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Methodenartikel

Eisenchlorid-induzierte arterielle Thrombose und Probenentnahme für die 3D-Elektronenmikroskopie-Analyse

3K Ansichten

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DOI:

10.3791/64985

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17. März 2023

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1Department of Molecular and Cellular Biochemistry, University of Kentucky, 2Department of Physiology and Cell Biology, University of Arkansas for Medical Sciences, 3Laboratory of Cellular Imaging and Macromolecular Biophysics, National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering, National Institutes of Health

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine FeCl3-vermittelte Verletzung verwendet werden kann, um eine arterielle Thrombose zu induzieren, und wie arterielle Verletzungsproben in verschiedenen Stadien der Thrombose für die elektronenmikroskopische Analyse gesammelt und vorbereitet werden.

Zusammenfassung

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität. Aberrante Thrombosen sind ein häufiges Merkmal von systemischen Erkrankungen wie Diabetes und Fettleibigkeit sowie chronisch entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose, Krebs und Autoimmunerkrankungen. Bei einer Gefäßverletzung wirken in der Regel das Gerinnungssystem, die Blutplättchen und das Endothel orchestriert, um Blutungen zu verhindern, indem sie an der Stelle der Verletzung ein Gerinnsel bilden. Anomalien in diesem Prozess führen entweder zu übermäßigen Blutungen oder zu unkontrollierten Thrombosen/unzureichender antithrombotischer Aktivität, was sich in einem Gefäßverschluss und seinen Folgen niederschlägt. Das FeCl 3-induzierte Carotis-Verletzungsmodell ist ein wertvolles Werkzeug, um zu untersuchen, wie eine Thrombose in vivo beginnt und fortschreitet. Dieses Modell beinhaltet eine Endothelschädigung/Denudation und die anschließende Gerinnselbildung an der verletzten Stelle. Es bietet einen hochempfindlichen, quantitativen Assay zur Überwachung von Gefäßschäden und Gerinnselbildung als Reaktion auf unterschiedlich schwere Gefäßschäden. Nach der Optimierung kann diese Standardtechnik verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Thrombose zugrunde liegen, sowie die ultrastrukturellen Veränderungen der Blutplättchen in einem wachsenden Thrombus. Dieser Assay ist auch nützlich, um die Wirksamkeit von Antithrombotika und Thrombozytenaggregationshemmern zu untersuchen. In diesem Artikel wird erläutert, wie eine FeCl 3-induzierte arterielle Thrombose initiiert und überwacht wird und wie Proben für die elektronenmikroskopische Analyse entnommen werden.

Einleitung

Thrombose ist die Bildung eines Blutgerinnsels, das ein Blutgefäß teilweise oder vollständig blockiert und den natürlichen Blutfluss behindert. Dies führt zu schweren und tödlichen kardiovaskulären Ereignissen wie ischämischen Herzerkrankungen und Schlaganfällen. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität und verursachen weltweit jeden vierten Todesfall 1,2,3. Obwohl sich eine Thrombose als Fehlfunktion des Gefäßsystems manifestiert, kann sie auf eine zugrunde liegende mikrobielle oder virale Infektion, eine Immunstörung, eine Malignität oder einen Stoffwechselzustand zurückzuführen sein. Der Blutfluss wird durch das komplexe Zusammenspiel zwischen verschiedenen Komponenten des Gefäßsystems aufrechterhalten, einschließlich Endothelzellen, roten/weißen Blutkörperchen, Blutplättchen und Gerinnungsfaktoren4. Bei einer Gefäßverletzung interagieren Blutplättchen mit adhäsiven Proteinen auf der subendothelialen Matrix und setzen ihren körnigen Inhalt frei, der mehr Blutplättchen rekrutiert5. Gleichzeitig wird die Gerinnungskaskade aktiviert, was zur Fibrinbildung und -ablagerung führt. Letztendlich wird ein Gerinnsel gebildet, das Blutplättchen und rote Blutkörperchen enthält, die in einem Fibrinnetzeingeschlossen sind 6. Obwohl Thrombozytenaggregationshemmer und Antikoagulanzien zur Modulation von Thrombosen zur Verfügung stehen, bleiben unechte Blutungen bei diesen Therapien ein großes Problem, das eine Feinabstimmung der Dosierungen und Kombinationen dieser Medikamente erfordert. Daher besteht nach wie vor ein dringender Bedarf, neue antithrombotische Medikamente zu entdecken7.

Thrombosen werden mit mehreren Methoden untersucht, um Gefäßverletzungen zuzufügen: mechanisch (Gefäßligatur), thermisch (Laserverletzung) und chemisch (FeCl3 / Rose Bengal-Anwendung). Die Art der Thrombose variiert je nach Lokalisation (arteriell vs. venös), Methode oder Ausmaß der Verletzung. Unter all diesen Typen ist die FeCl 3-induzierte Gefäßverletzung die am weitesten verbreitete Methode. Es wurde bei Mäusen, Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen und Hundeneingesetzt 8,9,10,11,12. Die Methode ist relativ einfach, leicht anzuwenden, und wenn die wichtigsten Parameter standardisiert sind, ist sie in verschiedenen Gefäßsystemen (z. B. Arterien [Halsschlagader und Femur], Venen [Jugular] und Arteriolen [Kremaster und Mesenterium]) empfindlich und reproduzierbar (Ergänzungstabelle 1).

