Rattenmodell der normothermischen Ex-situ-perfundierten heterotopen Herztransplantation

Die Herztransplantation ist nach wie vor die einzige praktikable Therapie bei refraktärer Herzinsuffizienz 1,2,3,4. Trotz eines stetigen Anstiegs der Zahl der Patienten, die eine Herztransplantation benötigen, wurde kein proportionaler Anstieg der Verfügbarkeit von Spenderorganen beobachtet⁵. Um dieses Problem anzugehen, wurden neuartige Ansätze zur Konservierung von Spenderherzen entwickelt, mit dem Ziel, die Herausforderungen zu verbessern und die Verfügbarkeit von Spendern zu erhöhen 6,7,8,9.

Die normothermische Ex-situ-Herzperfusion (NESHP) mit Geräten des Organversorgungssystems (OCS) hat sich als klinische Intervention herauskristallisiert ^1,3. Diese Technik wurde als geeignete Alternative zur herkömmlichen statischen Kühllagermethode (SCS) erachtet ^2,9. NESHP verkürzt effektiv die Dauer der Kälteischämie, verringert den Stoffwechselbedarf und ermöglicht eine optimale Nährstoffversorgung und Sauerstoffversorgung während des Transports von Spenderorganen^10,11. Trotz des eindeutigen Potenzials dieser Methode, die Konservierung von Spenderorganen zu verbessern, wurden ihre klinische Anwendung und weitere Untersuchungen durch hohe Kosten eingeschränkt. Daher sind präklinische Tiermodelle der NESHP von entscheidender Bedeutung, um die wichtigsten technischen Herausforderungen im Zusammenhang mit dieser Technik zu identifizieren^12,13. Schweine und Ratten sind aufgrund ihrer ischämischen Toleranz die bevorzugten Tiermodelle für präklinische Studien⁹. Obwohl das Schweinemodell ideal für die Grundlagen- und translationale Forschung ist, ist es durch seine hohen Kosten und den intensiven Arbeitsaufwand für Pflege und Wartung begrenzt. Im Gegensatz dazu sind Rattenmodelle kostengünstiger und einfacher zu handhaben¹⁴.

In dieser Studie stellen wir ein vereinfachtes Rattenmodell von NESHP vor, gefolgt von einer heterotopen Herztransplantation, um den Einfluss der Konservierungstechnik auf den Transplantatzustand nach der Implantation zu bewerten. Dieses Modell ist einfach, kostengünstig und kann von einem einzigen Experimentator ausgeführt werden. Abbildung 1 zeigt die schematische Darstellung des Verfahrens.

Die Ethikkommission des Versuchstierforschungszentrums des Nationalen Universitätskrankenhauses Chonnam (Zulassungs-Nr. CNU IACUC - H - 2022-36) genehmigte alle Tierversuche. Männliche Sprague-Dawley-Ratten (350-450 g), die in dieser Studie verwendet wurden, wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die Pflege und Verwendung der Versuchstiere behandelt. Die Ratten wurden in temperaturkontrollierten Räumen mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus untergebracht, wobei Standardfutter und Wasser zur Verfügung standen.

1. Vorbereitung

HINWEIS: Ein einziger Versuchsleiter kann alle experimentellen Verfahren durchführen.

