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Das Facettenauge der Fliege ist ein wichtiges biologisches Modellsystem zur Aufklärung grundlegender biologischer Mechanismen. Zu den Mechanismen, die mit diesem System untersucht wurden, gehören die folgenden: Facettensehen mit einem nahezu panoramischen Sichtfeld1; die Biophysik, Proteinassemblierung und Biogenese des lichtempfindlichen G-Protein-gekoppelten Rezeptors 2,3,4; das Phospholipase Cβ-vermittelte Signaltransduktionssystem 5,6; Aktivierung und Modulation des TRP-Kanals im nativen Gewebe 5,6; die Assemblierung und Funktion des Multiprotein-Signalkomplexes 7,8; die molekulare Struktur, Biochemie und Funktion des Inositol-Phospholipid-Recyclings 9,10; und die signalvermittelte subzelluläre Translokation von Signalproteinen11,12. Die einzigartige anatomische Struktur und Optik des Fliegenfacettenauges wurde ausgiebig untersucht und enthüllt grundlegende Entwicklungsmechanismen und Sehfähigkeiten.
Diese Methodensammlung umfasst die Arbeit führender Wissenschaftler, die Methoden zur Untersuchung einiger der oben genannten Mechanismen im Fliegenfacettenauge entwickelt und verfeinert haben. Muñoz et al. beschreiben ein Verfahren zur quantitativen Analyse der optischen Anordnung des Fliegenauges, das eine genaue Darstellung des Facettenauges und seiner räumlichen Organisation ermöglicht13. Diese Methode ist unerlässlich, um die neuronale Verarbeitung visueller Informationen im Detail zu untersuchen. Wichtig ist, dass es viele Versuche gab, bioinspirierte künstliche Augen herzustellen, und diese stützten sich auf quantitative Studien bestehender Facettenaugen. Wagner et al. nutzen die tiefe Pseudopupille, ein einzigartiges optisches Phänomen des Facettenauges, und die Hochamplifikationsmikroskopie mit der optischen Neutralisation der Hornhaut, um eGFP-markierte Proteine in Drosophila-Photorezeptorzellen zu lokalisieren14. Diese Methode ermöglicht die Detektion von strukturellen Defekten in den Rhabdomen, die auf die Degeneration der Photorezeptoren und die zelluläre Lokalisation und den Transport wichtiger Signalproteine zurückzuführen sind. Gutorov et al. verwenden elektrophysiologische Messungen des gesamten Auges oder einzelner Photorezeptorzellen, um das Niveau der Photopigmentzustände in vivo und deren Modulation durch spezifische Mutationen in Signalproteinen zu messen15. Diese Methode nutzt die durch die Absorption von Photonen induzierten Ladungsverschiebungen innerhalb eines visuellen Pigmentzustands (R) aus, was zur Bildung eines zweiten Pigmentzustands führt, der im Dunkeln stabil ist (M). Eine zusätzliche Methode nutzt die verlängerte Depolarisation nach dem Ausschalten des Lichts (PDA), die die dunklen bistabilen Eigenschaften des Sehpigments und die Unterschiede in den Absorptionsspektren der R- und M-Zustände der Fliege ausnutzt. Da die PDA von der Umwandlung einer großen Menge an Photopigment abhängt, kann bereits der kleinste Defekt in der Biogenese des Photopigments zu einer leicht nachweisbaren abnormalen PDA führen. Tatsächlich haben Drosophila-Mutanten , die abnormale PDA aufweisen, zur Entdeckung neuer Signalproteine geführt. Ein herausragendes Beispiel dafür ist die Entdeckung des neuartigen Proteinkomplexes, der sich aus der Gerüstproteininaktivierung but no afterpotential D (INAD), der augenspezifischen Proteinkinase C (eyePKC), der Phospholipase Cβ (PLCβ) und dem Transient Receptor Potential (TRP)-Kanal zusammensetzt. Zum ersten Mal stellen Liu et al. eine Technik zur Reinigung des Drosophila TRP-Kanals16 vor. Diese modifizierte Affinitätsreinigungsmethode nutzt eine Konkurrenzstrategie, die auf dem Assemblierungsmechanismus des INAD-Signalkomplexes basiert. Diese Strategie ermöglicht die Reinigung des endogenen TRP-Kanals. Nach dieser Methode wird zunächst ein an Ni-Kügelchen gebundenes PLCβ-Fragment mit Histidin markiert und verwendet, um den endogenen INAD-Proteinkomplex abzubauen, der aus Drosophila-Kopfhomogenaten gewonnen wird. Als nächstes werden TRP-Fragmente, die mit übermäßig gereinigter Glutathion-S-Transferase (GST) markiert sind, zu den Ni-Kügelchen hinzugefügt, um mit dem endogenen TRP-Kanal zu konkurrieren, der an das INAD gebunden ist. Schließlich wird die Größenausschlusschromatographie verwendet, um die markierten TRP-Kanalfragmente im Überstand vom endogenen TRP-Kanal zu trennen. Panda et al. berichten über eine empfindliche Technik zur Identifizierung und Quantifizierung mehrerer Klassen von Lipiden in Drosophila-Photorezeptorzellen mittels Massenspektrometrie17. Die Aktivierung von PLCβ ist entscheidend für die Phototransduktion, da dies zur Hydrolyse von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat (PI(4,5)P2) in der Oberflächenmembran führt. Diese Reaktion führt schließlich zur Aktivierung des TRP-Kanals. Darüber hinaus führt die PLCβ-Aktivität zur Bildung vieler Lipidspezies. Es wurde vorgeschlagen, dass mehrere dieser Lipidspezies an der TRP-Aktivierung beteiligt sein und eine Schlüsselrolle bei der funktionellen Organisation von Photorezeptoren zur Optimierung der sensorischen Transduktion spielen. In der Studie von Panda et al.17 wurden diese Ergebnisse durch die Isolierung von Drosophila-Mutanten bewertet, die defekte Enzyme beherbergen, die den Spiegel bestimmter Lipide steuern.
Das Fliegenfacettenauge ist ein nützliches experimentelles System, um grundlegende Mechanismen in der Biologie aufzuklären. Die leistungsstarke genetische Methodik, die in Drosophila entwickelt wurde, kann verwendet werden, um die Signalproteine zu analysieren und zu entdecken, die an der Phototransduktion von Fliegen beteiligt sind. Diese Methodensammlung beschreibt im Detail die wichtigsten Techniken zur Untersuchung der grundlegenden Mechanismen des Fliegensehens, einschließlich der anatomischen und optischen Analyse des Facettenauges und der molekularen Komponenten und biochemischen Reaktionen der Photorezeptorzellen. Die Videoartikel enthalten auch wichtige Ratschläge zu den inhärenten Schwierigkeiten dieser Methoden. Diese Methodensammlung sollte auch für Wissenschaftler außerhalb dieses Forschungsbereichs von Vorteil sein, da diese Techniken an andere biologische Präparate angepasst werden könnten.