图。
| 复合 | 浓度 |
| 氯化钠 | 107.8 毫米 |
| 氢氧化钠3 | 26.2 毫米 |
| 氯化钾 | 3.5 毫米 |
| NaH2PO4 | 1.67 毫米 |
| 氯化钙2 | 1.53 毫米 |
| 镁硫4 | 0.69 毫米 |
| 葡萄糖酸钠 | 9.64 毫米 |
| 蔗糖 | 7.6 毫米 |
| 葡萄糖 | 5.55 毫米 |
表1：用于小鼠皮肤神经制剂的合成组织液的内容物23.
Discussion
APTrack是一个用于Open Ephys平台的软件插件。我们选择了这个平台，因为它是开源的、灵活的、实施起来便宜的。不包括恒流刺激器的成本，在撰写本文时，可以以大约 5，000 美元的价格购买开始使用插件所需的所有设备。我们希望这将使研究人员能够更轻松地在周围神经电生理学研究中实施APTrack。此外，研究人员可以自由修改软件以满足他们的实验需求。重要的是，该工具首次允许在人类中对单个C纤维伤害感受器进行电阈值跟踪。
信噪比越高，算法就越能识别动作电位。在我们的大多数记录中，微神经造影期间的信噪比是足够的，但用户必须警惕信号随时间下降的风险。这对于较长的实验方案尤其重要，因为如果跟踪的动作电位的幅度降至检测阈值以下，刺激幅度将被错误地增加;这可以通过实验者监控插件，然后根据需要调整设置来缓解。带通滤波提高了信噪比，但如果较大的瞬变在搜索框时间窗口内到达，它们仍可能被误认为动作电位。通过缩小插件搜索动作电位的时间窗口并优化阈值设置，可以降低将瞬态噪声错误识别为动作电位的风险。但是，仍然存在可能遇到阻碍插件性能的情况。如果较大振幅的动作电位落在算法的搜索框窗口内，则自发活动可能会导致困难，因为它们会被错误地识别为目标动作电位。此外，感兴趣的神经元中的自发活动可能意味着电刺激在其不应期内下降，导致无法产生动作电位。当初级传入神经元表现出触发器时，也会出现使用该软件的困难，从而刺激单个神经元的交替末端分支，从而导致诱发动作电位具有两个（或多个）相互排斥的基线潜伏期20。在记录表现出高信噪比触发器的神经元期间，我们通过增加搜索框宽度来封装神经元表现出的所有潜在传导速度，从而成功地执行了延迟和电阈值跟踪。然而，电阈值可能因被激发的神经元的末端分支而异，这可能部分是由于从电刺激部位到替代伤害感受器末端的距离差异。关于动作电位识别过程的其他工作，例如包括模板匹配是可行的，并且可以集成到该软件中。用于带阻或自适应噪声滤波的GUI插件也可以用于信号链中的APTrack上游。
我们认为确定的电阈值是在用户定义的电刺激数量（通常为2-10）的50%时间内引发动作电位所需的电流。电刺激的形态为0.5毫秒和正方波脉冲。这与确定流变碱基不同，流变碱基是神经元兴奋性的常用测量方法。该插件可以调整为确定流变基数。然而，我们采用了更简单的测量方法，因为兴奋性的动态变化，例如假设在加热期间发生的那些变化，比我们的电阈值估计更难量化流变基变化。
该软件可用于人类和啮齿动物实验。这是通过对电刺激系统的灵活支持实现的。该软件可与任何接受模拟命令电压或可与步进电机手动接口的刺激器配合使用。对于显微神经造影，我们将其与带有CE标志的恒流刺激器一起使用，该刺激器设计用于人类研究，其刺激由表盘控制。接受模拟电压命令的刺激器可能会有噪音，因为它们不会断开激励之间的电路，这意味着模拟输入上的任何 50/60 Hz 嗡嗡声或噪声都将传输到录音中。需要额外的 TLL 触发信号来连接电路的刺激器，允许在类似于模拟电压输入的电流下产生激励，非常适合与插件一起使用。这可以防止噪声在刺激之间传递到记录中。
该软件使用简单的上下方法来估计电阈值。几十年来，这一直被用于心理物理学测试25。与上下方法一致，用于调制刺激幅度的电阈值跟踪算法在计算下一个刺激的幅度时仅考虑前一个刺激的幅度和响应。这意味着刺激幅度将在真正的电阈值附近振荡，从而产生50%的放电率，假设阈值稳定。增量或递减的最小大小为0.01 V;这相当于0.01 mA，假设激励器的输入输出比为1 V：1 mA，分辨率足以实现如此小的阶跃变化。该插件将更新目标动作电位电阈值的实时估计值，每次它在用户定义的先前刺激数量 （2-10） 上达到 50% 的发射率时。事后，我们建议使用最近 2-10 次刺激的刺激幅度的滚动平均值来估计电阈值，应该注意的是，只有当放电率相对稳定在 50% 时，此估计才会准确。在电阈值的实时和事后估计中，需要考虑分辨率、可靠性和时间的平衡。使用较小的增量和递减步长将提高电阈值估计的准确性，但会增加最初和扰动后找到新电阈值所需的时间。计算更多先前刺激的电阈值将提供更好的可靠性，但会增加达到准确估计所需的时间。
APTrack 设计用于周围神经记录，专门用于在实验和病理扰动期间跟踪 C 纤维的电阈值，其中动作电位潜伏期可能因潜在的神经元活动而异。该方法不仅可以检查轴突兴奋性，还可以检查健康志愿者和患者的伤害感受器发生器电位。我们预计电生理学的其他领域可能会采用并调整该工具，以用于任何需要对刺激锁定活动进行电阈值跟踪的实验。例如，这可以很容易地适应由APTrack驱动的光脉冲的光遗传学刺激。该插件是开源的，可供研究人员在 GPLv3 许可证下使用。它建立在 Open Ephys 平台上，这是一个适应性强、低成本的开源数据采集系统。该插件为下游插件提供了额外的钩子，以提取动作电位信息并提供额外的用户界面或自适应范式。该插件提供了一个简单的用户界面，用于实时可视化和延迟跟踪动作电位。它还可以回放以前的数据并使用时态栅格图对其进行可视化。此外，它还可以在播放以前的数据期间执行延迟跟踪。虽然还有其他软件包可用于实时延迟跟踪，但它们不是开源的，无法执行电阈值跟踪26，27。与传统方法相比，APTrack 在从电压迹线识别恒定延迟动作电位方面具有优势，因为它使用时间栅格图进行数据可视化。此外，我们在低信噪比实验中使用它的经验表明，时间栅格图可视化方法可以识别可能错过的恒定延迟动作电位。