1. Montieren Sie die Langendorff-Apparatur, einschließlich des Oxygenators, der Pumpe und der Perfusionsleitungen, vor der Operation (Abbildung 2). Füllen Sie den Perfusionskreislauf mit 20 ml Kochsalzlösung und lassen Sie ihn zirkulieren, bis er mit Eigenblut gefüllt ist.
   HINWEIS: Das Ziel dieses Schritts ist es, den extrakorporalen Kreislauf zu erwärmen.
2. Befestigen Sie den kardioplegikerischen Zugang über den an der Aortenkanüle befestigten Absperrhahn und bereiten Sie die Spritzenpumpe für die abschließende kardioplegikerische Infusion vor.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass alle Luftblasen aus dem Perfusionskreislauf und dem kardioplegischen Zugang entfernt werden.
3. Platzieren Sie den Temperatursensor in dem Reservoir, in dem das Spenderherz aufbewahrt wird, und halten Sie die Temperatur des Kreislaufs bei 37 °C.
4. Chirurgische Vorbereitungen
   1. Bereiten Sie für jede Spender- und Empfängerratte einen separaten Satz steriler Mikroinstrumente und Materialien vor.
      1. Bereiten Sie das chirurgische Set für den Spender vor: chirurgische Schere, Mikropinzette, scharfe Moskizzange, 5-0 Seidennähte, Wattestäbchen, 50-ml-Spritze, Perfusionsleitung für die kardioplegikerische Lösung (CPS), Spritzenpumpe, 18-G-Angiokatheter, ein Satz von 5 Fr. Femurkathetern und sterile Gaze.
      2. Bereiten Sie das chirurgische Set für den Empfänger vor: mikrochirurgische Schere, Wundretraktor, Mikropinzette, Moskizzange, vaskuläre Mikroklemmen, 1-ml-Spritze, ein 5-0- und 9-0-Polypropylen-Nahtmaterial, 5-0-Seidennähte, Wattestäbchen und sterile Gaze.

2. Konservierung und Blutentnahme des Spenderherzes

1. Die Anästhesie bei der Spenderratte mit Isofluran (5%) in der Anästhesiekammer einleiten und das Gewicht der Ratte aufzeichnen, bevor sie auf den Operationstisch gelegt wird.
2. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf den Operationstisch und verabreichen Sie eine kontinuierliche Anästhesie, indem Sie 2%-2,5% Isofluran mit 90% Sauerstoff durch eine Nasenspitze abgeben.
3. Überprüfen Sie die Tiefe der Anästhesie, indem Sie die mangelnde Reaktion auf das Einklemmen der Zehen und die Atemfrequenz überprüfen, die zwischen 50 und 60 pro Minute liegen sollte.
   HINWEIS: Ein angemessenes Maß an Anästhesie ist entscheidend, um unnötigen Stress und Schmerzen für die Spenderratte zu vermeiden.
4. Tragen Sie Augengleitmittel auf und rasieren Sie die Schambeinregion bis zum Schlüsselbein, wo die Operation durchgeführt wird. Reinigen Sie den Bereich mit einem Peeling auf Jodbasis und 70%igem Alkohol.
5. Katheterisierung
   1. Machen Sie einen 7 cm langen Bauchschnitt in der Mittellinie und bilaterale Schnitte von 3 cm vom Processus xiphoideus bis zum mittleren Schlüsselbein. Entfernen Sie das Fell aus dem Brustbereich.
   2. Mobilisieren Sie mit Wattestäbchen die Bauchorgane auf der linken Seite des Bauches. Isolieren Sie die Bauchaorta von der retroperitonealen Faszie und dem Fettgewebe.
   3. Injizieren Sie 1.000 I.E. Heparin, gelöst in 0,3 ml isotonischer Kochsalzlösung, mit einer 1-ml-Spritze durch die untere Hohlvene (IVC). Stoppen Sie Blutungen aus dem Nadelloch, indem Sie es vorsichtig mit einem Wattestäbchen zusammendrücken.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig mit einer Luftembolie während der Injektion, da dies zu einem Herzstillstand führen kann.
   4. Einführen eines 5 Fr. Femurkatheters in die Bauchschlagaorta (Abd. A). Stellen Sie sicher, dass die Katheterspitze den Aortenbogen erreicht. Bestätigen Sie die Katheterposition, indem Sie die ungefähre Länge des eingeführten Teils des Katheters bestimmen.
6. Blutentnahme
   1. Entnehmen Sie etwa 10 ml Blut über den Katheter, der in den Abd. A eingeführt wird.
   2. Später wird das Priming-Blut mit isotonischer Kochsalzlösung verdünnt, bis das Gesamtvolumen 12 ml erreicht. Fügen Sie 5 mg Cefazolin in 0,3 ml Kochsalzlösung und Insulin (20 I.E.) hinzu.
7. Herzstillstand
   1. Schließen Sie die zuvor vorbereitete CPS-Perfusionsleitung an den Bauchkatheter an und beginnen Sie die CPS-Verabreichung mit der Spritzenpumpe mit einer Rate von 800 ml/h.
   2. Öffnen Sie die Brusthöhle vom Zwerchfell aus und schneiden Sie die IVC in der Nähe des Zwerchfells durch, um eine ventrikuläre Dehnung zu verhindern. Schneiden Sie die Rippen beidseitig entlang der Brustwirbelsäule bis zum Brusteingang. Reflektieren Sie die mobilisierte ventrale Brustwand überlegen mit einer Mückenzange.
   3. Entfernen Sie den Thymus vollständig mit einer Mikropinzette, um den Aortenbogen sichtbar zu machen. Wenden Sie eine leichte Kompression an, wenn die Thymusarterien bluten.
8. Extraktion
   1. Nach der Verabreichung des gesamten CPS ist der Aortenbogen vom umgebenden Gewebe zu isolieren. Sezieren Sie vorsichtig direkt unterhalb der linken Schlüsselbeinarterie.
   2. Durchtrennen Sie die Arteria brachiocephalica und die Arteria carotis communis communis an einer entfernten Position, wobei die längeren Stümpfe des Aortenbogens für eine einfache Handhabung während der Aortenkanülierung belassen werden. Durchtrennen Sie die Hauptschlagader der Pulmonalarterie (MPA) so nah wie möglich an der Bifurkation. Achten Sie darauf, das linke Vorhofohr nicht zu beschädigen.
   3. Die obere Hohlvene (SVC) und IVC werden vorsichtig mit 5-0-Seidennähten ligiert, um die Obstruktion des rechten Vorhofs (RA) und der Koronarsinus zu verhindern. Bedecken Sie den linken Rand des Thorax mit nasser Gaze, legen Sie das Herz darauf und ziehen Sie die SVC- und IVC-Ligaturen vorsichtig zurück, um das Hilum freizulegen.
   4. Ligatieren Sie die Vena pulmonalis und Azygos zusammen mit einer 5-0 Seidennaht. Durchtrennen Sie das Gewebe dorsal der Ligatur und extrahieren Sie das Herz. Untersuche das Herz auf Verletzungen. Zum Schluss wird das Herz vor der Aortenkanülierung gewogen.