Dieses Modell kann auch verwendet werden, um unser Verständnis der Mechanik und Morphologie der Gerinnselbildung zu erweitern. Diese Technik bietet auf einzigartige Weise den Vorteil, die Thrombose an verschiedenen Flussratenpunkten zu stoppen, um die Zwischenstadien des Prozesses zu untersuchen, bevor er okklusiv wird. Jüngste Fortschritte in der Thromboseforschung haben dieses Modell verwendet, um die Aufmerksamkeit auf nicht-pharmakologische Methoden der Thrombolyse13 oder die nicht-invasive Verabreichung von antithrombotischen und/oder fibrinolytischen Wirkstoffen14,15 zu lenken. Mehrere Gruppen haben gezeigt, dass, wenn Thrombozytenmembranen mit diesen Therapeutika beschichtet sind, die Medikamente bei thermischer Stimulation aktiviert werden können, um auf Gerinnsel16 abzuzielen. Die hier beschriebenen Techniken können für Studien wie die Validierung ihrer Ergebnisse auf der Ebene einzelner Blutplättchen nützlich sein. In diesem Manuskript beschreibt Protokoll 1 das grundlegende FeCl 3-vermittelte Gefäßverletzungsverfahren, während Protokoll 2 die Methode zum Sammeln und Fixieren der Gefäßverletzungsprobe für die weitere Analyse durch Elektronenmikroskopie beschreibt.

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Protokoll

Alle hier besprochenen Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Kentucky geprüft und genehmigt.

HINWEIS: Chirurgische Instrumente sind in Abbildung 1 und der Materialtabelle aufgeführt. Es wurden C57BL/6J-Mäuse, 8-10 Wochen alt, männlich/weiblich oder relevante genetisch manipulierte (Knockout oder Knockin) Stämme verwendet.

