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Methodenartikel

Messung des axonalen Frachttransports in primär kortikal kultivierten Neuronen der Maus

743 Ansichten

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DOI:

10.3791/64999

⸱

24. Februar 2023

 , 
1Laboratory of Neuroscience, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, 2Advanced Prevention and Research Laboratory for Dementia, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt das gesamte Verfahren der Analyse des axonalen Transports. Insbesondere die Berechnung der Transportgeschwindigkeit ohne das Pausieren und die Visualisierungsmethode mittels der Open-Access-Software "KYMOMAKER" werden hier gezeigt.

Zusammenfassung

Neuronale Zellen sind hochpolarisierte Zellen, die stereotyp mehrere Dendriten und ein Axon beherbergen. Die Länge eines Axons erfordert einen effizienten bidirektionalen Transport durch Motorproteine. Verschiedene Berichte deuten darauf hin, dass Defekte im axonalen Transport mit neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht werden. Auch der Mechanismus der Koordination mehrerer Motorproteine war ein attraktives Thema. Da das Axon unidirektionale Mikrotubuli hat, lässt sich leichter bestimmen, welche Motorproteine an der Bewegung beteiligt sind. Daher ist das Verständnis der Mechanismen, die dem Transport axonaler Fracht zugrunde liegen, entscheidend, um den molekularen Mechanismus neurodegenerativer Erkrankungen und die Regulation von Motorproteinen aufzudecken. Hier stellen wir den gesamten Prozess der axonalen Transportanalyse vor, einschließlich der Kultivierung primärer kortikaler Neuronen der Maus, der Transfektion von Plasmiden, die für Frachtproteine kodieren, sowie der Richtungs- und Geschwindigkeitsanalysen ohne den Effekt von Pausen. Des Weiteren wird die Open-Access-Software "KYMOMAKER" vorgestellt, die die Generierung eines Kymographen ermöglicht, um Transportspuren entsprechend ihrer Richtung hervorzuheben und den axonalen Transport leichter sichtbar zu machen.

Einleitung

Mitglieder der Kinesin-Familie und zytoplasmatisches Dynein sind Motorproteine, die sich entlang der Mikrotubuli in Zellen bewegen, um ihre Fracht zu transportieren1. Die meisten Kinesine bewegen sich in Richtung des Plus-Endes, während sich Dynein in Richtung des Minus-Endes eines Mikrotubuli bewegt. Die Funktionen und Mechanismen des Frachttransports im neuronalen Axon wurden umfassend untersucht. Aufgrund ihrer Länge benötigen Axone einen stabilen Transport über weite Strecken, um die Gesundheit der Neuronen zu erhalten. Defekte im Transport von Mitochondrien, Autophagosomen und Vesikel, die Amyloid-β-Protein-Vorläufer (APP) enthalten, wurden als Ursachen für neurodegenerative Erkrankungen berichtet 2,3. Zahlreiche In-vitro-Untersuchungen haben die Mechanismen aufgedeckt, die dem koordinierten Transport von Motorproteinen zugrunde liegen, und verschiedene Studien mit gereinigten Motorproteinen und Mikrotubuli haben aufgedeckt, wie sich motorische Moleküle entlang von Mikrotubuli bewegen 4,5. Typischerweise sind mehrere Motoren an einer einzigen Ladungbeteiligt 6. Es gibt jedoch einige Modelle, wie die entgegengesetzten Motoren die Richtung des Gütertransports bestimmen. Eines davon ist das "Assoziations-/Dissoziationsmodell"; Dabei werden während des unidirektionalen Transports nur einseitige Motoren mit der Ladung in Verbindung gebracht. Im zweiten, dem "Koordinationsmodell", werden beide Motoren an dieselbe Ladung angehängt und nur eine Seite des Motors wird aktiviert. Im dritten "Tauziehmodell" bestimmt das Kräfteverhältnis zwischen Kinesins und Dynein die Transportrichtung 7,8,9. Darüber hinaus deuten mehrere Berichte darauf hin, dass das Gleichgewicht und die Anzahl der aktivierten Motorproteine die Geschwindigkeit des Frachttransports in vitro beeinflussen 8,10.