3. Ex-situ-Perfusion

1. Kanülierung und Perfusion der Aorta
   1. Ersetzen Sie vor der Kanülierung der Aorta den mit Kochsalzlösung behandelten Kreislauf durch eine Blutansaugung.
   2. Führen Sie die Aortenkanüle in den Aortenbogen ein und fixieren Sie sie mit einer provisorischen Mikroklemme. Stellen Sie sicher, dass die Spitze der Kanüle am brachiozephalen Übergang positioniert ist.
   3. Bestätigen Sie die korrekte Position der Kanüle, indem Sie die Aorta vorsichtig mit einer Mikropinzette greifen.
   4. Beginnen Sie die Perfusion mit einer Flussrate von 2-3 ml/min, so dass Perfusat aus der Kanülenstelle austreten kann, um alle Luftblasen zu entfernen.
   5. Überwachen Sie den Perfusionsdruck und die Temperatur über den Sensor, der an das Überwachungssystem angeschlossen ist.
   6. Massieren Sie das Herz sanft mit dem ersten Finger und dem Zeigefinger, bis venöses Blut aus der Hauptpulmonalarterie (MPA) austritt.
   7. Befestigen Sie die Aorta mit einer 1-0-Seidenligatur und entfernen Sie die Klemme nach Überprüfung aller Einstellungen (Perfusionskreislauf, Perfusionsdruck, Temperatur).
   8. Sobald die permanente Ligatur platziert ist, stellen Sie sicher, dass sich das Herz innerhalb weniger Sekunden zusammenzieht und innerhalb von 60 Sekunden einen normalen Rhythmus erreicht. Ein mittlerer Perfusionsdruck von 55-65 mmHg mit einer koronaren Flussrate von 3-4 mL bei 37 °C deutet auf eine ausreichende Perfusion hin.
   9. Sammeln Sie 0,15 ml Blut aus dem Reservoir und überprüfen Sie die Blutgasanalyse (BGA) zu Beginn der Perfusion und danach alle 20 Minuten. Überwachen und zeichnen Sie den pH-Wert, pCO2,_pO2, Glukose, Hämatokrit, Kalium und Laktat während der Perfusion auf. Nach 120 Minuten Perfusion werden 3 ml Custodiol mit einer Geschwindigkeit von 250 ml/h durch die Spritzenpumpe verabreicht, um das Herz zum Stillstand zu bringen.

