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Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Perfundido Normothermic Ex-Situ em Rato

Published: April 21, 2023 doi: 10.3791/64954
Automatic Translation
*1,2,3, *2,3, 2,3, 2, 2,3, 4, 5, 3,6
1Department of Medical Science, Chonnam National University Graduate School, 2Department of Thoracic and Cardiovascular Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 3Cardiovascular and Respiratory Research Team, Chonnam National University Hospital, 4Department of Internal Medicine, Chonnam National University Hospital and Medical School, 5Departments of Surgery, Chonnam National University Hospital and Medical School, 6Department of Pediatrics, Chonnam National University Children’s Hospital, and Medical School
* These authors contributed equally

ERRATUM NOTICE

Summary

Apresentamos aqui um protocolo de avaliação de um coração implantado heterotopicamente após preservação ex situ normotérmica no modelo de ratos.

Abstract

O transplante cardíaco é a terapia mais eficaz para a insuficiência cardíaca terminal. Apesar das melhorias nas abordagens terapêuticas e intervenções, o número de pacientes com insuficiência cardíaca à espera de transplante ainda está aumentando. A técnica de preservação ex situ normotérmica foi estabelecida como um método comparável à técnica convencional de armazenamento estático refrigerado. A principal vantagem dessa técnica é que os corações doados podem ser preservados por até 12 h em uma condição fisiológica. Além disso, essa técnica permite a ressuscitação dos corações doados após a morte circulatória e aplica as intervenções farmacológicas necessárias para melhorar a função do doador após o implante. Numerosos modelos animais foram estabelecidos para melhorar as técnicas normotérmicas de preservação ex situ e eliminar as complicações relacionadas à preservação. Embora os modelos animais de grande porte sejam fáceis de manusear em comparação com os modelos de animais pequenos, é caro e desafiador. Apresentamos um modelo de preservação do coração de doador ex situ normotérmico seguido de transplante abdominal heterotópico. Este modelo é relativamente barato e pode ser realizado por um único experimentador.

Introduction

O transplante cardíaco continua sendo a única terapia viável para insuficiência cardíaca refratária 1,2,3,4. Apesar do aumento constante do número de pacientes com necessidade de transplante cardíaco, não tem sido observado aumento proporcional na disponibilidade de órgãos doados5. Para abordar essa questão, novas abordagens para a preservação do coração dos doadores têm sido desenvolvidas com o objetivo de melhorar os desafios e aumentar a disponibilidade de doadores 6,7,8,9.

A perfusão cardíaca ex situ normotérmica (PSNE) utilizando máquinas do sistema de cuidados de órgãos (SOO) surgiu como uma intervenção clínica 1,3. Essa técnica tem sido considerada uma alternativa adequada ao método convencional de armazenamento estático refrigerado (SCS) 2,9. A PNSNE reduz efetivamente a duração da isquemia fria, diminui a demanda metabólica e facilita o suprimento nutricional e a oxigenação ideais durante o transporte de órgãos doados10,11. Apesar do claro potencial desse método para melhorar a preservação de órgãos de doadores, sua aplicação clínica e investigação adicional têm sido limitadas pelos altos custos. Portanto, modelos animais pré-clínicos de PNEE são cruciais para identificar os principais desafios técnicos associados a essa técnica12,13. Suínos e ratos são os modelos animais preferidos para estudos pré-clínicos devido àsua tolerância isquêmica9. Embora o modelo suíno seja ideal para pesquisa básica e translacional, ele é limitado por seu alto custo e pela mão de obra intensiva necessária para o cuidado e manutenção. Em contraste, os modelos de ratos são mais baratos e fáceis de manusear14.

Neste estudo, apresentamos um modelo simplificado de PNEAN em ratos, seguido de transplante cardíaco heterotópico, para avaliar o impacto da técnica de preservação na condição do enxerto pós-implante. Esse modelo é simples, econômico e pode ser executado por um único experimentador. A Figura 1 mostra os esquemas do procedimento.

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Protocol

O comitê de ética do Centro de Pesquisa em Animais de Laboratório do Hospital Universitário Nacional de Chonnam (aprovação nº. CNU IACUC - H - 2022-36) aprovou todos os experimentos com animais. Ratos machos da raça Sprague-Dawley (350-450 g), utilizados neste estudo, receberam cuidados de acordo com as orientações para os cuidados e uso dos animais de laboratório. Os ratos foram alojados em salas com temperatura controlada, com ciclo claro-escuro de 12 h, com ração padrão e água disponíveis.