Eine unbeantwortete Frage ist, wie diese Aktivitäten von Kinesinen oder Dyneinen in lebenden Zellen reguliert werden. Frühere Berichte haben gezeigt, dass die Acetylierung von Mikrotubuli in Axonen und neurotrophe Faktoren den axonalen Transport verstärken11,12. Außerdem fungieren verschiedene Arten von Ladung und Ladungsadaptern in entsprechender Weise als Motoraktivatoren13,14. Viele sind mit der Membran von Transportvesikeln assoziiert, und ihre Funktionen werden durch Signale wie posttranslationale Modifikationen reguliert15. Daher bietet die Beobachtung der Transportrichtung und -geschwindigkeit in lebenden Zellen wertvolle Einblicke in die molekulare Regulation des Frachttransports in in vitro-Experimenten. Die Beobachtung des axonalen Transports ermöglicht die Unterscheidung zwischen Kinesin- und Dynein-basiertem Transport. Da Axone unidirektionale Mikrotubuli16 am Plus-Ende beherbergen, wird die Fracht anterograd (d.h. von Soma zu Axonterminal) von Kinesinen und retrograd (d.h. von Axonterminal zu Soma) von Dyneinen transportiert.

In der vorliegenden Arbeit wird eine Methode zur Beobachtung und Analyse des axonalen Transports in primär kultivierten Neuronen beschrieben. Als Beispiel wird das Verfahren zur Beobachtung des axonalen Transports von Membranproteinen-APP, Calsyntenin-1/Alcadein α (Alcα) und Calsyntenin-3/Alcadein β (Alcβ)-haltigen Vesikeln beschrieben. Es ist bekannt, dass der anterograde Transport von APP-haltigen Vesikeln erheblich schneller ist als der von Alcα-haltigen Vesikel, obwohl beide von Kinesin-1 transportiert werden 17,18,19. In früheren Berichten wurden mehrere Methoden zur Messung der Geschwindigkeit verwendet. Der variabelste Schritt ist der Umgang mit Pausen während des Transports. In lebenden Zellen wird der Transport manchmal durch Hindernisse entlang der Mikrotubuli behindert; Motoren können jedoch einen Bereich mit oder ohne Pause20 umgehen. Die Berechnung der Geschwindigkeit über einen längeren Beobachtungszeitraum kann durch die Pause beeinträchtigt werden, was zu einer langsameren Geschwindigkeitsschätzung führen kann. Hier wird ein Verfahren beschrieben, bei dem die Bewegung über einen segmentierten Zeitraum (200 ms) verwendet wird, um den Effekt der physikalischen Pause von Motoren auszuschließen. Schließlich wird ein frei zugängliches (nur Windows) Softwareprogramm namens "KYMOMAKER"21 vorgestellt. Kymographen werden häufig verwendet, um den vesikulären Transport zu visualisieren, und sind nützlich, um die Transportrichtung jeder Ladung zu visualisieren, ohne dass ein Film erforderlich ist. Die Software generiert Kymographen aus Zeitrafferfilmen, indem sie während der Drehung der Bilder mehrmals einen eindimensionalen Watershed-Algorithmus anwendet. Dadurch kann der resultierende Kymograph feine Strukturen effizient und einfach darstellen. Darüber hinaus erkennt und markiert KYMOMAKER automatisch Trails entsprechend ihrer Richtung und ermöglicht die Erstellung von leicht verständlichen Diagrammen.

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Protokoll

Die Versuche wurden vom Animal Studies Committee der Universität Hokkaido nach den ARRIVE-Richtlinien (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden weibliche C57BL/6J-Mäuse (schwanger, 15,5 Tage) verwendet.