4. Implantation

1. Vorbereitung des Empfängers
   1. Beginnen Sie mit der Präparation des Empfängers 30 Minuten vor Beendigung der Ex-situ-Perfusion .
   2. Betäuben Sie das Empfängertier mit der gleichen Methode wie in Schritt 2.2 beschrieben.
   3. Legen Sie die Ratte in Rückenlage auf das Heizkissen und führen Sie den Temperaturfühler in das Rektum ein, um die Körpertemperatur bei 37 °C zu halten.
   4. Tragen Sie Augengleitmittel auf, rasieren Sie die Schambeinfläche bis zum Magenbereich und reinigen Sie den Bereich mit einem Peeling auf Jodbasis und 70%igem Alkohol.
2. Medikamente
   1. Injizieren Sie 2 ml warme Kochsalzlösung subkutan, um den Flüssigkeitsverlust während der Operation auszugleichen. Injizieren Sie 200 IE Heparin subkutan.
   2. Verabreichen Sie eine Antibiotikaprophylaxe durch Injektion von 10 mg/kg Cefazolin, gelöst in 0,3 ml Kochsalzlösung, subkutan oder intramuskulär.
   3. Verabreichen Sie Schmerzmittel, indem Sie 20 mg/kg Diclofenac subkutan injizieren.
3. Führen Sie die Mittellinien-Laparotomie durch und führen Sie einen Retraktor ein, um die Bauchhöhle zu erweitern. Mobilisieren Sie die Bauchorgane auf der linken Seite des Empfängers mit Wattestäbchen, um Platz für den Eingriff zu schaffen.
4. Beugen Sie einer Dehydrierung vor, indem Sie die Bauchorgane mit warmer und feuchter Gaze umwickeln. Verteilen Sie während der Operation zeitweise warme Kochsalzlösung mit einer 50-ml-Spritze.
5. Mobilisieren Sie mit einem Operationsmikroskop mit 10-facher Vergrößerung den Zwölffingerdarm und das proximale Jejunum durch stumpfe Dissektion mit Wattestäbchen, um die Abd. A. und IVC freizulegen. Bereiten Sie die Abd. A und IVC für die Anastomose und die systematische Implantation des Spenderherzens gemäß Abbildung 3 oder zuvor dokumentierten Methoden¹⁵.
   HINWEIS: Trennen Sie die Abd. A. und IVC nicht.
   1. Unter der Annahme, dass die vaskuläre Anastomose infrarenal platziert wird, bereiten Sie einen ausreichenden Teil der Aorta und der IVC für die Klemmung vor.
   2. Führen Sie eine stumpfe Präparation mit Wattestäbchen oder einer scharf gezackten Pinzette durch, um die Fette und Faszien um die Gefäße herum zu entfernen.
   3. Platzieren Sie 5-0 Seidenligaturen an den Mesenterialästen und sowohl an der kranialen als auch an der kaudalen Seite der großen Gefäße. Heben Sie die Bauchgefäße an und koagulieren oder ligieren Sie die Lendenäste mit 5-0 Seidennähten. Denken Sie daran, die Hodenarterien und Venen zu schonen und nicht abzuklemmen.
   4. Verwenden Sie Ligaturen, um die Gefäße anzuheben, und positionieren Sie die Mikroklemmen an den Mesenterialästen, der kaudalen und kranialen Seite der großen Gefäße, um den Blutfluss an der Anastomosenstelle zu stoppen. Schalten Sie das Heizkissen aus, bevor Sie die Klemmen einsetzen, da übermäßiges Erhitzen die Ischämie der Gliedmaßen verschlimmern kann. Stellen Sie sicher, dass das Heizkissen nach dem Lösen der Gefäße eingeschaltet wird, um eine Unterkühlung zu vermeiden.
   5. Die Aorta wird mit einer 27-G-Nadel punktiert und der Schnitt mit einer Mikroschere auf eine Länge verlängert, die gleich oder etwas größer ist als die Öffnung der aufsteigenden Aorta des Spenders (Asc. A), das sind ca. 5 mm.