全神经阈值跟踪是评估轴突兴奋性的广泛使用的方法13。啮齿动物C纤维中的单神经元电阈值跟踪以前已被用于量化伤害感受器兴奋性14，其在人类中的实用性得到认可10，11;然而，直到现在，这是不可能的。我们提供了一种新颖的开源工具，用于直接测量啮齿动物和人类周围神经电生理研究中的单一伤害感受器兴奋性。APTrack首次实现了对人类单神经元动作电位的实时、开源、电阈值跟踪。我们预计它将促进啮齿动物和人类之间伤害感受器的转化研究。
Disclosures
G.W.T.N.是布里斯托大学和礼来公司（BB / T508342 / 1）的BBSRC协作培训伙伴关系博士生奖学金。A.P.N.是礼来公司的现任雇员，可能拥有该公司的股票。
Acknowledgments
我们要感谢我们的资助者的支持：医学科学院（J.P.D.，A.E.P.），VS关节炎（J.P.D.，A.E.P.），Jean Golding Institute Seedcorn Grant（J.P.D.，A.E.P.，G.W.，A.C.S.，M.M.P.）和生物技术和生物科学研究委员会与礼来公司（G.W.T.N.）的合作培训伙伴关系博士生奖学金。我们要感谢所有为APTrack开发做出贡献的人。我们还要感谢参与微神经造影实验的志愿者以及我们的患者和公众参与和参与合作者的宝贵贡献。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12V DC Power Supply | NA | NA | To power uStepper S-lite. Required for dial-controlled stimulators. |
| 36 Pin Electrode Adapter Board | Intan Technology | C3410 | APTrack Dependency. For connecting electrode input to headstage. $255 USD as of March 2021. |
| APTrack Plugin | NA | NA | https://github.com/Microneurography/APTrack |
| Bipolar Ag/AgCl Recording Electrode | Custom | NA | Recording electrode for the skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Concentric Stimulating Electrode | World Precision Instruments | SNE-100 | For electrical stimulation in the mouse skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| Bipolar Transcutaneous Stimulating Electrode | Custom | NA | For transcutaneous electrical stimulation while searching for single-neuron action potentials during microneurography. |
| BNC T Splitter (1+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC T splitter. |
| BNC to BNC cables (3+) | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard BNC cables. |
| C6H11NaO7 | Merck | S2054 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| CaCl2 | Merck | C5670 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Digitimer DS4 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS4 | Constant current stiulator for animal research. £1,695 GBP as of September 2022. |
| Digitimer DS7 Constant Current Stimulator | Digitimer | DS7A | Constant current stiulator for human research. £3,400 GBP as of September 2022. |
| Electroaccupuncture Classic Plus Stimulating Electrodes | Harmony Medical | NA | For fixed position intradermal electrical stimulation of the dorsal aspect of the foot during human microneurography. |
| Glucose | Fisher Scientific | G/0450/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| HDMI Cable | NA | NA | APTrack Dependency. Any standard passive HMDI cable. To connect OE I/O Board to OE Acquisition Board. |
