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Methodenartikel

Rattenmodell der normothermischen Ex-situ-perfundierten heterotopen Herztransplantation

2.1K Aufrufe

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DOI:

10.3791/64954

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21. April 2023

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1Department of Medical Science, Chonnam National University Graduate School, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 3Cardiovascular and Respiratory Research Team, Chonnam National University Hospital, 4Department of Internal Medicine, Chonnam National University Hospital and Medical School, 5Departments of Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 6Department of Pediatrics, Chonnam National University Children’s Hospital, and Medical School

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Erratum-Hinweis

Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice

Zusammenfassung

In dieser Arbeit stellen wir ein Bewertungsprotokoll eines heterotopisch implantierten Herzens nach normothermer ex situ Konservierung im Rattenmodell vor.

Zusammenfassung

Die Herztransplantation ist die wirksamste Therapie bei Herzinsuffizienz im Endstadium. Trotz der Verbesserungen bei den therapeutischen Ansätzen und Interventionen nimmt die Zahl der Herzinsuffizienzpatienten, die auf eine Transplantation warten, weiter zu. Die normotherme Ex-situ-Konservierungstechnik hat sich als vergleichbare Methode zur konventionellen statischen Kühllagerungstechnik etabliert. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Spenderherzen bis zu 12 Stunden in physiologischem Zustand konserviert werden können. Darüber hinaus ermöglicht diese Technik die Wiederbelebung der Spenderherzen nach dem Kreislauftod und wendet die erforderlichen pharmakologischen Eingriffe an, um die Spenderfunktion nach der Implantation zu verbessern. Zahlreiche Tiermodelle wurden etabliert, um normotherme Ex-situ-Konservierungstechniken zu verbessern und konservierungsbedingte Komplikationen zu beseitigen. Obwohl große Tiermodelle im Vergleich zu Kleintiermodellen einfach zu handhaben sind, ist es kostspielig und herausfordernd. Wir präsentieren ein Rattenmodell der normothermen ex situ Spenderherzkonservierung gefolgt von einer heterotopen abdominalen Transplantation. Dieses Modell ist relativ billig und kann von einem einzigen Experimentator durchgeführt werden.

Einleitung

Die Herztransplantation ist nach wie vor die einzige praktikable Therapie bei refraktärer Herzinsuffizienz 1,2,3,4. Trotz eines stetigen Anstiegs der Zahl der Patienten, die eine Herztransplantation benötigen, wurde kein proportionaler Anstieg der Verfügbarkeit von Spenderorganen beobachtet5. Um dieses Problem anzugehen, wurden neuartige Ansätze zur Konservierung von Spenderherzen entwickelt, mit dem Ziel, die Herausforderungen zu verbessern und die Verfügbarkeit von Spendern zu erhöhen 6,7,8,9.

Die normothermische Ex-situ-Herzperfusion (NESHP) mit Geräten des Organversorgungssystems (OCS) hat sich als klinische Intervention herauskristallisiert 1,3. Diese Technik wurde als geeignete Alternative zur herkömmlichen statischen Kühllagermethode (SCS) erachtet 2,9. NESHP verkürzt effektiv die Dauer der Kälteischämie, verringert den Stoffwechselbedarf und ermöglicht eine optimale Nährstoffversorgung und Sauerstoffversorgung während des Transports von Spenderorganen10,11. Trotz des eindeutigen Potenzials dieser Methode, die Konservierung von Spenderorganen zu verbessern, wurden ihre klinische Anwendung und weitere Untersuchungen durch hohe Kosten eingeschränkt. Daher sind präklinische Tiermodelle der NESHP von entscheidender Bedeutung, um die wichtigsten technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit dieser Technik zu identifizieren12,13. Schweine und Ratten sind aufgrund ihrer ischämischen Toleranz die bevorzugten Tiermodelle für präklinische Studien9. Obwohl das Schweinemodell ideal für die Grundlagen- und translationale Forschung ist, ist es durch seine hohen Kosten und den intensiven Arbeitsaufwand für Pflege und Wartung begrenzt. Im Gegensatz dazu sind Rattenmodelle kostengünstiger und einfacher zu handhaben14.

