Summary
我们提出了一种用于转座酶可访问染色质的高通量测序（ATAC-seq）测定的方案，专门针对脂肪细胞，使用细胞核分选，从具有核荧光标记的转基因报告小鼠中分离的脂肪组织。
Abstract
转座酶可接近染色质的高通量测序 （ATAC-seq） 检测是一种强大的技术，可实现全基因组染色质可及性分析。该技术有助于理解一系列生物过程中基因表达的调控机制。尽管ATAC-seq已针对不同类型的样品进行了修改，但尚未对脂肪组织的ATAC-seq方法进行有效修改。脂肪组织面临的挑战包括复杂的细胞异质性、高脂质含量和高线粒体污染。为了克服这些问题，我们开发了一种协议，通过采用荧光激活的细胞核分选与来自转基因报告基因核标记和翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP）小鼠的脂肪组织，允许脂肪细胞特异性ATAC-seq。该协议以最少的测序读数浪费产生高质量的数据，同时减少了细胞核输入和试剂的数量。本文为ATAC-seq方法提供了详细的分步说明，该方法验证了使用从小鼠脂肪组织中分离的脂肪细胞核。该协议将有助于研究脂肪细胞在各种生物刺激下的染色质动力学，这将允许新的生物学见解。
Introduction
脂肪组织专门用于以脂质分子的形式储存多余的能量，是代谢调节的关键器官。严格控制脂肪细胞的形成和维持对脂肪组织功能和全身能量稳态至关重要1.许多转录调节因子在控制脂肪细胞分化、可塑性和功能方面起着关键作用;其中一些调节因子与人类代谢紊乱有关2，3。用于基因表达和表观基因组分析的高通量测序技术的最新进展进一步促进了脂肪细胞生物学分子调节因子的发现4。由于脂肪组织的异质性，使用脂肪组织的分子分析研究具有挑战性。脂肪组织主要由负责脂肪储存的脂肪细胞组成，但也包含各种其他细胞类型，如成纤维细胞、内皮细胞和免疫细胞5。此外，脂肪组织的细胞组成响应于病理生理变化（例如温度和营养状况）而发生显着改变6。为了克服这些问题，我们之前开发了一种转基因报告小鼠，名为核标记和翻译核糖体亲和纯化（NuTRAP），它以Cre重组酶依赖的方式产生GFP标记的核糖体和mCherry标记的生物素化细胞核7。双标记系统使人能够对组织进行细胞类型特异性转录组学和表观基因组学分析。使用NuTRAP小鼠与脂肪细胞特异性脂联素-Cre系（Adipoq-NuTRAP）杂交，我们先前表征了体内纯脂肪细胞群的基因表达谱和染色质状态，并确定它们在肥胖期间如何改变7，8。以前，NuTRAP小鼠与棕色和米色脂肪细胞特异性Ucp1-Cre系（Ucp1-NuTRAP）杂交，使我们能够表征罕见的产热脂肪细胞群体米色脂肪细胞的表观基因组重塑，以响应温度变化9。
ATAC-seq是一种广泛使用的分析方法，用于评估全基因组染色质的可及性。ATAC-seq 中使用的超反应性 Tn5 转座酶允许通过在细胞核 10 的染色质可及区域中标记测序接头来鉴定开放的染色质区域。ATAC-seq是一种简单的方法，但它提供了可靠的结果，即使对于低输入样品也非常高效。因此，它已成为最流行的表观基因组分析方法之一，并有助于理解不同生物学背景下基因表达的调控机制。自创建原始ATAC-seq协议以来，已经进一步开发了各种ATAC-seq衍生技术，以修改和优化各种类型的样品的协议。例如，Fast-ATAC设计用于分析血细胞样本11，Omni-ATAC是冷冻组织样本12的优化方案，MiniATAC-seq对早期胚胎分析有效13。然而，将ATAC-seq方法应用于脂肪细胞，特别是来自组织样本的脂肪细胞，仍然具有挑战性。除了脂肪组织的异质性外，即使在细胞核分离后，其高脂质含量也可能干扰Tn5转座酶的有效重组反应。此外，脂肪细胞中的高线粒体含量，特别是在棕色和米色脂肪细胞中，导致线粒体DNA污染高和测序读数浪费。本文描述了使用Adipoq-NuTRAP小鼠的脂肪细胞特异性ATAC-seq方案（图1）。通过利用荧光标记的细胞核分选，该协议允许收集远离其他混杂细胞类型的纯脂肪细胞核群，并有效去除脂质、线粒体和组织碎片。因此，与标准方案相比，该协议可以生成特定于细胞类型的高质量数据，并最大限度地减少线粒体读取的浪费，同时使用更少的输入和试剂量。