1. FeCl 3-induzierte Verletzung der Halsschlagader

  1. Induktion der Mausanästhesie
    1. Wiegen Sie die Maus.
    2. Anästhesieren Sie die Maus durch intraperitoneale Injektion von 0,2 g/kg Tribromethanollösung (i.p.). Stellen Sie sicher, dass die Anästhesielösung Raumtemperatur (RT) hat, bevor Sie sie injizieren. Diese Dosis reicht aus, um die Maus etwa 1 h lang zu beruhigen.
    3. Überprüfen Sie den Zehenreflex, indem Sie den Zeh 5 Minuten nach der Injektion einklemmen, um sicherzustellen, dass die Maus sediert ist. Wenn die Maus nicht sediert ist, zieht sie ihren Zeh weg. Warten Sie in diesem Fall 5 Minuten und überprüfen Sie es erneut.
    4. Wenn die Maus immer noch nicht vollständig sediert ist, verabreichen Sie 1/4 der Anfangsdosis und warten Sie 5 Minuten.
    5. Überwachen Sie während des gesamten Verfahrens regelmäßig die Anästhesieebene der Maus über eine Zehenklemme. Darüber hinaus könnten auch die Atemfrequenz und die Körpertemperatur überwacht werden, um eine optimale Anästhesie aufrechtzuerhalten.
  2. Immobilisieren Sie die Maus
    1. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf das Heizkissen (37 °C) und fixieren Sie die Extremitäten mit Klebeband.
    2. Verwenden Sie einen chirurgischen Faden (0,1 mm), um vorsichtig an den oberen Vorderzähnen der Maus zu ziehen, um den Hals-/Halsbereich zu verlängern. Dies ist wichtig für eine bessere Visualisierung des Operationsbereichs und die Stabilität der Dopplersonde. Die Fadengröße ist nicht wichtig, da sie nur dazu dient, die Vorderzähne des Tieres zu ziehen, um den Hals zu verlängern.
  3. Einschnitt
    1. Besprühen Sie den Operationsbereich mit 70% Ethanol oder wischen Sie ihn mit einem Alkoholtuch ab.
    2. Tragen Sie mit einem Wattestäbchen eine kleine Menge Haarentfernungscreme auf den Operationsbereich auf. Warten Sie 1-2 Minuten und entfernen Sie dann die Creme mit einem feuchten Papiertuch oder Taschentuch.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist wichtig für einen sauberen Operationsbereich.
    3. Machen Sie mit einer Schere und einer Pinzette (Abbildung 1B11,1B13) einen Mittellinienschnitt vom Unterkiefer bis zur suprasternalen Kerbe. Ziehen Sie die Haut zurück, um eine bessere Visualisierung des Bereichs zu erhalten (Abbildung 2A).
  4. Exposition der Halsschlagader
    1. Mit einer chirurgischen Pinzette und einer Mikropräparierungszange die überlagernde oberflächliche Faszie stumpf präparieren und entfernen, um die linke Halsschlagader freizulegen (Abbildung 1B12,1B13). Achten Sie darauf, in diesem Stadium keine Schere zu verwenden, um Verletzungen anderer Gefäße in diesem Bereich zu vermeiden.
    2. Entfernen Sie überschüssiges Gewebe, das die Halsschlagader umgibt. Vermeiden Sie eine übermäßige Dissektion des umgebenden Gewebes, da sich in diesem Bereich der Vagusnerv und die Arteria vertebralis befinden.
    3. Trennen Sie die Halsschlagader vom umgebenden Gewebe, indem Sie sie mit einer chirurgischen und nahtbindenden Pinzette präparieren (Abbildung 1B12,1B15,2C). Achten Sie darauf, die Arterie nicht zu verlängern oder zu ziehen, um mechanische Verletzungen der Arterie oder des umgebenden Gefäßsystems zu vermeiden.
    4. Legen Sie ein Stück Plastik unter die Arterie, um den Ort der Verletzung zu markieren (Abbildung 2D). Verwenden Sie eine farbige Transparenzfolie, um das Sehen im Operationsfeld zu erleichtern.
  5. Platzierung der Strömungssonde
    1. Legen Sie die transsonische Doppler-Flusssonde vor der Operation für ca. 10 min in Kochsalzlösung (0,9% NaCl in dH2O). Führen Sie das andere Ende der Sonde in eine Befestigung im Durchflussmesser ein, um das Ablesen des Durchflusses zu erleichtern. Schließen Sie den Durchflussmesser an einen Computer an.
      HINWEIS: Zwischen den Operationen sollte sich die transsonische Doppler-Durchflusssonde in Kochsalzlösung befinden. Achten Sie darauf, die Sonde während des gesamten Verfahrens feucht und sauber zu halten.
    2. Platzieren Sie die transsonische Ultraschall-Doppler-Flusssonde um die Arterie stromaufwärts des Kunststoffs (Abbildung 2D). Achten Sie darauf, dass der Gefäßhalterbereich der Sonde nicht zu stark gestreckt ist (Abbildung 1C, roter Pfeil).
      HINWEIS: Stützen Sie die Sonde bei Bedarf mit Mullbinden ab (Abbildung 1B1), um eine angemessene Höhe der Sonde zu erreichen und die optimale Leseposition zu erleichtern.
    3. Wenn der Operationsbereich zu diesem Zeitpunkt trocken ist, fügen Sie ein paar Tropfen RT-Kochsalzlösung hinzu, um den Bereich feucht zu halten. Überwachen Sie den Messwert der Durchflusssonde. Der optimale Messwert variiert für jedes Tier und kann zwischen 0,6 und 1,2 ml / min liegen. Wenn es weniger oder nicht stabil ist, ändern Sie die Position der Durchflusssonde, um einen optimalen Messwert zu erhalten.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass der Hals der Maus nicht zu stark gestreckt ist und dass der Operationsbereich sauber ist.