1. Präparation von primären kortikalen kultivierten Neuronen der Maus

  1. 0,1 mg/ml Poly-L-Lysin in 0,1 M Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan)-HCl (pH 8,5) in eine 8-Well-Glasbodenkammer (Nr. 1.0) geben (siehe Materialtabelle). Die Kammer in einem 37 °C heißen Inkubator für mindestens 1 h inkubieren.
  2. Spülen Sie die Kammer mindestens dreimal mit sterilisiertem Wasser und trocknen Sie sie an der Luft in einer Gewebekulturhaube.
  3. Opfern Sie die trächtigen Mäuse im Alter von 15,5 Tagen durch Gebärmutterhalsluxation oder nach institutionell anerkannten Vorschriften.
  4. Kneifen Sie das Gebärmutterhorn mit den Embryonen zusammen, isolieren Sie die gesamten Gebärmutterhörner mit einer Schere und tauchen Sie sie in kalte phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) auf Eis.
  5. Bei kalter PBS isolieren Sie die Embryonen mit einer scharfen Pinzette und entfernen alle Amnionmembranen von den Embryonen.
  6. Waschen Sie die Embryonen erneut mit frischem, kaltem PBS.
    HINWEIS: Waschen Sie bei jedem Isolierungsschritt so viel Blut wie möglich aus und achten Sie darauf, die Gefäße oder Embryonen nicht zu beschädigen.
  7. Legen Sie einen Embryo auf eine sterilisierte Gaze in einer kalten Petrischale unter Lichtmikroskopie.
  8. Isolieren Sie das Gehirn. Schneide den Kopf, die Haut und den Schädel des Embryos mit der Spitze einer gebogenen, scharfen Pinzette ab. Entferne die Haut und den Schädel, um die Oberseite und die Seiten des Gehirns freizulegen.
  9. Schöpfen Sie das gesamte Gehirn mit dem gebogenen Teil der Pinzette aus und tauchen Sie es in eine Petrischale mit eiskalter 1x Hanks' ausgewogener Salzlösung (HBSS; 10 mM HEPES [pH 7,6], 5,3 mM KCl, 0,44 mM KH2PO4, 140 mM NaCl, 4,2 mM NaHCO3, 0,34 mM Na2HPO4, 39 mM D-Glukose, und 0,5 μg/ml Gentamicin; siehe Materialtabelle).
  10. Wiederholen Sie die Schritte 1.7-1.9, bis die erforderliche Anzahl von Gehirnen erreicht ist.
    HINWEIS: Typischerweise können 5 x 106 bis 2 x 107 Zellen pro Gehirn erhalten werden.
  11. Trennen Sie den Cortex22 mit einer Pinzette in kaltem 1x HBSS vom Gehirn und reißen Sie die Hirnhäute von der Cortex ab.
  12. Übertragen Sie den Kortex in eine neue Petrischale, die kaltes 1x HBSS enthält. Schneiden Sie den Kortex mit chirurgischen Klingen in zwei oder drei Hälften.
  13. Übertragen Sie den Kortex mit 1.000 μl Spitzen in ein 15 mL Zentrifugenröhrchen und entfernen Sie überschüssiges 1x HBSS.
  14. Pro Embryo werden 100 Einheiten Papain und 200 μg Desoxyribonuklease I (DNase I) verdünnt mit 5 ml Papain-Verdünnungslösung (5 mg/ml D-Glucose, 0,2 mg/ml Rinderserumalbumin und 0,2 mg/ml L-Cystein in 1x PBS; siehe Materialtabelle) zugegeben und 15 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubiert. Drehen Sie das Röhrchen während der Inkubation alle 5 Minuten um.
    HINWEIS: Eine Vorinkubation von Papain in Papain verdünnter Lösung wird empfohlen. 5 min in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubieren, dann DNase I zugeben.
  15. Verwerfe die Lösung. Fügen Sie 2 ml 20% hitzeinaktiviertes Pferdeserum (siehe Materialtabelle) in 1x HBSS hinzu. 1 Min. inkubieren.
  16. Verwerfe die Lösung. Spülen Sie das Gewebe zweimal mit 4 mL 1x HBSS aus.
  17. Verwerfe die Lösung. Fügen Sie 0,5 ml Plattierungsmedium pro Embryo hinzu (neurobasales Medium mit 2 % B-27-Supplement, 4 mM Glutamax, 5 % hitzeinaktiviertem Pferdeserum und 1x Penicillin-Streptomycin; siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Während der Schritte 1.14-1.17 ist keine Zentrifugation erforderlich, da die geschnittenen Cortex-Stücke ohne Zentrifugation auf den Boden des Röhrchens sinken. Verwenden Sie keinen Sauger und saugen Sie die Stücke nicht auf.
  18. Resuspendieren Sie sehr vorsichtig mit einer geschnittenen 1.000-μl-Spitze oder einer 10-ml-Pipette 5 bis 10 Mal.
  19. 10 Mal sehr sanft mit einer 1.000 μL Spitze resuspendieren.
  20. Bei 250 × g bei Raumtemperatur (20-25 °C) 3 min zentrifugieren.
  21. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie sehr vorsichtig mit 0,5 mL pro Embryo Plattierungsmedium unter Verwendung einer 1.000-μl-Spitze 10 Mal.
  22. Legen Sie ein 40-μm-Zellsieb auf ein 50-ml-Zentrifugenröhrchen und filtrieren Sie dann die Zellsuspension durch Schwerkraft. Sammeln Sie die gefilterte Zellsuspension im Röhrchen.
  23. Die Zellen und die Platte werden bei 2 × 104 bis 5 × 104 Zellen/cm2 mit einem entsprechenden Volumen des Beschichtungsmediums in die Kammern gezählt. Ein Beispiel für die Dichte ist in der ergänzenden Abbildung 1 dargestellt.
  24. Bei Tag-in-vitro (Div.) 2 wird die Hälfte des Mediums durch Kulturmedium ersetzt (neurobasales Medium mit 2 % B-27-Supplement, 4 mM Glutamax und 1x Penicillin-Streptomycin) und 5 μM 5-Fluor-2-desoxyuridin hinzugefügt (siehe Materialtabelle).
  25. Ersetzen Sie nach Div. 4 alle 2 bis 3 Tage die Hälfte des Mediums durch Kulturmedium.