| KCl | Merck | P9541 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| MgSO4 | Acros Organics | 213115000 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Mineral Oil | Merck | 330779 | Electrical insulation for nerve recordings in th skin-nerve preparation. Or equivalent. |
| NaCl | Merck | S9888 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S6014 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| NaHCO3 | Merck | S0751 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| Open Ephys Acquisition Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. Includes USB cable to connect to computer and mains socket power supply. €2,955 EUR as of September 2022. |
| Open Ephys Graphical User Interface | Open Ephys | NA | https://github.com/open-ephys/plugin-GUI |
| Open Ephys I/O Board | Open Ephys | NA | APTrack Dependency. For ADC voltage inputs via BNC cables. €12.5 EUR without connectors, €85 EUR with connectors as of September 2022. |
| PulsePal V2 | Sanworks | 1102 | APTrack Dependency. Open-source DAC and train generator. $725 USD pre-assembled as of September 2022. Approx. $275 USD for self-assembly. |
| RHD 6ft SPI Cable | Intan Technology | C3206 | APTrack Dependency. For connecting headstage to OE Acquisition Board. $295 USD as of March 2021 |
| RHD2216 16ch Bipolar Headstage | Intan Technology | C3313 | APTrack Dependency. For data acquisition and digitization. $725 USD as of March 2021. Or equivalent RHD2000 series headstage. |
| Sucrose | Fisher Scientific | S/8560/60 | Skin-nerve preparation synthetic interstitial fluid constituent. Or equivalent. |
| TCS-II Thermal Stimulator | QST.Lab | NA | For thermal stimualtion of nociceptor receptive fields during human microneurography. |
| Tungsten Microelectrode Pair (Active + Reference) | FHC | 30085 | For microneurography recordings. 35mm. |
| Ultrasound Scanner iQ+ | Butterfly Network | NA | For ultrasound-guided electrode insertion during microneurography. |
| USB 3.0 5kV RMS Isolation | Inota Technology | 7055-D | For isolating human microneuroography participant from computer. €459 EUR as of September 2022. |
| USB-A to micro USB-B cable (2) | NA | NA | APTrack Dependency. To connect computer to PulsePal and to uStepper S-lite if using stepper-stimulator interfacing. |
| uStepper S-lite + NEMA17 motor | uStepper | NA | To interface with stimulators via a control dial. €50 EUR as of September 2022. |
| Von Frey Filaments | Ugo Basile | 37450-275 | For mechanical stimulation of receptive fields during sensory phenotyping of nociceptors. |
References
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