1. Preparo

NOTA: Um único experimentador pode conduzir todos os procedimentos experimentais.

  1. Montar o aparelho de Langendorff, incluindo o oxigenador, a bomba e as linhas de perfusão, antes da cirurgia (Figura 2). Preencher o circuito de perfusão com 20 mL de soro fisiológico e circular até que seja preparado com sangue autólogo.
    OBS: O objetivo desta etapa é aquecer o circuito extracorpóreo.
  2. Conecte a linha cardioplégica ao circuito através da torneira conectada à cânula aórtica e prepare a bomba de seringa para a infusão cardioplégica final.
    NOTA: Garantir a remoção de quaisquer bolhas de ar do circuito de perfusão e da linha cardioplégica.
  3. Coloque o sensor de temperatura dentro do reservatório onde ficará armazenado o coração doador, mantendo a temperatura do circuito em 37 °C.
  4. Preparações cirúrgicas
    1. Preparar um conjunto separado de micro-instrumentos e materiais estéreis para cada rato doador e receptor.
      1. Preparar o conjunto cirúrgico para o doador: par de tesouras cirúrgicas, par de micropinças, pinças pontiagudas de mosquito, suturas de seda 5-0, cotonetes, seringa de 50 mL, linha de perfusão para solução cardioplégica (CPS), bomba de seringa, cateter angiocateter 18 G, um conjunto de cateteres femorais de 5 Fr. e gazes estéreis.
      2. Preparar o conjunto cirúrgico para o receptor: tesoura microcirúrgica, afastador de ferida, par de micropinças, pinça mosquito, micropinças vasculares, seringa de 1 mL, uma sutura de polipropileno 5-0 e 9-0, suturas de seda 5-0, swabs de algodão e gazes estéreis.

2. Preservação do coração do doador e coleta de sangue

  1. Induzir anestesia no rato doador com isoflurano (5%) na câmara de anestesia e registrar o peso do rato antes de colocá-lo na mesa cirúrgica.
  2. Colocar o rato em decúbito dorsal na mesa cirúrgica e administrar anestesia contínua administrando isoflurano a 2%-2,5% com oxigênio a 90% através de um cone nasal.
  3. Verifique a profundidade da anestesia verificando a falta de resposta ao pinçamento do dedo do pé e a frequência respiratória, que deve estar entre 50-60 por minuto.
    NOTA: Um nível adequado de anestesia é crucial para evitar estresse e dor desnecessários para o rato doador.
  4. Aplique lubrificante ocular e raspe a região do púbis até a clavícula, onde será realizada a cirurgia. Limpe a área com uma esfoliação à base de iodo e álcool a 70%.
  5. Cateterismo
    1. Fazer uma incisão abdominal mediana de 7 cm e incisões bilaterais medindo 3 cm do processo xifoide até a clavícula média. Retire a pelagem da região torácica.
    2. Usando cotonetes, mobilize os órgãos abdominais para o lado esquerdo do abdômen. Isolar a aorta abdominal da fáscia retroperitoneal e dos tecidos adiposos.
    3. Injetar 1.000 UI de heparina dissolvida em 0,3 mL de solução salina isotônica através da veia cava inferior (VCI) usando uma seringa de 1 mL. Pare qualquer sangramento do orifício da agulha comprimindo suavemente com um cotonete.
      NOTA: Tenha cuidado com embolia gasosa durante a injeção, pois pode levar à parada cardíaca.
    4. Inserir um cateter femoral de 5 Fr. na aorta abdominal (Abd. A). Certifique-se de que a ponta do cateter atinja o arco aórtico. Confirme a localização do cateter avaliando o comprimento aproximado da parte inserida do cateter.
  6. Coleta de sangue
    1. Coletar cerca de 10 mL de sangue através do cateter inserido no ABD.
    2. Posteriormente, diluir o sangue de priming com solução salina isotônica até que o volume total atinja 12 mL. Adicionar 5 mg de cefazolina dissolvida em 0,3 ml de solução salina e insulina (20 UI).
  7. Parada cardíaca
    1. Conecte a linha de perfusão do CPS previamente preparada ao cateter abdominal e inicie a administração do CPS com a bomba de seringa a uma taxa de 800 mL/h.
    2. Abra a cavidade torácica a partir do diafragma e corte a VCI próximo ao diafragma para evitar distensão ventricular. Cortar as costelas bilateralmente ao longo da coluna torácica até a entrada torácica. Refletir a parede torácica ventral mobilizada superiormente com pinça de mosquito.
    3. Remova totalmente o timo utilizando micropinças para visualização do arco aórtico. Aplique leve compressão se as artérias tímicas sangrarem.
  8. Extração
    1. Após a administração de todo o CPS, isole o arco aórtico dos tecidos circundantes. Dissecar cuidadosamente logo abaixo da artéria subclávia esquerda.
    2. Transeccionar as artérias braquiocefálica e carótida comum esquerda em posição distante, deixando os cotos mais longos do arco aórtico de fácil manuseio durante a canulação da aorta. Transeccionar o tronco da artéria pulmonar (AMP) o mais próximo possível da bifurcação. Tenha cuidado para não danificar o apêndice atrial esquerdo.
    3. Ligadura cuidadosa da veia cava superior (VCS) e VCI com pontos de seda 5-0, evitando a obstrução do átrio direito (AD) e seio coronariano. Cobrir as margens esquerdas do tórax com gaze molhada, colocar o coração sobre ele e retrair suavemente as ligaduras da VCS e da VCI para expor o hilo.
    4. Ligate as veias pulmonar e ázigos juntamente com uma sutura de seda 5-0. Separe o tecido dorsal à ligadura e extraia o coração. Examine o coração em busca de qualquer lesão. Finalmente, pesar o coração antes da canulação aórtica.