2. Transfektion von Plasmiden in primär kultivierte Neuronen mit der Calciumphosphat-Methode

HINWEIS: Die genannten Volumina gelten für eine 0,8 cmgroße 2-Well-Kammer in einer 8-Well-Glasbodenkammer (siehe Materialtabelle).

  1. Bereiten Sie 50 μl DNA/CaCl2-Lösung her, indem Sie 200 ng mit 2 μg eines Plasmids (APP-EGFP in pCAGGS, Alcα-EGFP in pcDNA3.118 oder Alcβ-EGFP in pcDNA3.1; siehe Ergänzende Tabelle 1) mischen, das für ein fluoreszenzmarkiertes Protein, 6,2 μl 2 M CaCl2 und sterilisiertes Wasser kodiert.
  2. Aliquotieren Sie 50 μl 2x HEPES-gepufferte Kochsalzlösung (HBS) in neue Zentrifugenröhrchen.
  3. 6,2 μl DNA/CaCl2-Lösung zu 2x HBS-Lösung hinzufügen. Vorsichtig mischen, indem Sie 10 Mal pipettieren.
  4. Schritt 2.3 wiederholen, bis die gesamte DNA/CaCl2-Lösung übertragen wurde.
  5. 15 min bei Raumtemperatur inkubieren.
  6. Sammeln Sie das Nährmedium in der Glasbodenkammer und ersetzen Sie es durch frisches Kulturmedium ohne Antibiotika.
    HINWEIS: Bewahren Sie das gesammelte Medium bis Schritt 2.10 im Zellkultur-Inkubator auf.
  7. Geben Sie 50 μl des DNA/CaCl2/HBS-Gemisches pro Vertiefung tropfenweise zu den Neuronen. Kultur für 1 h.
  8. Während der Inkubation wird das angesäuerte Medium hergestellt, indem eine Petrischale, die DMEM (modifiziertes Eagle-Medium von Dulbecco)/F-12 von Ham enthält, in einen 10%igen CO2 -Inkubator bei 37 °C gegeben wird.
  9. Nach einer 1-stündigen Inkubation nach der Transfektion spülen Sie die primären Neuronen 3 Mal mit DMEM/Ham's F-12 (angesäuertes Medium).
  10. Ersetzen Sie das Medium durch eine Mischung aus halb gesammelten Medien und halb frischen Nährmedien. Kultur bis zur mikroskopischen Betrachtung bei 37 °C und 5 % CO2.