In dieser Studie stellen wir ein vereinfachtes Rattenmodell von NESHP vor, gefolgt von einer heterotopen Herztransplantation, um den Einfluss der Konservierungstechnik auf den Transplantatzustand nach der Implantation zu bewerten. Dieses Modell ist einfach, kostengünstig und kann von einem einzigen Experimentator ausgeführt werden. Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung des Verfahrens.

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Protokoll

Die Ethikkommission des Versuchstierforschungszentrums des Nationalen Universitätskrankenhauses Chonnam (Zulassungs-Nr. CNU IACUC - H - 2022-36) genehmigte alle Tierversuche. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (350-450 g), die in dieser Studie verwendet wurden, wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung der Versuchstiere behandelt. Die Ratten wurden in temperaturkontrollierten Räumen mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht, wobei Standardfutter und Wasser zur Verfügung standen.

1. Vorbereitung

HINWEIS: Ein einziger Versuchsleiter kann alle experimentellen Verfahren durchführen.

  1. Montieren Sie die Langendorff-Apparatur, einschließlich des Oxygenators, der Pumpe und der Perfusionsleitungen, vor der Operation (Abbildung 2). Füllen Sie den Perfusionskreislauf mit 20 ml Kochsalzlösung und lassen Sie ihn zirkulieren, bis er mit Eigenblut gefüllt ist.
    HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts ist es, den extrakorporalen Kreislauf zu erwärmen.
  2. Befestigen Sie den kardioplegikerischen Zugang über den an der Aortenkanüle befestigten Absperrhahn und bereiten Sie die Spritzenpumpe für die abschließende kardioplegikerische Infusion vor.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen aus dem Perfusionskreislauf und dem kardioplegischen Zugang entfernt werden.
  3. Platzieren Sie den Temperatursensor in dem Reservoir, in dem das Spenderherz aufbewahrt wird, und halten Sie die Temperatur des Kreislaufs bei 37 °C.
  4. Chirurgische Vorbereitungen
    1. Bereiten Sie für jede Spender- und Empfängerratte einen separaten Satz steriler Mikroinstrumente und Materialien vor.
      1. Bereiten Sie das chirurgische Set für den Spender vor: chirurgische Schere, Mikropinzette, scharfe Moskizzange, 5-0 Seidennähte, Wattestäbchen, 50-ml-Spritze, Perfusionsleitung für die kardioplegikerische Lösung (CPS), Spritzenpumpe, 18-G-Angiokatheter, ein Satz von 5 Fr. Femurkathetern und sterile Gaze.
      2. Bereiten Sie das chirurgische Set für den Empfänger vor: mikrochirurgische Schere, Wundretraktor, Mikropinzette, Moskizzange, vaskuläre Mikroklemmen, 1-ml-Spritze, ein 5-0- und 9-0-Polypropylen-Nahtmaterial, 5-0-Seidennähte, Wattestäbchen und sterile Gaze.