3. Perfusão ex situ

  1. Canulação e perfusão da aorta
    1. Antes da canulação da aorta, substitua o circuito preparado com soro fisiológico pelo priming sanguíneo.
    2. Insira a cânula aórtica no arco aórtico e fixe-a com uma micropinça temporária. Certifique-se de que a ponta da cânula esteja posicionada na junção braquiocefálica.
    3. Confirme a posição correta da cânula segurando suavemente a aorta com micropinças.
    4. Iniciar a perfusão a uma taxa de fluxo de 2-3 mL/min, permitindo que o perfusato vaze do local da canulação para remover quaisquer bolhas de ar.
    5. Monitore a pressão e a temperatura de perfusão através do sensor conectado ao sistema de monitoração.
    6. Massageie suavemente o coração com o primeiro e o indicador até que o sangue venoso vaze da artéria pulmonar principal (MPA).
    7. Fixar a aorta com uma ligadura de seda 1-0 e remover a pinça após verificar todas as configurações (circuito de perfusão, pressão de perfusão, temperatura).
    8. Uma vez que a ligadura permanente é colocada, certifique-se de que o coração começa a se contrair dentro de alguns segundos e atinge o ritmo normal em 60 s. Uma pressão de perfusão média de 55-65 mmHg com fluxo coronariano de 3-4 mL a 37 °C indica perfusão adequada.
    9. Coletar 0,15 mL de sangue do reservatório e verificar a gasometria arterial (AGG) no início da perfusão e a cada 20 min após. Monitorar e registrar o pH, pCO 2, pO2, glicose, hematócrito, potássio e lactato durante a perfusão. Após 120 minutos de perfusão, administrar 3 mL de Custodiol através da bomba de seringa a uma taxa de 250 mL/h para parar o coração.