3. Beobachtung des axonalen Transports

  1. Die mit einer TIRF-Mikroskopie (Total Internal Reflectance) ausgestattete Kammer (siehe Materialtabelle) bei 37 °C vorinkubieren.
  2. Wenn der CO2 -Controller ausgerüstet ist, kann das Nährmedium als Beobachtungsmedium unter 5 % CO2 verwendet werden. Wenn es nicht ausgerüstet ist, ersetzen Sie das Medium durch ein pH-stabiles Medium, wie z. B. Leibovitz L-15 (siehe Materialtabelle), das mit 4 mM Glutamax und 2 % B-27-Zusatz geliefert wird.
  3. Finde eine transfizierte Zelle und identifiziere dann ein Axon. Vergrößern Sie den Einfallswinkel des Lasers, bis der Laser vollständig reflektiert ist. Verringern Sie dann den Winkel, bis alle Vesikel im Axon sichtbar sind (Pseudo-TIRF). Erfassen Sie Bilder mit einer Belichtungszeit von 200 ms für 150 Bilder (30 s).
    HINWEIS: In diesem Experiment wurde die PSEUD-TIRF-Beleuchtung verwendet, um alle Axonvesikel zu erfassen. Es können auch andere Mikroskope verwendet werden, die mit Hochgeschwindigkeits-Erfassungssystemen ausgestattet sind.
    HINWEIS: Notieren Sie die Richtung des Axons jedes Mal im Dateinamen. Der Bereich des anfänglichen Axonsegments oder des terminalen Axonbereichs wurde bei der Beobachtung vermieden.

4. Bildverarbeitung

  1. Öffnen Sie die aufgenommenen Bilder mit der MetaMorph-Software (siehe Materialtabelle).
  2. Öffnen Sie die Symbolleiste > Entfernung messen > kalibrieren. Aktivieren Sie "Auf alle geöffneten Bilder anwenden" und geben Sie den tatsächlichen Abstand eines Pixels ein.
  3. Öffnen Sie die Symbolleiste > Anzeigen > Drehen. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen für "alle Ebenen". Drehen Sie sich so, dass das Axon horizontal und die Richtung zum Axonterminal nach rechts zeigt.
  4. Öffnen Sie die Symbolleiste > Regionen > Regionen erstellen. Legen Sie die Größe des Bereichs für den Ausschnitt fest und klicken Sie auf Erstellen. Platzieren Sie den Rahmen, der auf dem Bild angezeigt wird, auf dem Axonbereich, der analysiert werden soll. Speichern Sie die generierte Bildsequenz als Stack-Datei.
    HINWEIS: Wählen Sie Bereiche aus, die keine unfokussierten Axone oder Ablagerungen enthalten.
  5. Öffnen Sie die Symbolleiste > > Grafiken anzeigen. Wählen Sie Kalibrierungsbalken aus, um den Maßstabsbalken zu stempeln. Wählen Sie Daten/Zeit , um den Bildern einen Zeitstempel hinzuzufügen. Aktivieren Sie "alle Ebenen". Verschieben Sie die Objekte an die entsprechende Stelle und klicken Sie auf Stempel.
  6. Öffnen Sie die Symbolleiste > Stapeln > Film erstellen. Geben Sie die entsprechende Bildrate ein und wählen Sie AVI aus. Speichern Sie sie als neue Datei.