   6. Machen Sie einen Längsschnitt an der IVC auf die gleiche Weise wie bei der Aortotomie, aber machen Sie ihn 3 mm näher an der kaudalen Seite als an der Aorteninzision.
   7. Beginnen Sie mit der Anastomose, legen Sie das Spenderherz auf die rechte Seite des Bauches des Empfängers und befestigen Sie das Spender-Asc. A an die Abd. A mit einem einfachen unterbrochenen Stich (9-0 Polypropylen) an der Schädelecke des Längsschnitts.
   8. Bewegen Sie das Herz auf die linke Seite des Empfängerabdomens und führen Sie eine Anastomose des ASC des Spenders durch. A mit dem Abd. A mit einem laufenden 9-0 Polypropylen-Nahtmaterial.
   9. Fixieren Sie die Spenderpulmonalarterie mit zwei unterbrochenen Nähten (9-0 Polypropylen) an den kaudalen und kranialen Ecken des Längsschnitts an der IVC.
   10. Führen Sie die erste Hälfte der venösen Anastomose von der intraluminalen Seite des Gefäßes aus durch und vervollständigen Sie die zweite Hälfte von der extraluminalen Seite des Gefäßes. Bevor Sie die Knoten festziehen, spülen Sie das Feld mit Kochsalzlösung, um eine Luftembolie zu vermeiden.
6. Entlüften und Entspannen
   1. Entfernen Sie die Mesenterialvenenklemme zuerst nach Abschluss der Anastomose, damit sich die rechte Seite des Herzens mit venösem Blut füllen kann.
   2. Entfernen Sie die Luft im Koronarkreislauf und Asc. A. durch Anwendung einer retrograden Koronarperfusion für mehrere Sekunden.
   3. Legen Sie ein Stück Gaze auf beide Seiten der Gefäße und entfernen Sie die kaudale Klemme und die Schädelklemme.
   4. Sanfte Kompression mit Wattestäbchen für 1-2 Min. auftragen. Nachdem Sie eine ausreichende Hämostase sichergestellt haben, entfernen Sie die Tupfer und waschen Sie die Anastomosen mit warmer Kochsalzlösung.
      HINWEIS: Das Herz sollte innerhalb der ersten Minute der Reperfusion zu schlagen beginnen. Liegt die Körpertemperatur der Empfängerratte unter 35 °C, normalisiert sich der Herzrhythmus, sobald die Temperatur 36 °C erreicht hat.
7. Ersetzen Sie die Bauchorgane mäanderartig und verschließen Sie die Schichten des Bauchschnitts mit durchgehenden 5-0-Polypropylennähten.
8. Nach der Operation wird das betäubte Tier auf eine saubere Stelle über einem Heizkissen gelegt, bis die Körpertemperatur 37 °C erreicht.
   HINWEIS: Beginnen Sie mit den postoperativen Untersuchungen erst, wenn die Körpertemperatur 37 °C erreicht hat. Halten Sie die Anästhesie bis zum Ende der Experimente bei 2-2,5% Isofluran aufrecht.
9. Überwachen Sie das EKG des transplantierten Spenderherzens 3 Stunden lang. Dann wird das Herz unter tiefer Betäubung für histologische Untersuchungen herausgeschnitten.
   HINWEIS: Bestätigen Sie die Anästhesietiefe durch fehlenden Pedalreflex, bevor Sie das Herz entfernen. Der chirurgische Eingriff und die EKG-Überwachung dauern weniger als 6 h. Diclofenac, perioperativ verabreicht (Schritt 4.2.3.), ermöglicht eine Schmerztherapie über die gesamte Dauer dieses Eingriffs. Das Analgesie-Regime kann gemäß den institutionellen Richtlinien für die Verwendung von Tieren angepasst werden.