4. Implantação

  1. Preparação do receptor
    1. Iniciar a preparação do receptor 30 minutos antes da cessação da perfusão ex situ .
    2. Anestesiar o animal receptor utilizando o mesmo método mencionado no passo 2.2.
    3. Colocar o rato em decúbito dorsal na almofada de aquecimento e introduzir a sonda de temperatura no reto para manter a temperatura corporal a 37 °C.
    4. Aplique lubrificante ocular, raspe o púbico na área epigástrica e limpe a área com uma esfoliação à base de iodo e álcool 70%.
  2. Medicamentos
    1. Injetar 2 mL de soro fisiológico morno por via subcutânea para compensar o líquido perdido durante a cirurgia. Injetar 200 UI de heparina por via subcutânea.
    2. Administrar profilaxia antibiótica injetando 10 mg/kg de cefazolina dissolvida em 0,3 mL de solução salina por via subcutânea ou intramuscular.
    3. Administrar o controle da dor injetando 20 mg/kg de diclofenaco por via subcutânea.
  3. Realizar a laparotomia mediana e inserir um afastador para alargar a cavidade abdominal. Mobilize os órgãos abdominais para o lado esquerdo do receptor usando cotonetes para abrir espaço para o procedimento.
  4. Evite a desidratação envolvendo os órgãos abdominais com gaze quente e molhada. Espalhar intermitentemente soro fisiológico quente com uma seringa de 50 mL durante a cirurgia.
  5. Utilizando microscópio cirúrgico com aumento de 10x, mobilizar o duodeno e jejuno proximal por dissecção romba com cotonetes para expor o Abd. Prepare o Abd. A e VCI para anastomose e implante sistemático do coração doador, conforme Figura 3 ou métodos previamente documentados15.
    NOTA: Não separe o Abd.
    1. Supondo que a anastomose vascular seja colocada na região infrarrenal, preparar uma porção suficiente da aorta e da VCI para o pinçamento.
    2. Realizar o preparo rombo usando cotonetes ou pinças serrilhadas afiadas para remover as gorduras e fáscias ao redor dos vasos.
    3. Coloque ligaduras de seda 5-0 nos ramos mesentéricos e nas faces cranial e caudal dos grandes vasos. Elevar os vasos abdominais e coagular ou ligar os ramos lombares com pontos de seda 5-0. Lembre-se de poupar as artérias e veias testiculares e não apertá-las.
    4. Utilizar ligaduras para levantar os vasos e posicionar as micropinças nos ramos mesentéricos, laterais caudal e cranial dos grandes vasos para interromper o fluxo sanguíneo no local da anastomose. Desligue a almofada de aquecimento antes de colocar as pinças, pois o aquecimento em excesso pode exacerbar a isquemia dos membros. Certifique-se de ligar a almofada de aquecimento depois de desapertar os vasos para evitar hipotermia.
    5. Puncionar a aorta com agulha 27G e alongar a incisão com microtesoura até comprimento igual ou ligeiramente maior que a abertura da aorta ascendente doadora (Asc. A), que é de aproximadamente 5 mm.
    6. Fazer uma incisão longitudinal na VCI da mesma forma que a aortotomia, mas torná-la 3 mm mais próxima da face caudal em relação à incisão da aorta.
    7. Iniciando as anastomoses, colocamos o coração doador no lado direito do abdome do receptor e anexamos o Doador Asc. A ao Abd. do destinatário A com um ponto simples interrompido (polipropileno 9-0) no canto cranial da incisão longitudinal.
    8. Mover o coração para o lado esquerdo do abdome receptor e realizar anastomose do ASC do doador. A com o Abd. do destinatário A usando uma sutura de polipropileno 9-0 contínua.
    9. Fixar a artéria pulmonar doadora na VCI com duas suturas interrompidas (polipropileno 9-0) nos cantos caudal e cranial da incisão longitudinal.
    10. Realizar a primeira metade da anastomose venosa a partir do lado intraluminal do vaso e completar a segunda metade do lado extraluminal do vaso. Antes de apertar os nós, lave o campo com soro fisiológico para evitar embolia gasosa.
  6. Desarejamento e desaperto
    1. Remova a pinça da veia mesentérica primeiro após completar a anastomose para permitir que o lado direito do coração se encha de sangue venoso.
    2. Remova o ar no circuito coronário e Asc. - A. aplicando perfusão coronariana retrógrada por vários segundos.
    3. Coloque um pedaço de gaze em ambos os lados dos vasos e retire a pinça caudal e a pinça craniana.
    4. Aplique uma compressão suave com cotonetes por 1-2 min. Após garantir a hemostasia adequada, remova os swabs e lave as anastomoses com soro fisiológico morno.
      NOTA: O coração deve começar a bater no primeiro minuto de reperfusão. Se a temperatura corporal do rato receptor estiver abaixo de 35 °C, o ritmo cardíaco se normalizará após a temperatura atingir 36 °C.
  7. Substitua os órgãos abdominais de forma sinuosa e feche as camadas da incisão abdominal com suturas contínuas de polipropileno 5-0.
  8. Após a cirurgia, colocar o animal anestesiado em uma área limpa sobre uma almofada de aquecimento até que a temperatura corporal atinja 37°C.
    NOTA: Não inicie os exames pós-operatórios até que a temperatura corporal atinja 37°C. Manter a anestesia com isoflurano a 2-2,5% até o final dos experimentos.
  9. Monitorar o ECG do coração do doador transplantado por 3 h. Em seguida, excisar o coração sob anestesia profunda para estudos histológicos.
    NOTA: Confirme a profundidade da anestesia através da falta de reflexo pedal antes de excisar o coração. O procedimento cirúrgico e a monitorização do ECG levam menos de 6 h. O diclofenaco, administrado no perioperatório (passo 4.2.3.), permite o tratamento da dor durante todo o procedimento. O regime de analgesia pode ser ajustado de acordo com as diretrizes institucionais de uso de animais.