5. Zeichnen eines Kymographen und Aufspüren von Spuren mit KYMOMAKER

  1. Laden Sie KYMOMAKER herunter (siehe Materialtabelle) und öffnen Sie "Kymoanalysis.exe" im KYMOMAKER-Ordner.
  2. Öffnen Sie "kymoAnalysis.exe", um die Hauptfenster anzuzeigen (Abbildung 1A). Wählen Sie Datei > Laden und öffnen Sie den erstellten AVI-Film. Es erscheint ein "Vorschau"-Fenster (Abbildung 1B).
  3. Geben Sie auf der Registerkarte "Kymograph generieren" > Abschnitt "Trimmen" die Pixelnummern für das Trimmen ein. Das Trimmen wird sofort im "Vorschau"-Fenster angezeigt, um eine einfache Anpassung zu ermöglichen (Abbildung 1C). Vergewissern Sie sich, dass die gesamte Maßstabsleiste und der Zeitstempel entfernt wurden.
  4. Klicken Sie auf die Schaltfläche Generieren , um den Kymographen zu generieren (Abbildung 1C). KYMOMAKER erkennt das hellste Pixel innerhalb jeder Y-Achse im Fenster "Vorschau". Speichern Sie den Kymographen über Datei > Speichern Sie > normalen Kymographen.
  5. Um die Spuren mit geringer Intensität im Kymographen zu erkennen, klicken Sie auf Rotations-Kymograph. Passen Sie die Zahl im Abschnitt "Rotationskymograph" an und sehen Sie sich das Ergebnis an, indem Sie auf den Rotationskymographen klicken (Abbildung 1D).
    HINWEIS: "Rotation (Grad)" ist das Gradintervall für den Rotationswassereinzugsgebietsalgorithmus21. 10° bedeutet beispielsweise, dass der Watershed-Algorithmus alle 10° 36 Mal ausgeführt wird und die Ergebnisse dann im Fenster "Rotational Watershed" kombiniert werden.
  6. Um die anterograden und retrograden Spuren im Kymographen zu erkennen, wählen Sie auf der Registerkarte Erkennung > Abschnitt Ziel die Option Original aus, wenn der Rotationskymograph nicht generiert wurde. Stellen Sie sicher, dass durch Auswahl von Rotation das erstellte Rotationsabflussgebiet zum Erkennen von Spuren verwendet wird. Wählen Sie Watershed unter "Erkennungsmethode" aus. Klicken Sie auf die Schaltfläche Erkennen , um Ablaufverfolgungen automatisch zu erkennen.
    HINWEIS: Erkannte Spuren werden im Fenster "Arbeiten" gezeichnet. Wenn Sie "Maskierung" aktivieren, werden Spuren auf dem ursprünglichen Kymographen gezeichnet.
  7. Erkennen Sie die anterograden und retrograden Spuren, indem Sie eine Zahl in den Abschnitt Erkennung > Filterung > Geschwindigkeit eingeben (Abbildung 1E, F). Erkennen Sie anterograde Spuren durch Eingabe von 0,4 bis 7,0 μm/s. Erkennen Sie retrograde Kurven durch Eingabe von -0,4 bis -7,0 μm/s.
    HINWEIS: Die Einstellung für die niedrigste Geschwindigkeit hängt von der Definition eines unbeweglichen Zustands der Vesikel ab. Siehe Schritt 6.7.
  8. Speichern Sie die Dateien.

6. Bestimmung der Geschwindigkeit

  1. Öffnen Sie die MetaMorph-Software.
    HINWEIS: Das Plugin "manuelles Tracking" in ImageJ kann die Geschwindigkeiten auch auf die gleiche Weise berechnen.
  2. Öffnen Sie die in Schritt 4.4 erstellte Datei. Stellen Sie sicher, dass die Kalibrierung an die Bilder angepasst ist.
  3. Öffnen Sie die Symbolleiste > Apps > Punkte verfolgen. Klicken Sie auf Track hinzufügen. Finden Sie ein bewegliches Vesikel, das anterograd oder retrograd transportiert wurde. Verfolgen Sie dann das Vesikel, indem Sie klicken, bis der Transport beendet ist. Klicken Sie auf Fertig.
  4. Wiederholen Sie Schritt 6.3, bis alle Vesikel verfolgt wurden.
  5. Klicken Sie auf Protokoll öffnen , um eine CSV-Datei zu öffnen. Klicken Sie dann auf Protokolldatei , um die Daten in der CSV-Datei anzuzeigen.
  6. Speichern Sie die CSV-Datei.
  7. Um die segmentierte Geschwindigkeit zu berechnen, die von der Pause nicht beeinflusst wird, entfernen Sie die berechneten Geschwindigkeiten von 0,37 μm/s oder darunter in der Spalte "Geschwindigkeit".
    HINWEIS: Vesikel können sich durch anomale Diffusion sehr kurz bewegen und werden von Motorproteinennicht verarbeitet 23. Um zu vermeiden, dass diese Bewegungen aus der Berechnung der motorbetriebenen Geschwindigkeiten einbezogen werden, wird die niedrigste Geschwindigkeit (1 Pixel/200 ms) in diesem Protokoll aus der Berechnung entfernt.
  8. Berechnen Sie die segmentierte durchschnittliche Geschwindigkeit alle fünf Frames (insgesamt 1 s). Verwerfen Sie den letzten Teil der Geschwindigkeit, wenn weniger als fünf Frames übrig sind.
  9. Kombinieren Sie alle durchschnittlichen Geschwindigkeiten aus einer Bedingung. Generieren Sie Histogramme, um die Verteilung der Geschwindigkeiten zu visualisieren.

