Eisenchlorid-induzierte arterielle Thrombose und Probenentnahme für die 3D-Elektronenmikroskopie-Analyse

Summary

Das vorliegende Protokoll beschreibt, wie eine FeCl_{3-vermittelte} Verletzung verwendet werden kann, um eine arterielle Thrombose zu induzieren, und wie arterielle Verletzungsproben in verschiedenen Stadien der Thrombose für die elektronenmikroskopische Analyse gesammelt und vorbereitet werden.

Abstract

Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind weltweit eine der Hauptursachen für Mortalität und Morbidität. Aberrante Thrombosen sind ein häufiges Merkmal von systemischen Erkrankungen wie Diabetes und Fettleibigkeit sowie chronisch entzündlichen Erkrankungen wie Arteriosklerose, Krebs und Autoimmunerkrankungen. Bei einer Gefäßverletzung wirken in der Regel das Gerinnungssystem, die Blutplättchen und das Endothel orchestriert, um Blutungen zu verhindern, indem sie an der Stelle der Verletzung ein Gerinnsel bilden. Anomalien in diesem Prozess führen entweder zu übermäßigen Blutungen oder zu unkontrollierten Thrombosen/unzureichender antithrombotischer Aktivität, was sich in einem Gefäßverschluss und seinen Folgen niederschlägt. Das FeCl 3-induzierte Carotis-Verletzungsmodell ist ein wertvolles Werkzeug, um zu untersuchen, wie eine Thrombose in vivo beginnt und fortschreitet. Dieses Modell beinhaltet eine Endothelschädigung/Denudation und die anschließende Gerinnselbildung an der verletzten Stelle. Es bietet einen hochempfindlichen, quantitativen Assay zur Überwachung von Gefäßschäden und Gerinnselbildung als Reaktion auf unterschiedlich schwere Gefäßschäden. Nach der Optimierung kann diese Standardtechnik verwendet werden, um die molekularen Mechanismen zu untersuchen, die der Thrombose zugrunde liegen, sowie die ultrastrukturellen Veränderungen der Blutplättchen in einem wachsenden Thrombus. Dieser Assay ist auch nützlich, um die Wirksamkeit von Antithrombotika und Thrombozytenaggregationshemmern zu untersuchen. In diesem Artikel wird erläutert, wie eine FeCl 3-induzierte arterielle Thrombose initiiert und überwacht wird und wie Proben für die elektronenmikroskopische Analyse entnommen werden.

Introduction

Thrombose ist die Bildung eines Blutgerinnsels, das ein Blutgefäß teilweise oder vollständig blockiert und den natürlichen Blutfluss behindert. Dies führt zu schweren und tödlichen kardiovaskulären Ereignissen wie ischämischen Herzerkrankungen und Schlaganfällen. Herz-Kreislauf-Erkrankungen sind die häufigste Ursache für Morbidität und Mortalität und verursachen weltweit jeden vierten Todesfall ^1,2,3. Obwohl sich eine Thrombose als Fehlfunktion des Gefäßsystems manifestiert, kann sie auf eine zugrunde liegende mikrobielle oder virale Infektion, eine Immunstörung, eine Maligni....

Protocol

Alle hier besprochenen Experimente wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Kentucky geprüft und genehmigt.

HINWEIS: Chirurgische Instrumente sind in Abbildung 1 und der Materialtabelle aufgeführt. Es wurden C57BL/6J-Mäuse, 8-10 Wochen alt, männlich/weiblich oder relevante genetisch manipulierte (Knockout oder Knockin) Stämme verwendet.

1. FeCl 3-induzierte Verletzung der Halsschlagader

1. Induktion der Mausanästhesie
   1. Wiegen Sie die Maus.
   2. Anästhesieren Sie die Maus durch i....

Results

Die Daten werden im Allgemeinen als Zeit bis zum Verschluss oder als Zeit dargestellt, die benötigt wird, um einen vollständig okklusiven Thrombus zu bilden. Diese Daten können als Kaplan-Meier-Überlebenskurve (Abbildung 4A)¹⁹, als Punktdiagramm mit Balken, die den terminalen Blutfluss zum Zeitpunkt der Beendigung des Blutflusses oder der Beendigung eines Experiments (Abbildung 4B) zeigen, oder als Liniendiagramm (Abbildung 4C) dargestell.......