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Representative Results

A Figura 1 ilustra o desenho experimental utilizado em modelo animal de pequeno porte. A Figura 2 mostra o aparelho de perfusão Langendorff modificado, que inclui um oxigenador animal de pequeno porte. A ordem das anastomoses para implante abdominal heterotópico é apresentada na Figura 3.

A Figura 4 mostra os parâmetros utilizados para avaliar a viabilidade do coração durante a perfusão ex situ , como lactato, potássio e pressão média da aorta. Neste estudo, o uso da preservação ex situ normotérmica diminuiu o tempo total de isquemia de seis casos de sucesso para 46,2 ± 4,7 min, enquanto o tempo total fora do corpo foi de 166,2 ± 4,7 min (Figura 5). A extração do coração do doador e o preparo para perfusão ex situ e transplante heterotópico necessitaram de 5,8 ± 1,3 min, como mostra a Figura 5. A taxa global de sucesso cirúrgico foi de 70% e o tempo médio de anastomose dos seis casos de sucesso foi de 38,4 ± 3,4 min. Em todos os experimentos, a frequência cardíaca diminuiu significativamente imediatamente após o implante, mas acabou se recuperando com o tempo, como ilustrado na Figura 6. A estrutura macroscópica dos corações doados estava bem preservada após preservação ex situ e implante heterotópico, sem danos visíveis detectados. Entretanto, a coloração hematoxilina-eosina revelou aumento do número de células inflamatórias, principalmente neutrófilos, após 3 h de implantação heterotópica (Figura 7).

Figure 1
Figura 1: Desenho experimental da preservação cardíaca ex situ normotérmica com transplante cardíaco heterotópico. Abreviações: BGA = gasometria, CPS = solução cardioplégica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Esquemas de preservação do coração ex situ de pequenos animais modificados. Abreviações: sensor de PA = sensor de pressão arterial, CPS = solução cardioplégica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Ordem das anastomoses no transplante cardíaco heterotópico . (A) Esquema da posição do coração doador no abdome receptor e ordem das anastomoses. (B) Anastomose da aorta ascendente do doador e da aorta abdominal do receptor. (C) Anastomose da artéria pulmonar doadora e da VCI receptora. Abreviações: VE = ventrículo esquerdo, VD = ventrículo direito, AE = átrio esquerdo, APM = artéria pulmonar principal, VCI = veia cava inferior. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: Parâmetros para avaliação da viabilidade durante a perfusão ex situ. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figure 5
Figura 5: Linha do tempo de preservação dos seis corações preservados com sucesso. Extração cardíaca e facilitação da perfusão ex situ: 5,8 ± 1,3 min. Perfusão ex situ : 120 min. Implantação no abdome do rato receptor: 38,4 ± 3,4 min. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Desempenho eletrofisiológico do coração doador antes da captação e após o implante . (A) Alterações na frequência cardíaca. Pré-colheita, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 150 min, 180 min: os tempos após a implantação. (B) Imagens eletrocardiográficas antes da coleta do coração do doador e após 3 h do implante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: Aspecto macroscópico (A-C) e microscópico (D-F) do coração doador. (A,D) Antes da preservação ex situ normotérmica. (B,E) Após preservação ex situ normotérmica. (C,F) Após 2 h de implantação heterotópica. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Nosso foco no estabelecimento desse modelo foi replicar o transplante cardíaco humano normotérmico. Os modelos não ejetantes são a técnica comumente preferida para preservar o coração doador em ambiente ex situ16. Embora os modelos de ejeção ofereçam muitas vantagens na avaliação da função cardíaca durante a perfusão ex situ 17, eles não são adequados para modelos de transplante heterotópico. No transplante heterotópico, o coração do doador implantado precisa superar a pressão de pós-carga sistólica criada pelo coração do hospedeiro no sistema circulatório do receptor, levando a um desempenho limitado do coração do doador e subestimado na avaliação18. Portanto, modelos não ejetantes são mais favoráveis no transplante heterotópico. Em modelos não ejetantes, o coração do doador é perfundido, mas não suporta a circulação do receptor, limitando significativamente a avaliação do desempenho do coração. Avaliações morfológicas e moleculares, como coloração histológica e análise de blotting, podem ser benéficas para examinar as condições cardíacas do doador quando as avaliações funcionais são limitadas. Além disso, os marcadores metabólicos podem ser avaliados por meio de tecnologias avançadas, como tomografia por emissão de pósitrons (PET) ou ressonância magnética (RM)19. Este modelo pode ser útil para testar a eficácia a longo prazo de intervenções farmacológicas e genéticas antes da implantação.