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Ergebnisse

Primäre kultivierte Neuronen aus dem E15.5-Mauskortex wurden wie beschrieben in einer Glasbodenschale kultiviert. Als Beispiel wurden APP-EGFP, Alcα-EGFP oder Alcβ-EGFP in den primären kortikalen Neuronen exprimiert. Es ist bekannt, dass APP und Alcα im Axon durch Kinesin-1transportiert werden 2,17. APP assoziiert mit Kinesin-1 über das Adapterprotein JIP1 (JNK-interagierendes Protein 1), während Alcα direkt über seine doppelten W-sauren Motive ...

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Diskussion

Es wird eine Analysemethode für den axonalen Transport beschrieben, die die Berechnung der segmentierten Geschwindigkeit und die Erstellung von Kymographen umfasst. Ein kritischer Schritt während des Transfektionsschritts ist die Erhaltung der Gesundheit der kultivierten Neuronen. Die von Jiang und Chen beschriebene Transfektionsmethode29 wurde mit geringfügigen Modifikationen befolgt. Das schonende Mischen der DNA/CaCl2-Lösung und 2x HBS erhöhte die Ef...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde unterstützt von KAKENHI (22K15270, Grant-in-Aid for Young Scientists) und der Akiyama Life Science Foundation for YS. Wir möchten uns bei Dr. Masataka Kinjo und Dr. Akira Kitamura, Laboratory of Molecular Cell Dynamics, Faculty of Advanced Life Science, Hokkaido University, für ihren kritischen Input und ihre Expertise bedanken, die die Forschung sehr unterstützt haben. Die Beobachtung mit der TIRF-Mikroskopie wurde mit dem Instrument durchgeführt, das am Labor für Molekulare Zelldynamik der Fakultät für fortgeschrittene Lebenswissenschaften der Universität Hokkaido installiert ist. Das Instrument ist im Open Facility System registriert, das vom Global Facility Center, Creative Research Institution, Hokkaido University (AP-100138) verwaltet wird. Wir danken Dr. Seiichi Uchida, Human Interface Laboratory, Department of Advanced Information Technology, Faculty of Information Sciences and Electrical Engineering, Kyushu University, Fukuoka Japan, für die Montage mit der Anwendung Kymomaker. Das Advanced Prevention and Research Laboratory for Dementia, Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Hokkaido University, wird unterstützt von Japan Medical Leaf Co., Ltd.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
5-Fluor-2-desoxyuridinSigma-AldrichF0503
Apo TIRF 100x/1.49 OILNikon
B-27 Supplement (50x), serumfreiThermo fischer scientific17504044
Rinderserum AlbuminWako013-25773
CalPhos Säugetier-TransfektionskitTakara631312
Sieb für Zellen  40 & Mikro; m NylonFalcon352340
CoolSNAP HQPhotometrics
Desoxyribonuklease ISigma-AldrichDN-25
D-GlucoseWako041-00595
DMEM/Ham' s F-12Wako042-30555
Dumont Nr. 7 PinzetteDumont Nr. 7
Chirurgische Klinge für Federn FederNr.11
Federgriff für chirurgische Klinge FederNr. 3
GentamicinWako079-02973
Gentamicin SulfateWako075-04913
GlutaMAX SupplementThermo fischer scientific35050061
HEPESDOJINDO342-01375
Pferdeserum, hitzeinaktiviertThermo fischer scientific26050088
KClWako163-03545
KH2PO4Wako169-04245
KYMOMAKERhttp://www.pharm.hokudai.ac.jp/shinkei/Kymomaker.html
L-15 Medium (Leibovitz)Sigma-AldrichL5520
MetaMorph Version 6.2r1 Metamorph
Na2HPO4Wako197-02865
NaClWako197-01667
NaHCO3Wako191-01305
Neurobasal MediumThermo fischer scientific21103049
Nikon ECLIPSE TE 2000-ENikon
Thermofischer scientific155411
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml)Thermo Fisher Scientific15140122
Poly-L-LysinhydrobromidSigma-AldrichP2636-500MG
Trizma baseMerckT1194-10PAKmit Wasser gelöst, um 0,1 M Tris-HCl (pH.8,5) herzustellen
Papain Worthington LS003126

Referenzen

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