  6. Aufzeichnen der Flow-Baseline
    1. Überwachen Sie nach dem Einsetzen der Sonde den Blutfluss 2 Minuten lang, um sicherzustellen, dass der Fluss gleichmäßig ist. Zeichnen Sie dann den Durchfluss für 2 Minuten auf (Abbildung 3B) als Basislinie. Eine detaillierte Beschreibung des Durchflussmessers finden Sie in Subramaniam et al.17.
    2. Um den Blutfluss aufzuzeichnen, starten Sie die WinDAQ-Software. Klicken Sie auf die Option Datei und dann auf Aufzeichnen. Erstellen Sie einen neuen Ordner und eine neue Datei und starten Sie die Aufnahme. Um die Aufnahme zu beenden, klicken Sie im Dateibereich auf Stopp .
      HINWEIS: Die WinDAQ-Software ist kostenlos erhältlich über den Herausgeber: https://www.dataq.com/products/windaq/.
  7. Verletzung
    1. Stoppen Sie die Aufzeichnung des Flusses. Stellen Sie sicher, dass Sie die Sondenposition nicht ändern, damit die Messwerte nach der Verletzung konstant bleiben.
    2. Trocknen Sie den Bereich gründlich mit einem Wisch-/Papiertuch ab.
      HINWEIS: Selbst ein kleines Volumen Restflüssigkeit kann die Konzentration der FeCl3-Lösung verändern, die zur Verursachung von Gefäßverletzungen verwendet wird. Dies führt zu variablen Ergebnissen und beeinträchtigt die Reproduzierbarkeit. Wenn der Bereich vollständig trocken ist, kann die Sonde den Durchfluss nicht messen.
    3. Legen Sie in ein Kunststoff-Wiegeboot ein kreisförmiges Filterpapier (1 mm Durchmesser, geschnitten mit einem Ohrstanzer mit 1 mm Durchmesser). 1 μl 6%ige FeCl3 -Lösung (hergestellt indH 2O) auf das Filterpapier geben.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie FeCl3-Lösung hinzufügen, bevor Sie das Filterpapier verwenden. Ein zu frühes Einweichen des Papiers kann zur Verdunstung der FeCl3-Lösung führen und die Schwere der Verletzung verändern.
    4. Nehmen Sie mit einer feinen Pinzette das Filterpapier auf und legen Sie es auf die Arterie vor der Sonde, auf den Teil der Arterie, der durch den Kunststoff markiert ist (Abbildung 2D, E). Dieser Kunststoff fungiert als Markierung und Abstandshalter. Es markiert den verletzten Bereich und verhindert eine versehentliche Verdünnung des FeCl3 , indem es den Kontakt mit dem umgebenden feuchten Bereich vermeidet.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Filterpapier gerade ist, nicht eingeklemmt oder anderweitig gefaltet ist. Ändern Sie nach dem Auflegen auf die Arterie nicht die Position des Filterpapiers. Dadurch ändert sich das Ausmaß der Verletzung.
    5. Starten Sie nach dem Einlegen des Filterpapiers den Timer und zeichnen Sie den Blutfluss auf. Entfernen Sie nach 3 Minuten das Papier und fügen Sie Kochsalzlösung an der Verletzungsstelle hinzu, um das FeCl3 zu entfernen und den Verletzungsprozess zu stoppen. Es macht auch den Bereich feucht. In diesem Stadium sollte der Blutfluss auf das Ausgangsniveau zurückkehren, wie es vor der Verletzung aufgezeichnet wurde.
    6. Überwachen und zeichnen Sie den Durchfluss auf, bis er auf 10 % der ursprünglichen Aufnahme reduziert wird oder Null erreicht. Es kommt zu einer stetigen Abnahme, sobald sich der Thrombus an der Verletzungsstelle zu bilden beginnt (Abbildung 3C). Beachten Sie während dieser Zeit signifikante Schwankungen des Durchflusses.
    7. Um die Stabilität des Thrombus zu untersuchen, notieren Sie den schnellen Anstieg des Blutflusses nach jeder signifikanten und konsistenten Abnahme. Diese Ereignisse werden als Embolisation aufgrund einer instabilen Thrombose klassifiziert (Abbildung 4D). Nach der gleichmäßigen Abnahme des Flusses kann der Bediener die Verletzung an der Arterie am Ende des Experiments sehen (Abbildung 2F, blauer Pfeil/gepunktetes Oval).
    8. Die Gefäßverschlusszeit ist definiert als die vollständige Unterbrechung des Blutflusses für mindestens 1 Minute. Notieren Sie den Zeitpunkt, zu dem sich ein okklusiver Thrombus bildet, wie der Nullwert oder die signifikante Abnahme des Flusses zeigen.
    9. Beenden Sie das Experiment nach 30 Minuten. Wenn sich der Thrombus nicht innerhalb von 30 Minuten nach der Überwachung bildet, zeichnen Sie den Fluss auf, stoppen Sie die Aufzeichnung und entfernen Sie die Sonde.
    10. Reinigen Sie die Sonde mit 70% Ethanol und einer Bürste, um restliches Gewebe/Haare oder Ablagerungen zu entfernen. Trocknen Sie die Sonde vollständig ab, bevor Sie sie in die Aufbewahrungsbox legen. Trocknen Sie die Sonde vollständig ab, bevor Sie sie zur Langzeitlagerung in die Aufbewahrungsbox legen.
    11. Euthanasieren Sie die Maus durch Zervixluxation. Legen Sie den Kadaver in den Schlachtkörperentsorgungsbeutel, der mit dem Namen des Labors und dem Datum beschriftet ist.

2. Entnahme und Aufbereitung von Proben für serielle Blockflächen-Rasterelektronenmikroskopie-Studien (SBF-REM) nach FeCl 3-induzierter Schädigung

HINWEIS: Das vorgestellte EM-Protokoll ist für die Probenvorbereitung für SBF-REM geeignet. Diese bildgebende Technik bietet eine beispiellose Möglichkeit, die dreidimensionale Struktur von Blutplättchen in einem Gerinnsel zu untersuchen. Mit dieser Technik wird die Probe als eine Reihe von sequentiellen Block-REM-Bildern visualisiert, die im Laufe der Probe erzeugt werden. Die wichtigsten Punkte für diese Vorbereitung sind: 1) Die Probe muss vor dem Einbetten mit Schwermetallen gefärbt werden; und 2) die in Kunststoff eingebettete Probe muss für die Montage im REM geeignet zugeschnitten werden (siehe Abbildung 6 für eine Darstellung der beschnittenen Proben). Eine Färbung nach der Einbettung ist innerhalb des REMS nicht möglich. Bei der Entnahme einer Probe aus einer FeCl 3-induzierten Gefäßverletzung für die EM-Analyse müssen während der Operation die folgenden Änderungen vorgenommen werden. Die Modifikationen im vorgestellten FeCl 3-Operationsprotokoll sind auch auf jede Form der Elektronenmikroskopie anwendbar. Die Anästhesiebedingungen und die Schritte zum Einschneiden und Freilegen der Halsschlagader sind die gleichen wie in Protokoll 1.

  1. Markieren Sie nach dem Freilegen der Halsschlagader die Verletzungsstelle, indem Sie den Bereich zwischen zwei chirurgischen Fäden (Größe: 0,1 mm) locker umschließen (Abbildung 5A, B).
  2. Platzieren Sie die Sonde unter der Arterie, distal vom unteren Gewinde (Abbildung 5C).
  3. Führen Sie das Plastikstück unter die Arterie zwischen den beiden Fäden ein, um die Stelle für eine FeCl3-Verletzung zu markieren (Abbildung 5C).
  4. Führen Sie Durchflussmessungen durch, bevor Sie eine Verletzung durchführen, um den Basalfluss zu notieren. Diese Messungen werden verwendet, um zu entscheiden, in welchem Stadium die Probe entnommen wird.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Fixiermittel (3% Paraformaldehyd/PFA + 0,1% Glutaraldehyd, beide hergestellt in 1x PBS) fertig und bei RT ist. Alternativ kann auch eine Fixierung mit 2,5% Glutaraldehyd in einem salzhaltigen Hintergrund verwendet werden.
    ACHTUNG: Sowohl Paraformaldehyd als auch Glutaraldehyd sind hochgiftig und reizend. Beim Umgang mit ihnen sollten Handschuhe, ein Augenschutz und Masken verwendet werden, um sich vor Exposition zu schützen. Alle Fixierlösungen sind giftig und die Fixierschritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden.
  5. Führen Sie die Verletzung durch, indem Sie FeCl 3-getränktes Filterpapier für 3 Minuten auf die Arterie legen (8% FeCl3 wird verwendet) (diese Zeit kann ebenfalls variieren). Entfernen Sie nach 3 Minuten das Filterpapier und fügen Sie Kochsalzlösung an der Verletzungsstelle hinzu, um überschüssiges FeCl3 zu entfernen. Dieser Schritt ist notwendig, um das variable Ausmaß der Verletzung zu verhindern und die Durchflusszählung durch die Sonde zu erleichtern (Abbildung 5D).
  6. Überwachen Sie den Durchflusswert. Wenn der Durchfluss unter 50 % des Ausgangswerts fällt, entfernen Sie die Sonde. Trocknen Sie den Bereich schnell ab und fügen Sie das Fixiermittel in den Bereich ein, um den Verletzungsbereich äußerlich zu fixieren.
  7. Halten Sie die Arterie sofort mit einer Pinzette in der Nähe des Verletzungsbereichs und schneiden Sie stromabwärts des Unterfadens und stromaufwärts des Oberfadens. Bitten Sie gegebenenfalls eine andere Person, Ihnen beim Abschneiden eines Endes zu helfen. Legen Sie das Gewebe in der gleichen Ausrichtung auf die Kunststoff-Gewebekulturschale, in der es gesammelt wurde, und fügen Sie ein paar Tropfen des Fixiermittels hinzu.
    HINWEIS: Das Schneiden der Arterie verursacht sofortige ausgedehnte Blutungen, also stellen Sie sicher, dass Sie die Arterie halten, bevor Sie sie zum ersten Mal durchtrennen. In diesem Szenario wird die Maus ausgeblutet. Die Maus wird durch Ausbluten und Zervixluxation eingeschläfert.
  8. Reinigen Sie mit einem Skalpell das zusätzliche Gewebe um die Arterie. Achten Sie darauf, die Ausrichtung des Blutflusses aufzuzeichnen. Um dies zu markieren, schneiden Sie ein Ende horizontal und das andere sich verjüngend/schräg (Abbildung 5E).
  9. Bewahren Sie die Probe 1 h bei RT in Fixiermittel (3% PFA und 0,1% Glutaraldehyd) auf. Lagern Sie die Probe dann in 1 % PFA bei 4 °C, bis sie auf nassem Eis zur EM-Analyse an das Probenverarbeitungslabor geschickt wird.
    HINWEIS: Die Proben sollten nicht eingefroren werden. Die Herausforderungen bei dieser Methode der Probenentnahme sind:
    1. Der anfängliche Messwert ist möglicherweise nicht optimal oder kann nach der Verletzung schwanken. Dies kann sich auf das Ausmaß der Verletzung auswirken, die für die EM-Analyse ausgewählt wird. Um dieses Problem zu beheben, stellen Sie sicher, dass Sie den Basiswert einige Minuten lang aufzeichnen, nachdem Sie verschiedene Positionen der Sonde ausprobiert haben, um zu entscheiden, welche Position optimal ist.
    2. Die Zeit, um die Verletzung durch Hinzufügen eines externen Fixiermittels und eines tatsächlichen Schneidens des arteriellen Abschnitts für die Analyse zu stoppen, kann die Variabilität des Ausmaßes der Thrombose erhöhen. Seien Sie bei der Probenentnahme schnell, nachdem Sie sie extern befestigt haben.
  10. Erhalten Sie die Proben zur Verarbeitung für die EM-Analyse in 1% PFA auf nassem Eis. Spülen Sie die Proben 3 Minuten lang auf Eis mit 0,1 M Cacodylatpuffer, um die weitere Verarbeitung einzuleiten.
  11. Fixieren Sie die Proben für 1 h auf Eis in 0,1 M Cacodylatpuffer + 2,5% Glutaraldehyd + 2 mM CaCl2.
  12. Entsorgen Sie das Fixiermittel und waschen Sie die Proben mit kaltem 0,1 M Natriumcacodylatpuffer mit 2 mM CaCl2 (5 x 3 min) (Abbildung 6A).
  13. Die Proben werden mit Osmiumlösung (3% Kaliumferrocyanid [K 4 C 6 N6Fe] + 0,3 M Cacodylatpuffer + 4 mM CaCl 2 gemischt mit einem gleichen Volumen von4% wässrigem Osmiumtetroxid [OsO4; in ddH2 O]) für 1 h auf Eis fixiert.
  14. Während die Proben fixiert werden, wird eine frische 1%ige Trichloracetaldehydhydrat (TCH)-Lösung in ddH2O hergestellt. Inkubieren Sie die Lösung bei 60 °C für 1 Stunde unter vorsichtigem Mischen.
  15. Waschen Sie die Proben nach dem Fixieren mit ddH2O bei RT für 5 x 3 min.
  16. Inkubieren Sie die Proben in filtrierter 1%iger TCH-Lösung (hergestellt in ddH2O) für 20 Minuten bei RT.
  17. Waschen Sie die Proben mit ddH2O bei RT (5 x 3 min).
  18. Fixieren Sie die Proben in 2% Osmiumtetroxid in ddH2O für 30 min bei RT.
  19. Waschen Sie die Proben mit ddH2O bei RT jeweils 5 x 3 min.
  20. Die Proben werden in 1 % Uranylacetat (wässrig) eingelegt und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
  21. Waschen Sie die Proben mit ddH2O bei RT für jeweils 5 x 3 min und verarbeiten Sie sie mit der Bleiaspartatfärbung en bloc Walton.
  22. En bloc Waltons Blei-Aspartat-Färbung3:
    1. 30 mM L-Asparaginsäurelösung in ddH2O herstellen.
      HINWEIS: Die Asparaginsäure löst sich schneller auf, wenn der pH-Wert auf 3,8 erhöht wird. Diese Stammlösung ist im Kühlschrank 1-2 Monate haltbar.
    2. Stellen Sie 20 mM Bleinitratlösung in 10 ml Asparaginsäurevorrat her und stellen Sie den pH-Wert mit 1 N KOH auf 5,5 ein.
    3. Die Proben werden 30 Minuten lang bei 60 °C in Bleiaspartatlösung gegeben, nachdem sie fünf Mal mit ddH2O bei RT jeweils 3 Minuten lang gewaschen wurden.
  23. Dehydrieren Sie die Proben mit einer abgestuften Ethanolreihe. Verwenden Sie die chemische Dehydratisierung nach dem Valdivia-Protokoll18.
    1. Waschen Sie die Proben in jeder der folgenden Lösungen, um die Probe schrittweise zu dehydrieren (Abbildung 6B):
      25% Ethylalkohol für 3 min
      50% Ethylalkohol für 3 min
      75% Ethylalkohol für 3 min
      95% Ethylalkohol für 3 min
      100% Ethylalkohol für 10 Minuten und wiederholen Sie den Schritt zweimal (insgesamt drei Wäschen).
  24. Waschen Sie die Proben 10 Minuten lang in 100% Propylenoxid (PO) und wiederholen Sie den Schritt zweimal (insgesamt drei Wäschen).
  25. Inkubation in 50%/50% PO/Harz mit DMP 30 Aktivator über Nacht bei RT und Einbettung in 100% Araldite 502/embed 812/DDSA mit DMP30 Aktivator für 48 h.

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Ergebnisse

Die Daten werden im Allgemeinen als Zeit bis zum Verschluss oder als Zeit dargestellt, die benötigt wird, um einen vollständig okklusiven Thrombus zu bilden. Diese Daten können als Kaplan-Meier-Überlebenskurve (Abbildung 4A)19, als Punktdiagramm mit Balken, die den terminalen Blutfluss zum Zeitpunkt der Beendigung des Blutflusses oder der Beendigung eines Experiments (Abbildung 4B) zeigen, oder als Liniendiagramm (Abbildung 4C) dargestell...

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Diskussion

Die topische Anwendung von FeCl3 auf das Gefäßsystem zur Induktion von Thrombosen ist eine weit verbreitete Technik und hat maßgeblich dazu beigetragen, Rollen für verschiedene Thrombozytenrezeptoren, Ligandensignalwege und ihre Inhibitorenzu etablieren 20,21,22,23. Der Mechanismus, durch den FeCl3 eine Thrombose verursacht, ist vielfältig; Früher wurde die endotheliale De...

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Offenlegungen

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie.

ORCID-Profile: S.J.: 0000-0001-6925-2116; S.W.W.: 00000-0001-5577-0473.

Danksagungen

Die Autoren danken den Mitgliedern des Whiteheart Laboratory für die sorgfältige Durchsicht dieses Manuskripts. Die Arbeit wurde durch Zuschüsse des NIH, des NHLBI (HL56652, HL138179 und HL150818) sowie durch einen Verdienstpreis des Department of Veterans Affairs an S.W.W., R01 HL 155519 an BS und einen Zuschuss des NIBIB intramuralen Programms an R.D.L. unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
0,9% SalzlösungFisher Wissenschaftlich BP358-212NaCl zur Herstellung einer Lösung von 0,9 % Kochsalzlösung
1 mL Spritze Becton, Dickinson und Co.
190 Proof Ethanol KOPTECV1101 Wird verwendet, um eine 70%ige Ethanollösung herzustellen, die zur Vorbereitung der Maus für die Operation verwendet wird 
2,2,2 TribromoethanolSigma Aldrich48402
25 Yard Schwarz Geflochtenes Seidennaht (5-0)DEKNATEL136082-1204
26G x 3/8 Nadel Becton, Dickinson und Co.305110
2-Methyl-2-butanolSigma Aldrich240486
7,5 mL Transferpipette, graduiert auf 3 mLGlobe Scientific Inc.135010
Alkohol-Vorbereitungspads (70% Isopropylalkohol)MedlineMDS090735
Araldite GY 502 Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie 10900
Zellkulturschale 35 mm x 10 mmCorning Incorporated 
Kompakte Waage Wards Wissenschaft 470314-390
Präparierschere, 12,5 cm langWorld Precision Instrument15922-G
DMP-30 Aktivator Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie 13600
Dodenyl Bernsteinsäureanhydrid / DDSAElektronenmikroskopie Dienstleistungen 13700
Doggy Poo Bags/Tierkadaver EntsorgungsbeutelCrown Products PP-RB-200
Doppler-DurchflusssondeTransonic Systems Inc.MA0.5PSB
EMBED 812 Harz Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie 14900
Ethylalkohol, wasserfrei 200 ProofDienstleistungen in der Elektronenmikroskopie 15055
Augenzange, 4" voll gebogen, Standard, 0,8 mm breite SpitzenIntegra Miltex18-784
FilterpapierVWR28310-106
Feine Schere - Scharf-stumpfefeine wissenschaftliche Werkzeuge 14028-10
Fingerschlaufe Ohrlocher Feine wissenschaftliche Werkzeuge 24212-01
Mullschwämme 2" x 2" – 12-lagigDukal Corporation2128
Glutaraldehyd (10%ige Lösung)Elektronenmikroskopie Dienstleistungen 16120
Integra Miltex Chirurgische Klinge aus Kohlenstoffstahl #10Integra® Miltex®4110
Eisen(III)-chlorid SIGMA-ALDRICH157740-100G
Messergriff Miltex® Extra feiner Edelstahl Größe 3Integra Lifesciences157510
L-AsparaginsäureSigma  Fischer  A93100
L-AsparaginsäureFisher Scientific BP374-100
Bleinitrat Fisher Wissenschaftlich L-62
LEICA S8AP0 MikroskopLEICANicht mehrlieferbar Nicht mehr lieferbar bei der Firma
LEICA S8AP0 Mikroskop Ständer LEICA10447255bei der Firma
Light-Duty Tissue-Wischtücher nicht mehr erhältlich VWR82003-822
Mikro-Präparierzange; 1x2 Zähne, volle Kurve; 0,8 mm Spitzenbreite; 4" LängeRoboz Surgical Instrument CompanyRS-5157
Osmiumtetroxid 4%ige wässrige Lösung Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie 19150
Paraformaldehyd (16%ige Lösung)Elektronenmikroskopie Dienstleistungen 15710
KaliumferricyanidSIGMA-ALDRICHP-8131
Propylenoxid, ACS-ReagenzDienstleistungen in der Elektronenmikroskopie 20401
Rainin Classic Pipette PR-10Rainin17008649
Forschung Durchflussmesser Transonic Systems Inc.T402B01481Modell: T402
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Referenzen

  1. Lozano, R., et al. Global and regional mortality from 235 causes of death for 20 age groups in 1990 and 2010: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2010. Lancet. 380 (9859), 2095-2128 (2012).
  2. Raskob, G. E., et al. Thrombosis: a major contributor to global disease burden. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (11), 2363-2371 (2014).
  3. Walton, J. Lead aspartate, an en bloc contrast stain particularly useful for ultrastructural enzymology. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 27 (10), 1337-1342 (1979).
  4. Palta, S., Saroa, R., Palta, A. Overview of the coagulation system. Indian Journal of Anaesthesia. 58 (5), 515-523 (2014).
  5. Joshi, S., Whiteheart, S. W. The nuts and bolts of the platelet release reaction. Platelets. 28 (2), 129-137 (2017).
  6. Periayah, M. H., Halim, A. S., Mat Saad, A. Z. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis. International Journal of Hematology-Oncology and Stem Cell Research. 11 (4), 319-327 (2017).
  7. Alexopoulos, D., Katogiannis, K., Sfantou, D., Lekakis, J. Combination antiplatelet treatment in coronary artery disease patients: A necessary evil or an overzealous practice. Platelets. 29 (3), 228-237 (2018).
  8. Kurz, K. D., Main, B. W., Sandusky, G. E. Rat model of arterial thrombosis induced by ferric chloride. Thrombosis Research. 60 (4), 269-280 (1990).
  9. Denis, C. V., et al. Towards standardization of in vivo thrombosis studies in mice. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (8), 1641-1644 (2011).
  10. Marsh Lyle, E., et al. Assessment of thrombin inhibitor efficacy in a novel rabbit model of simultaneous arterial and venous thrombosis. Thrombosis and Haemostasis. 79 (3), 656-662 (1998).
  11. Kato, Y., et al. Inhibition of arterial thrombosis by a protease-activated receptor 1 antagonist, FR171113, in the guinea pig. European Journal of Pharmacology. 473 (2-3), 163-169 (2003).
  12. Huttinger, A. L., et al. Ferric chloride-induced canine carotid artery thrombosis: a large animal model of vascular injury. Journal of Visualized Experiments. (139), e57981(2018).
  13. Zhang, W., et al. Antithrombotic therapy by regulating the ROS-mediated thrombosis microenvironment and specific nonpharmaceutical thrombolysis Using Prussian blue nanodroplets. Small. 18 (15), 2106252(2022).
  14. Liu, B., et al. Platelet membrane cloaked nanotubes to accelerate thrombolysis by thrombus clot-targeting and penetration. Small. , 2205260(2022).
  15. Refaat, A., et al. Near-infrared light-responsive liposomes for protein delivery: Towards bleeding-free photothermally-assisted thrombolysis. Journal of Controlled Release. 337, 212-223 (2021).
  16. Li, S., et al. Biomimetic nanoplatelets to target delivery hirudin for site-specific photothermal/photodynamic thrombolysis and preventing venous thrombus formation. Small. 18 (51), 2203184(2022).
  17. Subramaniam, S., Kanse, S. M. Ferric chloride-induced arterial thrombosis in mice. Current Protocols in Mouse Biology. 4 (4), 151-164 (2014).
  18. Cocchiaro, J. L., Kumar, Y., Fischer, E. R., Hackstadt, T., Valdivia, R. H. Cytoplasmic lipid droplets are translocated into the lumen of the Chlamydia trachomatis parasitophorous vacuole. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (27), 9379-9384 (2008).
  19. Kaplan, E. L., Meier, P. Nonparametric-estimation from incomplete observations. Journal of the American Statistical Association. 53 (282), 457-481 (1958).
  20. Chauhan, A. K., Kisucka, J., Lamb, C. B., Bergmeier, W., Wagner, D. D. von Willebrand factor and factor VIII are independently required to form stable occlusive thrombi in injured veins. Blood. 109 (6), 2424-2429 (2007).
  21. Andre, P., et al. CD40L stabilizes arterial thrombi by a beta3 integrin--dependent mechanism. Nature Medicine. 8 (3), 247-252 (2002).
  22. Ni, H., et al. Persistence of platelet thrombus formation in arterioles of mice lacking both von Willebrand factor and fibrinogen. Journal of Clinical Investigation. 106 (3), 385-392 (2000).
  23. Bergmeier, W., et al. The role of platelet adhesion receptor GPIbalpha far exceeds that of its main ligand, von Willebrand factor, in arterial thrombosis. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (45), 16900-16905 (2006).
  24. Ciciliano, J. C., et al. Resolving the multifaceted mechanisms of the ferric chloride thrombosis model using an interdisciplinary microfluidic approach. Blood. 126 (6), 817-824 (2015).
  25. Eckly, A., et al. Mechanisms underlying FeCl3-induced arterial thrombosis. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 9 (4), 779-789 (2011).
  26. Woollard, K. J., Sturgeon, S., Chin-Dusting, J. P. F., Salem, H. H., Jackson, S. P. Erythrocyte hemolysis and hemoglobin oxidation promote ferric chloride-induced vascular injury. Journal of Biological Chemistry. 284 (19), 13110-13118 (2009).
  27. Shim, Y., et al. Characterization of ferric chloride-induced arterial thrombosis model of mice and the role of red blood cells in thrombosis acceleration. Yonsei Medical Journal. 62 (11), 1032-1041 (2021).
  28. Ghosh, S., et al. Evaluation of the prothrombotic potential of four-factor prothrombin complex concentrate (4F-PCC) in animal models. PLoS One. 16 (10), 0258192(2021).
  29. Wilbs, J., et al. Cyclic peptide FXII inhibitor provides safe anticoagulation in a thrombosis model and in artificial lungs. Nature Communications. 11 (1), 3890(2020).
  30. Wei, Y., Deng, X., Sheng, G., Guo, X. B. A rabbit model of cerebral venous sinus thrombosis established by ferric chloride and thrombin injection. Neuroscience Letters. 662, 205-212 (2018).
  31. Jacob-Ferreira, A. L., et al. Antithrombotic activity of Batroxase, a metalloprotease from Bothrops atrox venom, in a model of venous thrombosis. International Journal of Biological Macromolecules. 95, 263-267 (2017).
  32. Zhou, X., et al. A rabbit model of cerebral microembolic signals for translational research: preclinical validation for aspirin and clopidogrel. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 14 (9), 1855-1866 (2016).
  33. Yang, X., et al. Effect of evodiamine on collagen-induced platelet activation and thrombosis. BioMed Research International. 2022, 4893859(2022).
  34. Li, W., McIntyre, T. M., Silverstein, R. L. Ferric chloride-induced murine carotid arterial injury: A model of redox pathology. Redox Biology. 1 (1), 50-55 (2013).
  35. Li, W., Nieman, M., Sen Gupta, A. Ferric chloride-induced murine thrombosis models. Journal of Visualized Experiments. (115), e54479(2016).
  36. Holly, S. P., et al. Ether lipid metabolism by AADACL1 regulates platelet function and thrombosis. Blood Advances. 3 (22), 3818-3828 (2019).
  37. Bird, J. E., et al. Prediction of the therapeutic index of marketed anti-coagulants and anti-platelet agents by guinea pig models of thrombosis and hemostasis. Thrombosis Research. 123 (1), 146-158 (2008).

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