Numerosos grupos de pesquisa desenvolveram um modelo de preservação ex situ normotérmico, que tem sido empregado com sucesso para preservar corações suínos por até 12 h6. No entanto, a manutenção de modelos animais de grande porte pode ser de custo proibitivo para laboratórios pequenos, pois envolve gastos substanciais e requer um número considerável de pessoal treinado. Para abordar essa questão, propomos um método de preservação ex situ menos dispendioso e tecnicamente simples, que envolve o uso de sangue autólogo seguido de transplante cardíaco heterotópico. Notavelmente, o custo de um único experimento usando nosso modelo é de aproximadamente US $ 300. Embora não exista um modelo equivalente de pequenos animais para comparar os custos, o aparelho de perfusão ex situ para animais de grande porte, quando usado uma única vez, pode custar até US$ 30.00016.

O protocolo apresentado demonstra que todos os procedimentos experimentais podem ser realizados de forma escalonada por um único experimentador (Figura 3). A possibilidade de implantação heterotópica após preservação ex situ é outra vantagem desse modelo. Ao canular a aorta descendente do coração doador para perfusão ex situ , conseguimos poupar a parte ascendente sem causar qualquer dano. Além disso, modificamos o circuito de Langendorff, reduzindo a quantidade de solução de perfusão necessária para 12 mL para uma perfusão cardíaca efetiva. O sangue de perfusão foi obtido do rato doador antes da coleta, permitindo preservar o coração com seu próprio sangue e evitar qualquer reação imunológica durante a preservação.

Modificações e solução de problemas
O circuito de perfusão ex situ é recomendado para manter uma pressão média de pós-carga dentro da faixa de 50-70 mmHg. A pressão é determinada por vários fatores, incluindo fluxo de perfusão, resistência da artéria coronária e viscosidade do perfusato20. A resistência arterial coronariana é suscetível a flutuações devido às variações de temperatura e pH, sendo fundamental manter esses parâmetros dentro da faixa de normalidade. O fluxo de perfusão necessário varia para cada experimento e é dependente do fluxo necessário para manter a pressão de perfusão desejada. Normalmente, um fluxo de 3-4 mL/min (equivalente a 5-6 rpm para nossa bomba) é suficiente para um coração de rato de 350-450 g. O hematócrito é determinante da viscosidade do perfusato21. Para o nosso circuito, a faixa ideal de hematócrito é de 25% a 30%. Apesar do uso do menor oxigenador experimental, a grande área superficial de troca gasosa de 0,05 m2 para um volume de perfusato de12 mL pode levar à evaporação e consequente perda de fluidos ao longo do tempo. Esta perda de líquido pode ser corrigida pela adição de água destilada, conforme necessário. Não é recomendado adicionar soro fisiológico ou solução de ringer ao perfusato, pois eles podem causar hipernatremia. A concentração de glicose do perfusato deve ser mantida em 100-150 mg/dL.

É fundamental evitar arritmia durante a perfusão, pois significa a deterioração de um ou mais parâmetros fisiológicos do ambiente ex situ 10. Taquiarritmia ou fibrilação ventricular esquerda são comumente associadas a vários fatores, como desequilíbrio eletrolítico, hematócrito baixo, acidose/alcalose, hipertermia e pós-carga excessiva. Por outro lado, a bradiarritmia é causada principalmente pela hipotermia. Lactato e potássio são os parâmetros-chave na avaliação da viabilidade miocárdica. Níveis elevados de lactato (>5 mmol/L) e hiperpotassemia (>5,0 mg/dL) indicam um grau substancial de dano miocárdico22.

O monitoramento cuidadoso da dose de anestesia e do padrão respiratório do rato receptor é crucial durante os procedimentos cirúrgicos. Como os animais não são ventilados, a administração contínua de anestesia excessiva pode levar à hipoventilação e à falência. A laparotomia total e a extração de órgãos abdominais resultam em perda de calor significativa, o que pode deteriorar ainda mais a condição do receptor. Portanto, o uso de um controlador de temperatura equipado com uma almofada de aquecimento e sonda de temperatura é crucial para mitigar o impacto da perda de calor e manter uma temperatura corporal estável.