Abbildung 1 zeigt den Versuchsaufbau in einem Kleintiermodell. Abbildung 2 zeigt die modifizierte Langendorff-Perfusionsapparatur, die einen Kleintier-Oxygenator enthält. Die Reihenfolge der Anastomose bei der heterotopen abdominalen Implantation ist in Abbildung 3 dargestellt.

Abbildung 4 zeigt die Parameter, die zur Beurteilung der Lebensfähigkeit des Herzens während der Ex-situ-Perfusion verwendet werden, wie z. B. Laktat, Kalium und mittlerer Aortendruck. In dieser Studie verringerte die Verwendung der normothermen Ex-situ-Konservierung die ischämische Gesamtzeit von sechs erfolgreichen Fällen auf 46,2 ± 4,7 Minuten, während die Gesamtzeit außerhalb des Körpers 166,2 ± 4,7 Minuten betrug (Abbildung 5). Die Entnahme des Herzens aus dem Spender und die Vorbereitung auf die Ex-situ-Perfusion und die heterotope Transplantation erforderten 5,8 ± 1,3 Minuten, wie in Abbildung 5 dargestellt. Die Gesamterfolgsrate der Operation betrug 70% und die mittlere Anastomosenzeit der sechs erfolgreichen Fälle betrug 38,4 ± 3,4 min. In allen Experimenten nahm die Herzfrequenz unmittelbar nach der Implantation signifikant ab, erholte sich aber schließlich im Laufe der Zeit, wie in Abbildung 6 dargestellt. Die grobe Struktur der Spenderherzen war nach ex-situ-Konservierung und heterotoper Implantation gut erhalten, wobei keine sichtbaren Schäden festgestellt wurden. Die Hämatoxylin-Eosin-Färbung zeigte jedoch nach 3 h heterotoper Implantation eine erhöhte Anzahl von Entzündungszellen, meist neutrophile Granulozyten (Abbildung 7).

Abbildung 1: Experimentelles Design der normothermen ex situ Herzerhaltung mit heterotoper Herztransplantation. Abkürzungen: BGA = Blutgasanalyse, CPS = kardioplegikerische Lösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2: Schematische Darstellung der modifizierten Ex-situ-Herzkonservierung von Kleintieren. Abkürzungen: Blutdrucksensor = Blutdrucksensor, CPS = kardioplegikerische Lösung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3: Die Reihenfolge der Anastomose bei der heterotopen Herztransplantation . (A) Schematische Darstellung der Position des Spenderherzens im Abdomen des Empfängers und Reihenfolge der Anastomose. (B) Anastomose der aufsteigenden Aorta des Spenders und Anastomose der abdominalen Aorta des Empfängers. (C) Spenderpulmonalarterie und IVC-Anastomose des Empfängers. Abkürzungen: LV = linker Ventrikel, RV = rechter Ventrikel, LA = linker Vorhof, MPA = Hauptpulmonalarterie, IVC = Vena cava inferior. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 4: Parameter für die Viabilitätsbeurteilung während der Ex-situ-Perfusion. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 5: Konservierungszeitleiste der sechs erfolgreich konservierten Herzen. Herzextraktion und Ex-situ-Perfusionserleichterung: 5,8 ± 1,3 Min. Ex-situ-Perfusion: 120 Min. Implantation in das Abdomen der Empfängerratte: 38,4 ± 3,4 Min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 6: Die elektrophysiologische Leistung des Spenderherzens vor der Entnahme und nach der Implantation . (A) Veränderungen der Herzfrequenz. Vorernte, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min: die Zeiten nach der Implantation. (B) Elektrokardiographie-Bilder vor der Entnahme des Spenderherzes und nach 3 Stunden nach der Implantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 7: Makroskopisches (A-C) und mikroskopisches (D-F) Erscheinungsbild des Spenderherzens. (A,D) Vor normotherm ex situ Konservierung. (B,E) Nach normothermischer Ex-situ-Konservierung . (C,F) Nach 2 h heterotoper Implantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte.