Methodenartikel

Adipozyten-spezifischer ATAC-Seq mit Fettgewebe mittels fluoreszenzaktivierter Zellkernsortierung

DOI:

10.3791/65033

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17. März 2023

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, Indiana University School of Medicine

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Wir präsentieren ein Protokoll für den Assay von Transposase-zugänglichem Chromatin mit Hochdurchsatz-Sequenzierung (ATAC-seq) speziell an Adipozyten mittels Zellkernsortierung mit Fettgewebe, das aus transgenen Reportermäusen mit nukleärer Fluoreszenzmarkierung isoliert wurde.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Hochdurchsatzsequenzierung (ATAC-seq) ist eine robuste Technik, die eine genomweite Profilierung der Chromatinzugänglichkeit ermöglicht. Diese Technik hat sich als nützlich erwiesen, um die regulatorischen Mechanismen der Genexpression in einer Reihe von biologischen Prozessen zu verstehen. Obwohl ATAC-seq für verschiedene Arten von Proben modifiziert wurde, gab es keine wirksamen Modifikationen der ATAC-seq-Methoden für Fettgewebe. Zu den Herausforderungen bei Fettgeweben gehören die komplexe zelluläre Heterogenität, der hohe Lipidgehalt und die hohe mitochondriale Kontamination. Um diese Probleme zu überwinden, haben wir ein Protokoll entwickelt, das eine Adipozyten-spezifische ATAC-seq ermöglicht, indem wir fluoreszenzaktivierte Zellkernsortierung mit Fettgewebe aus der transgenen Reporter-Nukle-Markierung und der Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP)-Maus verwenden. Dieses Protokoll erzeugt qualitativ hochwertige Daten mit minimaler Verschwendung von Sequenzierungslesevorgängen und reduziert gleichzeitig die Menge an Nukleus-Input und Reagenzien. Dieser Artikel enthält detaillierte Schritt-für-Schritt-Anleitungen für die ATAC-seq-Methode, die für die Verwendung von Adipozytenkernen validiert ist, die aus dem Fettgewebe der Maus isoliert wurden. Dieses Protokoll wird bei der Untersuchung der Chromatindynamik in Adipozyten bei verschiedenen biologischen Stimulationen helfen, was neue biologische Erkenntnisse ermöglicht.

Einleitung

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Das Fettgewebe, das darauf spezialisiert ist, überschüssige Energie in Form von Lipidmolekülen zu speichern, ist ein Schlüsselorgan für die Stoffwechselregulation. Die strikte Kontrolle der Adipozytenbildung und -erhaltung ist für die Funktion des Fettgewebes und die Energiehomöostase des gesamten Körpers von entscheidender Bedeutung1. Viele transkriptionelle Regulatoren spielen eine entscheidende Rolle bei der Kontrolle der Differenzierung, Plastizität und Funktion von Adipozyten. Einige dieser Regulatoren sind an Stoffwechselstörungen beim Menschen beteiligt 2,3. Jüngste Fortschritte bei Hochdurchsatz-Sequenzierungstechniken für die Genexpression und epigenomische Analyse haben die Entdeckung der molekularen Regulatoren der Adipozytenbiologie weiter erleichtert4. Molekulare Profiling-Studien mit Fettgewebe sind aufgrund der Heterogenität dieser Gewebe schwierig durchzuführen. Fettgewebe besteht hauptsächlich aus Adipozyten, die für die Fettspeicherung verantwortlich sind, enthält aber auch verschiedene andere Zelltypen wie Fibroblasten, Endothelzellen und Immunzellen5. Darüber hinaus wird die zelluläre Zusammensetzung des Fettgewebes als Reaktion auf pathophysiologische Veränderungen wie Temperatur und Ernährungszustand dramatisch verändert6. Um diese Probleme zu lösen, haben wir zuvor eine transgene Reportermaus mit dem Namen Nuclear Tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP) entwickelt, die GFP-markierte Ribosomen und mCherry-markierte biotinylierte Zellkerne in einer Cre-Rekombinase-abhängigen Weise produziert7. Das Dual-Labeling-System ermöglicht die zelltypspezifische Transkriptom- und Epigenomanalyse mit Geweben. Unter Verwendung von NuTRAP-Mäusen, die mit adipozytenspezifischen Adiponectin-Cre-Linien (Adipoq-NuTRAP) gekreuzt wurden, haben wir zuvor Genexpressionsprofile und Chromatinzustände aus reinen Adipozytenpopulationen in vivo charakterisiert und bestimmt, wie sie während der Adipositas verändert werden 7,8. Zuvor konnten wir mit NuTRAP-Mäusen, die mit braunen und beigen Adipozyten-spezifischen Ucp1-Cre-Linien (Ucp1-NuTRAP) gekreuzt wurden, den epigenomischen Umbau der seltenen thermogenen Adipozytenpopulation, der beigen Adipozyten, als Reaktion auf Temperaturänderungen charakterisieren9.

ATAC-seq ist eine weit verbreitete analytische Methode zur Beurteilung der genomweiten Zugänglichkeit von Chromatinen. Die hyperreaktive Tn5-Transposase, die in ATAC-seq verwendet wird, ermöglicht die Identifizierung offener Chromatinregionen durch Markierung von Sequenzierungsadaptern im Chromatin-zugänglichen Bereich von Zellkernen10. ATAC-seq ist eine einfache Methode, liefert jedoch robuste Ergebnisse und ist auch bei Proben mit geringem Input hocheffizient. Es hat sich damit zu einer der beliebtesten epigenomischen Profiling-Methoden entwickelt und zum Verständnis der regulatorischen Mechanismen der Genexpression in verschiedenen biologischen Kontexten beigetragen. Seit der Erstellung des ursprünglichen ATAC-seq-Protokolls wurden verschiedene von ATAC-seq abgeleitete Techniken weiterentwickelt, um das Protokoll für verschiedene Arten von Proben zu modifizieren und zu optimieren. Zum Beispiel ist Fast-ATAC für die Analyse von Blutzellproben11 konzipiert, Omni-ATAC ist ein optimiertes Protokoll für gefrorene Gewebeproben12 und MiniATAC-seq ist wirksam für die Analyse von Embryonen im Frühstadium13. Die Anwendung der ATAC-seq-Methode auf Adipozyten, insbesondere aus Gewebeproben, ist jedoch immer noch eine Herausforderung. Neben der Heterogenität des Fettgewebes kann sein hoher Lipidgehalt effiziente Rekombinationsreaktionen durch die Tn5-Transposase auch nach der Zellkernisolierung beeinträchtigen. Darüber hinaus führt der hohe mitochondriale Gehalt in Adipozyten, insbesondere in braunen und beigen Adipozyten, zu einer hohen mitochondrialen DNA-Kontamination und zu verschwendeten Sequenzierwerten. In dieser Arbeit wird ein Protokoll für Adipozyten-spezifisches ATAC-seq unter Verwendung von Adipoq-NuTRAP-Mäusen beschrieben (Abbildung 1). Durch die Nutzung der fluoreszenzmarkierten Kernsortierung ermöglicht dieses Protokoll die Sammlung reiner Populationen von Adipozytenkernen fern von anderen störenden Zelltypen und die effiziente Entfernung von Lipiden, Mitochondrien und Gewebetrümmern. Daher kann dieses Protokoll zelltypspezifische, qualitativ hochwertige Daten generieren und die Verschwendung von mitochondrialen Reads minimieren, während im Vergleich zum Standardprotokoll eine geringere Menge an Input und Reagenzien verwendet wird.

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Protokoll

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Tierpflege und Tierversuche wurden nach Verfahren durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der Indiana University School of Medicine genehmigt wurden.

1. Vorbereitungen vor Beginn des Experiments

  1. Gewebevorbereitung
    1. Für die Markierung des Adipozytenkerns kreuzen Sie NuTRAP-Mäuse mit Adipozyten-spezifischen Adiponectin-Cre-Linien (Adipoq-Cre), um Adipoq-NuTRAP-Mäuse zu erzeugen, die sowohl für Adipoq-Cre als auch für NuTRAP hemizygot sind.
    2. Das interessierende Fettgewebe der Adipoq-NuTRAP-Mäuse wird wie zuvor beschrieben14 präpariert.
    3. Frieren Sie das Gewebe in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie es bis zur Verwendung bei −80 °C.
      Anmerkungen: Jedes Fettpolster kann als Ganzes aufbewahrt werden, und das gefrorene Gewebe kann später für Experimente auf Trockeneis in kleinere Stücke (~50 mg) geschnitten werden. Alternativ kann das Fettgewebe geschnitten, aliquotiert und zur Lagerung in Röhrchen eingefroren werden (~50 mg pro Röhrchen). Gefrorene Proben dürfen nach dem Einfrieren bis zur Verwendung niemals aufgetaut werden.
  2. Vorbereitung des Puffers
    Anmerkungen: Halten Sie die Puffer während des gesamten Experiments auf Eis.
    1. Präparationspuffer (NPB): 250 mM Saccharose, 10 mM HEPES (pH 7,5), 10 mM KCl, 1,5 mMMgCl2 und 0,1 % NP40. Bereiten Sie 7 ml NPB pro Probe vor. Fügen Sie dem NPB vor Gebrauch frischen 100-fachen Proteasehemmer-Cocktail (letzte 1x), DTT (letzte 1 mM) und Hoechst (letzte 1 μg/ml) hinzu.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, frische NPB zuzubereiten, aber es kann bis zu 1 Monat bei 4 °C gelagert werden.
    2. 1x phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit 0,1% NP-40 (PBS-N) herstellen.

2. Isolierung des Zellkerns

  1. Dounce-Homogenisatoren aus Glas mit einem Glas Dounce pro Probe auf Eis kühlen. Geben Sie dann 7 ml der NPB-Mischung in jedes Glas Dounce.
    HINWEIS: Es wird empfohlen, in jedem Experiment bis zu acht Proben zu verwenden. Die Arbeit mit mehr als acht Proben würde alle Schritte erheblich verzögern und insbesondere die Qualität des Zellkerns während der Sortierung verschlechtern.
  2. Geben Sie das gefrorene Fettgewebe (50-100 mg) in das Glas Decounce und schneiden Sie es sofort mit einer langen Schere in einige kleinere Stücke. Schlagen Sie 10x mit einem losen Stößel für alle Proben und dann 10x mit einem festen Stößel.
    Anmerkungen: Fettgewebe ist weich, daher sollte es ausreichen, es in ein paar kleine Stücke zu schneiden. Für seltene Proben können kleinere Stücke (10-20 mg) verwendet werden, obwohl die Anzahl der gesammelten Adipozytenkerne variieren kann.
  3. Filtern Sie durch ein 100-μm-Sieb in ein neues 50-ml-Röhrchen. Füllen Sie die filtrierten Homogenate durch Gießen in ein neues 15-ml-Röhrchen. Bei 200 × g für 10 min bei 4 °C in einer Schwenkbecherzentrifuge schleudern. Entfernen Sie den Überstand so weit wie möglich.
    Anmerkungen: Saugen Sie zuerst mit einem Vakuum ab und entfernen Sie dann das restliche Volumen mit einer Mikropipette.
  4. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 μl PBS-N durch sanftes, aber gründliches Klopfen mit den Fingern.
    Anmerkungen: Vermeiden Sie das Pipettieren, da dies die Kerne beschädigen kann.
  5. Durch ein 40-μm-Sieb durch sanftes Pipettieren in ein neues 50-ml-Röhrchen filtrieren. Spülen Sie das Sieb mit 250 μl PBS-N. Die filtrierte Kernresuspension wird mit einer Mikropipette in ein fluoreszenzaktiviertes Zellsortierröhrchen (FACS) überführt.
    HINWEIS: Falls verfügbar, können Röhrchen und Zellsiebe für kleinere Volumina verwendet werden, um Probenverluste zu minimieren.

3. Nukleus-Sortierung

  1. Vorbereitung des Sammelröhrchens
    1. Geben Sie 500 μl PBS-N in neue 1,5-ml-Röhrchen und drehen Sie sie einige Male um, um alle Innenflächen mit dem Puffer zu benetzen.
    2. Drehen Sie die Röhrchen kurz, um die gesamte Flüssigkeit herunterzubringen, und kühlen Sie sie dann auf Eis, bis sie sortiert sind.
  2. FACS (Abbildung 2)
    1. Verwenden Sie den Anschnitt FSC-A/FSC-H für Einzelstücke und FSC-A/SSC-A für die Entfernung von kleinem oder großem Schmutz.
    2. Gate für die mCherry/GFP-positive Adipozyten-Kernpopulation.
    3. Sammeln Sie 10.000 Kerne in jedem der in Schritt 3.1 vorbereiteten Sammelröhrchen.
  3. Präparation des Zellkerns nach der Sortierung
    1. Geben Sie 500 μl PBS-N in jedes Sammelröhrchen und drehen Sie es einige Male um, um es zu mischen.
    2. Schleudern Sie die Sammelröhrchen bei 200 × g für 10 min bei 4 °C in einer Schwenkbecherzentrifuge. Entfernen Sie den Überstand vollständig.
      Anmerkungen: Verwenden Sie zuerst einen Staubsauger, um Blasen zu entfernen, gießen Sie den Überstand ab und verwenden Sie Papiertücher, um die restliche Flüssigkeit vollständig zu entfernen. Das Pellet ist an dieser Stelle unsichtbar. Bereiten Sie die Tn5-Mastermischung während des Zentrifugationsschritts wie unten beschrieben vor.

4. Tn5-Tagmentation (Tabelle 1)

  1. Um 25 μl Tn5-Mastermischung herzustellen, mischen Sie 12,5 μl 2x Tagmentations-DNA-Puffer (TD-Puffer), 1,25 μl Tn5-Transposase (TDE I-Enzym) und 11,25 μl nukleasefreies Wasser.
  2. Fügen Sie jedem Zellkernpellet 25 μl Tn5-Mastermischung hinzu und resuspendieren Sie es durch vorsichtiges Pipettieren. Bei 600 U/min für 30 min bei 37 °C mit einem Thermomischer inkubieren.

5. DNA-Aufreinigung

HINWEIS: Für das folgende Verfahren wird das in der Materialtabelle erwähnte PCR-Aufreinigungskit verwendet. Alle anderen ähnlichen DNA-Aufreinigungsmethoden können verwendet werden.

  1. 25 μl nukleasefreies Wasser werden zu den 25 μl der nach Schritt 4.2 erhaltenen Mischung der Tn5-Kernresuspension hinzugefügt. Das Endvolumen beträgt 50 μl pro Probe.
  2. Fügen Sie 250 μl Puffer PB hinzu.
  3. Fügen Sie 5 μl 3 M Natriumacetat (NaOAc) (pH 5,2) hinzu.
  4. Übertragen Sie das Gemisch in eine Säule (im Lieferumfang des Referenzkits enthalten) und zentrifugieren Sie es 1 Minute lang bei Raumtemperatur (RT) bei 17.900 × g .
  5. Verwerfen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein. Fügen Sie 750 μl Puffer-PE mit absolutem Ethanol (EtOH) hinzu und zentrifugieren Sie bei 17.900 × g für 1 Minute bei RT.
  6. Entsorgen Sie den Durchfluss und setzen Sie die Schleudersäule wieder in dasselbe Auffangröhrchen ein. Zentrifugieren Sie bei 17.900 × g für 1 min bei RT und entsorgen Sie das Auffangröhrchen mit dem Durchfluss.
  7. Um die DNA-Fragmente zu eluieren, wird die Säule mit einem neuen 1,5-ml-Röhrchen ausgestattet, 10 μl EB-Puffer hinzugefügt und 3 Minuten bei RT belassen. Bei 17.900 × g für 1 min bei RT zentrifugieren.
    HINWEIS: Die Proben können tagelang bei 4 °C oder wochenlang bei −20 °C gelagert werden.

6. PCR-Amplifikation (Tabelle 2)

HINWEIS: Die in dieser Studie verwendeten Primer sind in Tabelle 3 aufgeführt.

  1. Um transponierte DNA-Fragmente zu amplifizieren, bereiten Sie eine PCR-Mastermischung vor, ohne einen einzigartigen Ad2.n-Barcode-Primer (Primer #2) hinzuzufügen. Verwenden Sie 38 μl der PCR-Mastermischung pro Probe: 11 μl nukleasefreies Wasser, 2 μl 25 μM Ad1_noMX Primer (Primer #1) und 25 μl 2x PCR Master Mix.
  2. Geben Sie 38 μl der PCR-Mastermischung in ein 0,2-ml-PCR-Röhrchen.
  3. Fügen Sie 10 μL der eluierten DNA-Fragmente aus Schritt 5.7 hinzu.
  4. Fügen Sie 2 μL des 25 μM Primers #2 hinzu, der für jede Probe spezifisch sein muss.
  5. Führen Sie die PCR gemäß den in Tabelle 2 angegebenen Zyklusbedingungen durch.

7. Quantitativer Echtzeit-PCR-Test (qPCR) (Tabelle 4)

HINWEIS: Dieser Schritt zielt darauf ab, die zusätzlichen Zyklen zu bestimmen, die zur Amplifikation der DNA erforderlich sind. Es ist optional, aber sehr zu empfehlen, insbesondere für neue Experimente.

  1. Bereiten Sie die qPCR-Mastermischung ohne Zugabe von Primer #2 vor. Verwenden Sie 9,975 μl der qPCR-Mastermischung pro Probe: 4,41 μl nukleasefreies Wasser, 0,25 μl 25 μM Primer #1, 5 μl 2x PCR Master Mix und 0,09 μl 100x SYBR Green I.
    Anmerkungen: Um 100x SYBR Green I zuzubereiten, verdünnen Sie die 10.000x Brühe mit nukleasefreiem Wasser. Da das Volumen von 100x SYBR Green I, das für die qPCR-Mastermischung verwendet wird, vernachlässigbar ist, ist es einfacher, eine zusätzliche Mastermischung aus verdünntem 100x SYBR Green I herzustellen (z. B. für 8-10 Proben).
  2. Geben Sie 9,975 μl der qPCR-Mastermischung in jede Vertiefung einer qPCR-Platte.
  3. Geben Sie 0,25 μl 25 μM Primer #2 in jede Vertiefung.
    HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie den gleichen Primer #2 hinzufügen, der mit dem übereinstimmt, was in Schritt 6.4 zu jeder spezifischen Probe hinzugefügt wurde.
  4. 5 μl der PCR-Reaktion, die nach der PCR-Amplifikation in Schritt 6.5 erhalten wurde, werden hinzugefügt und durch Pipettieren gemischt.
    HINWEIS: Die verbleibenden 45 μl der PCR-Reaktion werden für die zweite PCR-Amplifikation verwendet.
  5. Führen Sie die qPCR gemäß den in Tabelle 5 angegebenen Zyklusbedingungen durch.
  6. Überprüfen Sie die Amplifikationskurven und ermitteln Sie die Anzahl der zusätzlich benötigten PCR-Zyklen, indem Sie die Anzahl der Zyklen schätzen, die ~35 % des Maximums erreicht haben (Abbildung 3A).
    HINWEIS: In der Regel sind für 10.000 Zellkerne fünf bis acht zusätzliche PCR-Zyklen erforderlich.

8. Zusätzliche PCR-Amplifikation

  1. Führen Sie die PCR mit allen verbleibenden 45 μl der PCR-Reaktion gemäß den Berechnungen aus Schritt 7.6 (Tabelle 6) durch.
    HINWEIS: Jede Probe kann eine unterschiedliche Anzahl von Amplifikationszyklen erfordern.

9. Zweite DNA-Aufreinigung mit dem PCR-Aufreinigungskit

  1. Verwenden Sie die gleichen Verfahren wie in Abschnitt 5, aber eluieren Sie die amplifizierten DNA-Fragmente mit 20 μl Puffer-EB.

10. Auswahl der Größe des DNA-Fragments

Anmerkungen: Verwenden Sie reversible Festphasen-Immobilisierungsperlen, wie unten beschrieben. Alle anderen ähnlichen DNA-Aufreinigungsperlen können gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet werden. Die SPRI-Wulstsuspension sollte vor der Verwendung bei RT mit Rotation vollständig resuspendiert und ausgeglichen werden.

  1. Übertragen Sie die eluierte DNA in ein neues PCR-Röhrchen und fügen Sie 80 μl Puffer-EB hinzu, um ein Endvolumen von 100 μl zu erhalten.
  2. Fügen Sie 55 μl SPRI-Kügelchen (0,55-faches Probenvolumen) hinzu und mischen Sie durch Pipettieren. 5 min bei RT inkubieren und dann 5 min lang auf einem Mini-Magnetständer für PCR-8-Röhrchenstreifen trennen.
  3. Übertragen Sie 150 μl des Überstands in ein neues PCR-Röhrchen. Fügen Sie 95 μl SPRI-Kügelchen hinzu und mischen Sie sie durch Pipettieren.
    HINWEIS: Der Überstand enthält DNA von ca. 500 bp oder weniger.
  4. Inkubieren Sie 5 Minuten lang bei RT und trennen Sie sich dann 5 Minuten lang auf dem Mini-Magnetständer. Entsorgen Sie den Überstand vorsichtig.
  5. Waschen Sie die Perlen 1 Minute lang mit 200 μl 70% EtOH. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal für insgesamt drei Wäschen.
    Anmerkungen: Bewegen Sie PCR-Röhrchen während des Waschgangs nicht vom Magnetständer.
  6. Schleudern Sie die Röhrchen nach dem letzten Waschgang 1 Minute lang bei 1.000 × g herunter und pipettieren Sie das restliche EtOH aus. Trocknen Sie das Pellet bei geöffnetem Deckel bei 37 °C für 2 min auf einer PCR-Maschine.
    Anmerkungen: Die Perlenpellets sollten nach dem Trocknen nur einige kleinere Risse aufweisen. Vermeiden Sie ein übermäßiges Austrocknen.
  7. Das Pellet wird durch Pipettieren mit 20 μl Puffer EB resuspendiert und 5 Minuten bei RT inkubiert. Trennen Sie es 5 Minuten lang auf dem Mini-Magnetständer und übertragen Sie dann 18 μl des Überstands, der die endgültige Bibliothek enthält, in ein neues 1,5-ml-Röhrchen.
    HINWEIS Die Bibliothek kann während einer Qualitätsprüfung bei −20 °C gelagert werden.

11. DNA-Quantifizierung mit einem Fluorometer

  1. Um die Mastermischung herzustellen, verdünnen Sie 200x dsDNA High Sensitivity (HS) Reagenz mit dsDNA HS Puffer auf eine Endkonzentration von 1x.
  2. Für Standards geben Sie 190 μl der 1x-Mastermischung und 10 μl Standard 1 oder Standard 2 in eine Fluorometerröhre.
    HINWEIS: Gleichen Sie die Standards bei RT im Dunkeln aus, bevor Sie mit der Quantifizierung beginnen.
  3. Für die Bibliotheksproben geben Sie 198 μl der 1x-Mastermischung und 2 μl jeder Probe in ein separates Fluorometerrohr.
    Anmerkungen: Wenn die Probenmengen begrenzt sind, kann das Probenvolumen auf 1 μl reduziert und das 1x-Master-Mischungsvolumen auf 199 μl erhöht werden.
  4. Wirbeln oder schütteln Sie die Fluorometerröhren und lassen Sie sie 5 Minuten lang bei RT im Dunkeln stehen. Messen Sie die DNA-Konzentration mit dem dsDNA HS-Assay des Fluorometers.

12. Qualitätsprüfung der Bibliothek durch hochempfindliche Elektrophoresesysteme

  1. Nehmen Sie die ATAC-seq-Bibliothek und verdünnen Sie sie mit nukleasefreiem Wasser bis zu einer Endkonzentration von 1-5 ng/μl.
  2. Analysieren Sie die Größenverteilung der ATAC-seq-Bibliotheken mit hochempfindlichen, automatisierten Elektrophoresesystemen gemäß den Protokollen des Herstellers.

13. Qualitätsprüfung der ATAC-seq-Bibliothek mittels gezielter qPCR

  1. Nehmen Sie 5-10 ng der ATAC-seq-Bibliothek und verdünnen Sie sie mit 50 μl nukleasefreiem Wasser.
  2. Führen Sie die qPCR mit Primern durch, die auf die Promotoren und Enhancer abzielen, von denen bekannt ist, dass sie in Adipozyten aktiv sind, entsprechend den in Tabelle 7 angegebenen Zyklusbedingungen.
  3. Verwenden Sie Negativkontrollprimer, die auf geschlossene/stille genomische Regionen abzielen (Tabelle 7).
  4. Berechnen Sie die Anreicherung des Promotors/Enhancers gegenüber den Negativkontrollen (Tabelle 8).
    HINWEIS: Es wird eine ≥10-20-fache Anreicherung mit erfolgreichen Proben erwartet.

14. Sequenzierung

  1. Übermitteln Sie die ATAC-seq-Bibliotheken zur Sequenzierung. Verwenden Sie Paired-End-Sequenzierung (2 x 34 bp, 2 x 50 bp oder länger) mit durchschnittlichen Lesezahlen von 10 bis 30 Millionen Lesevorgängen pro Probe.

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Ergebnisse

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Um Fettgewebe mit diesem ATAC-seq-Protokoll zu analysieren, haben wir Adipoq-NuTRAP-Mäuse generiert, die mit Chow-Diäten gefüttert wurden. Anschließend isolierten wir Adipozytenkerne aus epididymalem weißem Fettgewebe (eWAT), inguinalem weißem Fettgewebe (iWAT) und braunem Fettgewebe (BAT) mittels Durchflusszytometrie. Die isolierten Kerne wurden für die Tagmentierung verwendet, gefolgt von DNA-Aufreinigung, PCR-Amplifikation, Qualitätsprüfungsschritten, Sequenzierung und Datenanalyse, wie oben beschrieben. Das Ziel dies...

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Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In dieser Arbeit haben wir ein optimiertes ATAC-seq-Protokoll vorgestellt, um die adipozytenspezifische Chromatinzugänglichkeit in vivo zu untersuchen. Dieses ATAC-seq-Protokoll unter Verwendung der Adipoq-NuTRAP-Maus generierte erfolgreich adipozytenspezifische Chromatin-Zugänglichkeitsprofile. Der wichtigste Faktor für erfolgreiche und reproduzierbare ATAC-seq-Experimente ist die Kernqualität. Es ist wichtig, das präparierte Fettgewebe sofort in flüssigem Stickstoff einzufrieren und bis zur Verwendung sicher b...

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Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren erklären, dass sie keine relevanten oder materiellen finanziellen Interessen im Zusammenhang mit der in diesem Artikel beschriebenen Forschung haben.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Diese Arbeit wurde unterstützt durch den IUSM Showalter Research Trust Fund (an H.C.R.), ein Pilot- und Machbarkeitsstipendium des IUSM Center for Diabetes and Metabolic Diseases (an H.C.R.), das National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 an H.C.R.) und den American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 an H.C.R.).

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Animals
Adiponectin-Cre mouseThe Jackson Laboratory28020
NuTRAP mouseThe Jackson Laboratory29899
Reagenzien & Materialien1,5
mL DNA-LoBind RöhrchenEppendorf86-923
100 µ m ZellsiebFalcon352-360
15 mL RöhrchenVWR525-1071
2x TDPuffer Illumina15027866
384-Well-PCR-PlatteAngewendetes Biosystem4483285
40 & Mikro; m ZellsiebFalcon352-340
50 mL RöhrchenVWR525-1077
AMPure XP Reagenz (SPRI-Kügelchen)Beckman CoulterA63881
Bioanalysator High Sensitivity DNA KitAgilent Technologies5067-4626
Klarer KlebefilmAufgebrachtes Biosystem4306311
DNase/RNase-freies destilliertes WasserInvitrogen10977015
Dounce GewebeschleiferDWK Life Sciences357542
DTTSigmaD9779
DynaMag-96 Magnet mit seitlichem RandThermo Fishers12027
FACS RöhrchenFalcon 
HEPESBoston BioProductsBBH-75
Hoechst 33342Invitrogen2134015
KCl (2 M)Boston BioProductsMT-252
Magnetisches Trenngestell für PCR 8-Röhrchen-StreifenEpiCypher10-0008
MgCl2 (1 M)Boston BioProductsMT-200
MinElute PCR-AufreinigungskitQiagen28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR-MastermixBioLabsM0541S
NP40Thermo Fishers28324
PCR 8-Röhrchen-StreifenUSA wissenschaftlich1402-4708
Protease-Inhibitor-Cocktail (100x)Thermo Fishers78439
Qubit dsDNA HS Assay-KitInvitrogenQ32851
SaccharoseSigmaS0389-1KG
SYBR Grün I (10.000x)InvitrogenS7563
TDE I EnzymIllumina15027865
Instruments
DurchflusszytometerBD BiosciencesFACSAria Fusion
Qubit FluorometerInvitrogenQ33226
Real-Time PCR SystemThermo FishersQuantStudio?5
28719128

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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