2. Konservierung und Blutentnahme des Spenderherzes

  1. Die Anästhesie bei der Spenderratte mit Isofluran (5%) in der Anästhesiekammer einleiten und das Gewicht der Ratte aufzeichnen, bevor sie auf den Operationstisch gelegt wird.
  2. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf den Operationstisch und verabreichen Sie eine kontinuierliche Anästhesie, indem Sie 2%-2,5% Isofluran mit 90% Sauerstoff durch eine Nasenspitze abgeben.
  3. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die mangelnde Reaktion auf das Einklemmen der Zehen und die Atemfrequenz überprüfen, die zwischen 50 und 60 pro Minute liegen sollte.
    HINWEIS: Ein angemessenes Maß an Anästhesie ist entscheidend, um unnötigen Stress und Schmerzen für die Spenderratte zu vermeiden.
  4. Tragen Sie Augengleitmittel auf und rasieren Sie die Schambeinregion bis zum Schlüsselbein, wo die Operation durchgeführt wird. Reinigen Sie den Bereich mit einem Peeling auf Jodbasis und 70%igem Alkohol.
  5. Katheterisierung
    1. Machen Sie einen 7 cm langen Bauchschnitt in der Mittellinie und bilaterale Schnitte von 3 cm vom Processus xiphoideus bis zum mittleren Schlüsselbein. Entfernen Sie das Fell aus dem Brustbereich.
    2. Mobilisieren Sie mit Wattestäbchen die Bauchorgane auf der linken Seite des Bauches. Isolieren Sie die Bauchaorta von der retroperitonealen Faszie und dem Fettgewebe.
    3. Injizieren Sie 1.000 I.E. Heparin, gelöst in 0,3 ml isotonischer Kochsalzlösung, mit einer 1-ml-Spritze durch die untere Hohlvene (IVC). Stoppen Sie Blutungen aus dem Nadelloch, indem Sie es vorsichtig mit einem Wattestäbchen zusammendrücken.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig mit einer Luftembolie während der Injektion, da dies zu einem Herzstillstand führen kann.
    4. Einführen eines 5 Fr. Femurkatheters in die Bauchschlagaorta (Abd. A). Stellen Sie sicher, dass die Katheterspitze den Aortenbogen erreicht. Bestätigen Sie die Katheterposition, indem Sie die ungefähre Länge des eingeführten Teils des Katheters bestimmen.
  6. Blutentnahme
    1. Entnehmen Sie etwa 10 ml Blut über den Katheter, der in den Abd. A eingeführt wird.
    2. Später wird das Priming-Blut mit isotonischer Kochsalzlösung verdünnt, bis das Gesamtvolumen 12 ml erreicht. Fügen Sie 5 mg Cefazolin in 0,3 ml Kochsalzlösung und Insulin (20 I.E.) hinzu.
  7. Herzstillstand
    1. Schließen Sie die zuvor vorbereitete CPS-Perfusionsleitung an den Bauchkatheter an und beginnen Sie die CPS-Verabreichung mit der Spritzenpumpe mit einer Rate von 800 ml/h.
    2. Öffnen Sie die Brusthöhle vom Zwerchfell aus und schneiden Sie die IVC in der Nähe des Zwerchfells durch, um eine ventrikuläre Dehnung zu verhindern. Schneiden Sie die Rippen beidseitig entlang der Brustwirbelsäule bis zum Brusteingang. Reflektieren Sie die mobilisierte ventrale Brustwand überlegen mit einer Mückenzange.
    3. Entfernen Sie den Thymus vollständig mit einer Mikropinzette, um den Aortenbogen sichtbar zu machen. Wenden Sie eine leichte Kompression an, wenn die Thymusarterien bluten.
  8. Extraktion
    1. Nach der Verabreichung des gesamten CPS ist der Aortenbogen vom umgebenden Gewebe zu isolieren. Sezieren Sie vorsichtig direkt unterhalb der linken Schlüsselbeinarterie.
    2. Durchtrennen Sie die Arteria brachiocephalica und die Arteria carotis communis communis an einer entfernten Position, wobei die längeren Stümpfe des Aortenbogens für eine einfache Handhabung während der Aortenkanülierung belassen werden. Durchtrennen Sie die Hauptschlagader der Pulmonalarterie (MPA) so nah wie möglich an der Bifurkation. Achten Sie darauf, das linke Vorhofohr nicht zu beschädigen.
    3. Die obere Hohlvene (SVC) und IVC werden vorsichtig mit 5-0-Seidennähten ligiert, um die Obstruktion des rechten Vorhofs (RA) und der Koronarsinus zu verhindern. Bedecken Sie den linken Rand des Thorax mit nasser Gaze, legen Sie das Herz darauf und ziehen Sie die SVC- und IVC-Ligaturen vorsichtig zurück, um das Hilum freizulegen.
    4. Ligatieren Sie die Vena pulmonalis und Azygos zusammen mit einer 5-0 Seidennaht. Durchtrennen Sie das Gewebe dorsal der Ligatur und extrahieren Sie das Herz. Untersuche das Herz auf Verletzungen. Zum Schluss wird das Herz vor der Aortenkanülierung gewogen.

3. Ex-situ-Perfusion

  1. Kanülierung und Perfusion der Aorta
    1. Ersetzen Sie vor der Kanülierung der Aorta den mit Kochsalzlösung behandelten Kreislauf durch eine Blutansaugung.
    2. Führen Sie die Aortenkanüle in den Aortenbogen ein und fixieren Sie sie mit einer provisorischen Mikroklemme. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Kanüle am brachiozephalen Übergang positioniert ist.
    3. Bestätigen Sie die korrekte Position der Kanüle, indem Sie die Aorta vorsichtig mit einer Mikropinzette greifen.
    4. Beginnen Sie die Perfusion mit einer Flussrate von 2-3 ml/min, so dass Perfusat aus der Kanülenstelle austreten kann, um alle Luftblasen zu entfernen.
    5. Überwachen Sie den Perfusionsdruck und die Temperatur über den Sensor, der an das Überwachungssystem angeschlossen ist.
    6. Massieren Sie das Herz sanft mit dem ersten Finger und dem Zeigefinger, bis venöses Blut aus der Hauptpulmonalarterie (MPA) austritt.
    7. Befestigen Sie die Aorta mit einer 1-0-Seidenligatur und entfernen Sie die Klemme nach Überprüfung aller Einstellungen (Perfusionskreislauf, Perfusionsdruck, Temperatur).
    8. Sobald die permanente Ligatur platziert ist, stellen Sie sicher, dass sich das Herz innerhalb weniger Sekunden zusammenzieht und innerhalb von 60 Sekunden einen normalen Rhythmus erreicht. Ein mittlerer Perfusionsdruck von 55-65 mmHg mit einer koronaren Flussrate von 3-4 mL bei 37 °C deutet auf eine ausreichende Perfusion hin.
    9. Sammeln Sie 0,15 ml Blut aus dem Reservoir und überprüfen Sie die Blutgasanalyse (BGA) zu Beginn der Perfusion und danach alle 20 Minuten. Überwachen und zeichnen Sie den pH-Wert, pCO2,pO2, Glukose, Hämatokrit, Kalium und Laktat während der Perfusion auf. Nach 120 Minuten Perfusion werden 3 ml Custodiol mit einer Geschwindigkeit von 250 ml/h durch die Spritzenpumpe verabreicht, um das Herz zum Stillstand zu bringen.

4. Implantation

  1. Vorbereitung des Empfängers
    1. Beginnen Sie mit der Präparation des Empfängers 30 Minuten vor Beendigung der Ex-situ-Perfusion .
    2. Betäuben Sie das Empfängertier mit der gleichen Methode wie in Schritt 2.2 beschrieben.
    3. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf das Heizkissen und führen Sie den Temperaturfühler in das Rektum ein, um die Körpertemperatur bei 37 °C zu halten.
    4. Tragen Sie Augengleitmittel auf, rasieren Sie die Schambeinfläche bis zum Magenbereich und reinigen Sie den Bereich mit einem Peeling auf Jodbasis und 70%igem Alkohol.
  2. Medikamente
    1. Injizieren Sie 2 ml warme Kochsalzlösung subkutan, um den Flüssigkeitsverlust während der Operation auszugleichen. Injizieren Sie 200 IE Heparin subkutan.
    2. Verabreichen Sie eine Antibiotikaprophylaxe durch Injektion von 10 mg/kg Cefazolin, gelöst in 0,3 ml Kochsalzlösung, subkutan oder intramuskulär.
    3. Verabreichen Sie Schmerzmittel, indem Sie 20 mg/kg Diclofenac subkutan injizieren.
  3. Führen Sie die Mittellinien-Laparotomie durch und führen Sie einen Retraktor ein, um die Bauchhöhle zu erweitern. Mobilisieren Sie die Bauchorgane auf der linken Seite des Empfängers mit Wattestäbchen, um Platz für den Eingriff zu schaffen.
  4. Beugen Sie einer Dehydrierung vor, indem Sie die Bauchorgane mit warmer und feuchter Gaze umwickeln. Verteilen Sie während der Operation zeitweise warme Kochsalzlösung mit einer 50-ml-Spritze.
  5. Mobilisieren Sie mit einem Operationsmikroskop mit 10-facher Vergrößerung den Zwölffingerdarm und das proximale Jejunum durch stumpfe Dissektion mit Wattestäbchen, um die Abd. A. und IVC freizulegen. Bereiten Sie die Abd. A und IVC für die Anastomose und die systematische Implantation des Spenderherzens gemäß Abbildung 3 oder zuvor dokumentierten Methoden15.
    HINWEIS: Trennen Sie die Abd. A. und IVC nicht.
    1. Unter der Annahme, dass die vaskuläre Anastomose infrarenal platziert wird, bereiten Sie einen ausreichenden Teil der Aorta und der IVC für die Klemmung vor.
    2. Führen Sie eine stumpfe Präparation mit Wattestäbchen oder einer scharf gezackten Pinzette durch, um die Fette und Faszien um die Gefäße herum zu entfernen.
    3. Platzieren Sie 5-0 Seidenligaturen an den Mesenterialästen und sowohl an der kranialen als auch an der kaudalen Seite der großen Gefäße. Heben Sie die Bauchgefäße an und koagulieren oder ligieren Sie die Lendenäste mit 5-0 Seidennähten. Denken Sie daran, die Hodenarterien und Venen zu schonen und nicht abzuklemmen.
    4. Verwenden Sie Ligaturen, um die Gefäße anzuheben, und positionieren Sie die Mikroklemmen an den Mesenterialästen, der kaudalen und kranialen Seite der großen Gefäße, um den Blutfluss an der Anastomosenstelle zu stoppen. Schalten Sie das Heizkissen aus, bevor Sie die Klemmen einsetzen, da übermäßiges Erhitzen die Ischämie der Gliedmaßen verschlimmern kann. Stellen Sie sicher, dass das Heizkissen nach dem Lösen der Gefäße eingeschaltet wird, um eine Unterkühlung zu vermeiden.
    5. Die Aorta wird mit einer 27-G-Nadel punktiert und der Schnitt mit einer Mikroschere auf eine Länge verlängert, die gleich oder etwas größer ist als die Öffnung der aufsteigenden Aorta des Spenders (Asc. A), das sind ca. 5 mm.
    6. Machen Sie einen Längsschnitt an der IVC auf die gleiche Weise wie bei der Aortotomie, aber machen Sie ihn 3 mm näher an der kaudalen Seite als an der Aorteninzision.
    7. Beginnen Sie mit der Anastomose, legen Sie das Spenderherz auf die rechte Seite des Bauches des Empfängers und befestigen Sie das Spender-Asc. A an die Abd. A mit einem einfachen unterbrochenen Stich (9-0 Polypropylen) an der Schädelecke des Längsschnitts.
    8. Bewegen Sie das Herz auf die linke Seite des Empfängerabdomens und führen Sie eine Anastomose des ASC des Spenders durch. A mit dem Abd. A mit einem laufenden 9-0 Polypropylen-Nahtmaterial.
    9. Fixieren Sie die Spenderpulmonalarterie mit zwei unterbrochenen Nähten (9-0 Polypropylen) an den kaudalen und kranialen Ecken des Längsschnitts an der IVC.
    10. Führen Sie die erste Hälfte der venösen Anastomose von der intraluminalen Seite des Gefäßes aus durch und vervollständigen Sie die zweite Hälfte von der extraluminalen Seite des Gefäßes. Bevor Sie die Knoten festziehen, spülen Sie das Feld mit Kochsalzlösung, um eine Luftembolie zu vermeiden.
  6. Entlüften und Entspannen
    1. Entfernen Sie die Mesenterialvenenklemme zuerst nach Abschluss der Anastomose, damit sich die rechte Seite des Herzens mit venösem Blut füllen kann.
    2. Entfernen Sie die Luft im Koronarkreislauf und Asc. A. durch Anwendung einer retrograden Koronarperfusion für mehrere Sekunden.
    3. Legen Sie ein Stück Gaze auf beide Seiten der Gefäße und entfernen Sie die kaudale Klemme und die Schädelklemme.
    4. Sanfte Kompression mit Wattestäbchen für 1-2 Min. auftragen. Nachdem Sie eine ausreichende Hämostase sichergestellt haben, entfernen Sie die Tupfer und waschen Sie die Anastomosen mit warmer Kochsalzlösung.
      HINWEIS: Das Herz sollte innerhalb der ersten Minute der Reperfusion zu schlagen beginnen. Liegt die Körpertemperatur der Empfängerratte unter 35 °C, normalisiert sich der Herzrhythmus, sobald die Temperatur 36 °C erreicht hat.
  7. Ersetzen Sie die Bauchorgane mäanderartig und verschließen Sie die Schichten des Bauchschnitts mit durchgehenden 5-0-Polypropylennähten.
  8. Nach der Operation wird das betäubte Tier auf eine saubere Stelle über einem Heizkissen gelegt, bis die Körpertemperatur 37 °C erreicht.
    HINWEIS: Beginnen Sie mit den postoperativen Untersuchungen erst, wenn die Körpertemperatur 37 °C erreicht hat. Halten Sie die Anästhesie bis zum Ende der Experimente bei 2-2,5% Isofluran aufrecht.
  9. Überwachen Sie das EKG des transplantierten Spenderherzens 3 Stunden lang. Dann wird das Herz unter tiefer Betäubung für histologische Untersuchungen herausgeschnitten.
    HINWEIS: Bestätigen Sie die Anästhesietiefe durch fehlenden Pedalreflex, bevor Sie das Herz entfernen. Der chirurgische Eingriff und die EKG-Überwachung dauern weniger als 6 h. Diclofenac, perioperativ verabreicht (Schritt 4.2.3.), ermöglicht eine Schmerztherapie über die gesamte Dauer dieses Eingriffs. Das Analgesie-Regime kann gemäß den institutionellen Richtlinien für die Verwendung von Tieren angepasst werden.

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Ergebnisse

Abbildung 1 zeigt den Versuchsaufbau in einem Kleintiermodell. Abbildung 2 zeigt die modifizierte Langendorff-Perfusionsapparatur, die einen Kleintier-Oxygenator enthält. Die Reihenfolge der Anastomose bei der heterotopen abdominalen Implantation ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 4 zeigt die Parameter, die zur Beurteilung der Lebensfähigkeit des Herzens während der

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Diskussion

Unser Fokus bei der Etablierung dieses Modells lag auf der Replikation der normothermen menschlichen Herztransplantation. Modelle ohne Auswurf sind die allgemein bevorzugte Technik zur Konservierung des Spenderherzens in einer Ex-situ-Umgebung 16. Während auswerfende Modelle viele Vorteile bei der Beurteilung der Herzfunktion während der Ex-situ-Perfusion bieten17, sind sie für heterotope Transplantationsmodelle nicht geeignet. Bei der heterotopen Transpla...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss B2021-0991 des Chonnam National University Hospital Biomedical Research Institute und NRF-2020R1F1A1073921 der National Research Foundation of Korea unterstützt

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Aktives AES-EvakuierungssystemSmiths medicalPC-6769-51AVerwendung von CO2 und überschüssigem Isofluran
AnästhesiegerätSmiths medicalPC-8801-01AMischt Isofluran und Oxyegn und liefert es an Tiere
B20-PatientenmonitorMedical SystemsB20zur Überwachung des mittleren Aortendrucks und der Temperatur
Homöothermisches ÜberwachungssystemHarvard-Gerät55-7020Zur Überwachung und Aufrechterhaltung der Temperatur des Tieres
Micro-1 RattenoxygenatorDongguan Kewei medizinische InstrumenteMicro-MOFür den Gasaustausch im Langendorff-Kreislauf
Mikropunktur-EinführsetCOOK medicalG48007zur Abgabe einer kardioplegischen Lösung an den Bogen durch die Bauchaorta
MikroskopAmscopeMU1403Zum Zoomen chirurgisch Feld (Empfänger)
Chirurgische LupeSurgiTelL2S09Zum Zoomen des chirurgischen Feldes (Spender)
SpritzenpumpeAMP alleSP-8800Zur Verabreichung von kardioplegischen Lösungen
Transsonischer DurchflusssensorTransonicME3PXL-M5Durchflusssensor für Perfusionskreise
Transsonisches Durchflussmodul für SchläucheTransonicTS410Durchflusserfassungssystem
Watson - Marlow PumpenHarvard apparat010.6131.DAOPeristaltische Pumpe für die Rezirkulation von Perfusat
WBC-1510AJEIO TECHHeizbad
Sprague-Dawley RattenSamtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel AugentropfenSENTRIX TierpflegeFeuchte Salben für das Auge
CefazolinJW pharmazeutischBei Prophilaxis
CustodiolDR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBHZur Herzentnahme
DiclofenacMyungmoon Pharm. Co. LtdZur Schmerzkontrolle
HeparinJW pharmazeutischAntikoagulans
InsulinJW pharmazeutischeHormontherapie
KochsalzlösungJW PharmazeutikaFür die Hydratationstherapie
GE E03056D

Referenzen

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Nachdrucke und Genehmigungen

Erratum


Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 8/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.

Section 4 of the Protocol was updated from:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.

to:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
  8. After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C. 
    NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments.
  9. Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
    NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.

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