Etapas críticas
As etapas críticas do procedimento cirúrgico envolvem a dissecção do arco aórtico e do APM, canulação aórtica para perfusão ex situ, desarejamento antes da perfusão ex situ e desarejamento antes da retirada das pinças após o implante. Essas etapas são altamente vulneráveis e geralmente estão associadas a falhas. No entanto, a chave para superar esses desafios está em identificar a técnica apropriada e obter prática suficiente. Durante o isolamento do vaso no receptor, atenção especial deve ser dada ao ureter direito, que está situado próximo à VCI no espaço retroperitoneal e pode mimetizar o ducto linfático. No contexto da anastomose venosa, recomenda-se primeiro fixar a extremidade caudal usando suturas de permanência seguidas pela extremidade cranial para evitar ruptura e estenose. Isso é particularmente importante devido à natureza relativamente frágil das veias em comparação com a aorta.

Limitações
Os procedimentos cirúrgicos envolvidos neste experimento são consideravelmente complexos, principalmente quando se obtém o coração do doador e perfusa o sangue do mesmo animal. As avaliações funcionais pós-implante são limitadas, pois utilizamos um modelo não ejetador. Um modelo de ejeção é considerado para fornecer resultados mais avançados em um ambiente ex situ . No entanto, no transplante heterotópico, ela é restringida devido à presença de um coração hospedeiro de suporte no sistema circulatório.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa B2021-0991 do Chonnam National University Hospital Biomedical Research Institute e NRF-2020R1F1A1073921 da Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia

Materials

Name Company Catalog Number Comments
AES active evacuation system Smiths medical PC-6769-51A Utilize CO2 and excess isoflurane
Anesthesia machine Smiths medical PC-8801-01A Mixes isoflurane and oxyegn and delivers to animal
B20 patient monitor GE medical systems B20 to observe mean aortic pressure and temperature
Homeothermic Monitoring System Harvard apparatus 55-7020 To monitor and maintain animal's temperature
Micro-1 Rat oxygenator Dongguan Kewei medical instruments Micro-MO For gas exchange in the langendorff circuit
Micropuncture introducer Set COOK medical G48007 for delivering cardioplegic solution to the arch through the abdominal aorta
Microscope Amscope MU1403 For zooming surgical field (Recipient)
Surgical loupe SurgiTel L2S09 For zooming surgical field (Donor)
Syringe pump AMP all SP-8800 To deliver cardioplegic solution
Transonic flow sensor Transonic ME3PXL-M5 Perfusion circuit flow sensor
Transonic tubing flow module Transonic TS410 flow acquiring system
Watson - Marlow pumps Harvard apparatus 010.6131.DAO Peristaltic pump used for recirculate perfusate
WBC-1510A JEIO TECH E03056D Heating bath
Sprague-Dawley rats Samtako Bio Korea Co., Ltd., Osan City Korea
Medications
BioHAnce Gel Eye Drops SENTRIX Animal care wet ointments for eye
Cefazolin JW pharmaceutical For prophilaxis
Custodiol DR, FRANZ KOHLER CHEMIE GMBH For heart harvesting
Diclofenac Myungmoon Pharm. Co. Ltd For pain control
Heparin JW pharmaceutical Anticoagulant
Insulin JW pharmaceutical hormon therapy
Saline JW pharmaceutical For hydration therapy

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Medicina Edição 194

Erratum

Formal Correction: Erratum: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation
Posted by JoVE Editors on 08/28/2023. Citeable Link.

An erratum was issued for: Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. The Protocol section was updated.

Section 4 of the Protocol was updated from:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Be sure to switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.

to:

4. Implantation

  1. Preparation of recipient
    1. Begin the recipient preparation 30 min before the cessation of ex situ perfusion.
    2. Anesthetize the recipient animal using the same method as mentioned in step 2.2.
    3. Place the rat in a supine position on the heating pad and insert the temperature probe into the rectum to maintain the body temperature at 37 °C.
    4. Apply eye lubricant, shave the pubic to the epigastric area, and cleanse the area with an iodine-based scrub and 70% alcohol.
  2. Medications
    1. Inject 2 mL of warm saline subcutaneously to compensate for the fluid lost during the surgery. Inject 200 IU of heparin subcutaneously.
    2. Administer antibiotic prophylaxis by injecting 10 mg/kg cefazolin dissolved in 0.3 mL of saline subcutaneously or intramuscularly.
    3. Administer pain control by injecting 20 mg/kg of diclofenac subcutaneously.
  3. Perform the mid-line laparotomy and insert a retractor to widen the abdominal cavity. Mobilize the abdominal organs to the left side of the recipient using cotton swabs to make space for the procedure.
  4. Prevent dehydration by wrapping the abdominal organs with warm and wet gauze. Intermittingly spread warm saline with a 50 mL syringe during the surgery.
  5. Utilizing a surgical microscope with a 10x magnification, mobilize the duodenum and proximal jejunum by blunt dissection with cotton swabs to expose the Abd. A. and IVC. Prepare the Abd. A and IVC for anastomosis and systematically implant the donor heart, in accordance with Figure 3 or previously documented methods15.
    NOTE: Do not separate the Abd. A. and IVC.
    1. Assuming vascular anastomosis to be placed infrarenal, prepare a sufficient portion of the aorta and IVC for clamping.
    2. Perform blunt preparation using cotton swabs or sharp-serrated forceps to remove the fats and fascia around the vessels.
    3. Place 5-0 silk ligatures to the mesenteric branches and both the cranial and caudal sides of the major vessels. Elevate the abdominal vessels and coagulate or ligate the lumbar branches with 5-0 silk sutures. Remember to spare the testicular arteries and veins and do not clamp them.
    4. Use ligatures to lift the vessels and position the micro-clamps to the mesenteric branches, caudal, and cranial sides of the major vessels to stop the blood flow at the anastomosis site. Switch off the heating pad before placing the clamps, as excess heating can exacerbate limb ischemia. Ensure to switch on the heating pad after de-clamping the vessels to avoid hypothermia.
    5. Puncture the aorta using a 27 G needle and elongate the incision with micro scissors to a length equal to or slightly larger than the opening of the donor ascending aorta (Asc. A), which is approximately 5 mm.
    6. Make a longitudinal incision on the IVC in the same way as the aortotomy, but make it 3 mm closer to the caudal side compared to the aorta incision.
    7. Starting the anastomoses, placed the donor heart on the right side of the recipient's abdomen and attach the donor Asc. A to the recipient's Abd. A with one simple interrupted stitch (9-0 polypropylene) at the cranial corner of the longitudinal incision.
    8. Move the heart to the left side of the recipient abdomen and perform anastomosis of the donor's Asc. A with the recipient's Abd. A using a running 9-0 polypropylene suture.
    9. Fixate the donor pulmonary artery to the IVC with two interrupted sutures (9-0 polypropylene) at the caudal and cranial corners of the longitudinal incision.
    10. Perform the first half of the venous anastomosis from the intraluminal side of the vessel and complete the second half from the extraluminal side of the vessel. Before tightening the knots, flush the field with saline to prevent air embolism.
  6. De-airing and de-clamping
    1. Remove the mesenteric vein clamp first after completing the anastomosis to allow the right side of the heart to fill with venous blood.
    2. Remove the air in the coronary circuit and Asc. A. by applying retrograde coronary perfusion for several seconds.
    3. Place a piece of gauze on both sides of the vessels and remove the caudal clamp and the cranial clamp.
    4. Apply gentle compression with cotton swabs for 1-2 min. After ensuring adequate hemostasis, remove the swabs and wash the anastomoses with warm saline.
      NOTE: The heart should begin beating within the first minute of reperfusion. If the recipient rat's body temperature is below 35 °C, the heart rhythm will normalize after the temperature reaches 36 °C.
  7. Replace the abdominal organs in a meander-like manner and close the layers of the abdominal incision using continuous 5-0 polypropylene sutures.
  8. After the surgery, place the anesthetized animal on a clean area over a heating pad until the body temperature reaches 37°C. 
    NOTE: Do not initiate the postoperative examinations till the body temperature reaches 37°C. Maintain anesthesia at 2-2.5% isoflurane until the end of the experiments.
  9. Monitor ECG of the transplanted donor heart for 3 h. Then, excise the heart under deep anesthesia for histological studies.
    NOTE: Confirm anesthesia depth via lack of pedal reflex before excising the heart. The surgical procedure and the ECG monitoring take less than 6 h. Diclofenac, administered perioperatively (step 4.2.3.), enables pain management for the entire duration of this procedure. The analgesia regimen can be adjusted per the institutional animal use guidelines.
Modelo de Transplante Cardíaco Heterotópico Perfundido Normothermic Ex-Situ em Rato
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Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D.,… More

Kayumov, M., Jeong, I. S., Kim, D., Kwak, Y., Obiweluozor, F. O., Yoon, N., Kim, H. S., Cho, H. J. Rat Model of Normothermic Ex-Situ Perfused Heterotopic Heart Transplantation. J. Vis. Exp. (194), e64954, doi:10.3791/64954 (2023).

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