Discussion

Die topische Anwendung von FeCl₃ auf das Gefäßsystem zur Induktion von Thrombosen ist eine weit verbreitete Technik und hat maßgeblich dazu beigetragen, Rollen für verschiedene Thrombozytenrezeptoren, Ligandensignalwege und ihre Inhibitoren^{zu etablieren 20,21,22,23}. Der Mechanismus, durch den FeCl₃ eine Thrombose verursacht, ist vielfältig; Früher wurde die endotheliale De.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,9% Salzlösung	Fisher Wissenschaftlich	BP358-212	NaCl zur Herstellung einer Lösung von 0,9 % Kochsalzlösung
1 mL Spritze	Becton, Dickinson und Co.
190 Proof Ethanol	KOPTEC	V1101	Wird verwendet, um eine 70%ige Ethanollösung herzustellen, die zur Vorbereitung der Maus für die Operation verwendet wird
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma Aldrich	48402
25 Yard Schwarz Geflochtenes Seidennaht (5-0)	DEKNATEL	136082-1204
26G x 3/8 Nadel	Becton, Dickinson und Co.	305110
2-Methyl-2-butanol	Sigma Aldrich	240486
7,5 mL Transferpipette, graduiert auf 3 mL	Globe Scientific Inc.	135010
Alkohol-Vorbereitungspads (70% Isopropylalkohol)	Medline	MDS090735
Araldite GY 502	Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie	10900
Zellkulturschale 35 mm x 10 mm	Corning Incorporated
Kompakte Waage	Wards Wissenschaft	470314-390
Präparierschere, 12,5 cm lang	World Precision Instrument	15922-G
DMP-30 Aktivator	Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie	13600
Dodenyl Bernsteinsäureanhydrid / DDSA	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	13700
Doggy Poo Bags/Tierkadaver Entsorgungsbeutel	Crown Products	PP-RB-200
Doppler-Durchflusssonde	Transonic Systems Inc.	MA0.5PSB
EMBED 812 Harz	Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie	14900
Ethylalkohol, wasserfrei 200 Proof	Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie	15055
Augenzange, 4" voll gebogen, Standard, 0,8 mm breite Spitzen	Integra Miltex	18-784
Filterpapier	VWR	28310-106
Feine Schere - Scharf-stumpfe	feine wissenschaftliche Werkzeuge	14028-10
Fingerschlaufe Ohrlocher	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	24212-01
Mullschwämme 2" x 2" – 12-lagig	Dukal Corporation	2128
Glutaraldehyd (10%ige Lösung)	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	16120
Integra Miltex Chirurgische Klinge aus Kohlenstoffstahl #10	Integra® Miltex®	4110
Eisen(III)-chlorid	SIGMA-ALDRICH	157740-100G
Messergriff Miltex® Extra feiner Edelstahl Größe 3	Integra Lifesciences	157510
L-Asparaginsäure	Sigma  Fischer	A93100
L-Asparaginsäure	Fisher Scientific	BP374-100
Bleinitrat	Fisher Wissenschaftlich	L-62
LEICA S8AP0 Mikroskop	LEICA	Nicht mehr	lieferbar Nicht mehr lieferbar bei der Firma
LEICA S8AP0 Mikroskop Ständer	LEICA	10447255	bei der Firma
Light-Duty Tissue-Wischtücher nicht mehr erhältlich	VWR	82003-822
Mikro-Präparierzange; 1x2 Zähne, volle Kurve; 0,8 mm Spitzenbreite; 4" Länge	Roboz Surgical Instrument Company	RS-5157
Osmiumtetroxid 4%ige wässrige Lösung	Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie	19150
Paraformaldehyd (16%ige Lösung)	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	15710
Kaliumferricyanid	SIGMA-ALDRICH	P-8131
Propylenoxid, ACS-Reagenz	Dienstleistungen in der Elektronenmikroskopie	20401
Rainin Classic Pipette PR-10	Rainin	17008649
Forschung Durchflussmesser	Transonic Systems Inc.	T402B01481	Modell: T402
Scotch Magic Invisible Tape, 3/4" x 1000", Clear	Scotch
Heizkissen für Kleintiere	K& H Manufacturing Inc.	Modell: HM10
Natriumcacodylat-Puffer 0,2 m, pH7,4	Elektronenmikroskopie Dienstleistungen	11623
Sterile Applikatoren mit Baumwollspitze	Puritanische Medizinprodukte	25-806 1WC
Steromaster Beleuchtung	Fisher Wissenschaftlich	12-562-21	Nicht mehr lieferbar bei der Firma
Surgical Dumont #7 Pinzette	Feine wissenschaftliche Werkzeuge	11271-30
Thiocarbohydrazid (TCH)	SIGMA-ALDRICH	88535
Universal-Pipettenspitzen-Nachlader mit geringer Retention (0,1-10 &; Mikro; L)	VWR	76323-394
Uranylacetat-Elektronenmikroskopie-Dienstleistungen		22400
Veet Gel Cream Haarentferner	Reckitt Benckiser	3116875
Weiß Antistatisch Sechseckige Waage, Mittel, 64 x 15 x 19 mm	Fisher Scientific	S38975
WinDAQ/100 Software für Windows	DATAQ Instruments, Inc.	Version 3.38	Kostenlos zum Download verfügbar. https://www.dataq.com/products/windaq/
ZEISS AxioCam Icc 1	ZEISS	57615