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Protocol
动物护理和实验是根据印第安纳大学医学院机构动物护理和使用委员会批准的程序进行的。
1. 实验开始前的准备工作
- 组织制备
- 对于脂肪细胞核标记，将NuTRAP小鼠与脂肪细胞特异性脂联素-Cre系（Adipoq-Cre）杂交以产生Adipoq-NuTRAP小鼠，其对Adipoq-Cre和NuTRAP都是半合的。
- 如前所述，从Adipoq-NuTRAP小鼠中解剖感兴趣的脂肪组织14。
- 将组织快速冷冻在液氮中，并将其储存在-80°C直至使用。
注意：每个脂肪垫可以作为一个整体储存，冷冻的组织可以在干冰上切成更小的块（~50毫克）进行实验。或者，可以将脂肪组织切割，等分并冷冻在管中储存（每管~50mg）。冷冻样品在使用前冷冻后绝不允许解冻。
- 缓冲液制备
注意：在整个实验过程中将缓冲液保持在冰上。- 制备细胞核制备缓冲液 （NPB）：250 mM 蔗糖、10 mM HEPES （pH 7.5）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2 和 0.1% NP40。每个样品制备 7 mL NPB。使用前向NPB中加入新鲜的100x蛋白酶抑制剂混合物（最终1x），DTT（最终1 mM）和Hoechst（最终1μg/mL）。
注意：建议准备新鲜的NPB，但可以在4°C下储存长达1个月。 - 用0.1%NP-40（PBS-N）制备1x磷酸盐缓冲盐水。
- 制备细胞核制备缓冲液 （NPB）：250 mM 蔗糖、10 mM HEPES （pH 7.5）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl2 和 0.1% NP40。每个样品制备 7 mL NPB。使用前向NPB中加入新鲜的100x蛋白酶抑制剂混合物（最终1x），DTT（最终1 mM）和Hoechst（最终1μg/mL）。
2. 细胞核分离
- 冷却玻璃 Dounce 均质机，每个样品一个玻璃 Dounce，在冰上。然后，向每杯 Dounce 中加入 7 mL 的 NPB 混合物。
注意：建议在每个实验中使用最多八个样品。处理超过八个样品会显着延迟所有步骤，并且可能会在分选过程中特别降低细胞核质量。 - 将冷冻的脂肪组织（50-100毫克）放入玻璃杯中Dounce，立即用一把长剪刀将其切成几小块。用松散的杵对所有样品进行10倍的描边，然后用紧密的杵描边10倍。
注意：脂肪纸巾很软，所以把它们切成几小块就足够了。对于稀有样品，可以使用较小的碎片（10-20毫克），尽管收集的脂肪细胞核数量可能会有所不同。 - 通过 100 μm 过滤器过滤到新的 50 mL 管中。倒入将过滤后的匀浆移至新的 15 mL 管中。在4°C下在4°C下以200× g 旋转10分钟。尽可能去除上清液。
注意：首先使用真空吸出，然后使用微量移液器去除剩余体积。 - 通过轻柔但彻底的手指敲击将沉淀重悬于 500 μL PBS-N 中。
注意：避免移液，因为这可能会损坏细胞核。 - 通过 40 μm 过滤器过滤到新的 50 mL 管中，轻轻移液。用 250 μL PBS-N 冲洗过滤器。使用微量移液器将过滤后的核重悬转移到荧光激活细胞分选（FACS）管中。
注意：如果可用，试管和细胞过滤器可用于较小的体积，以最大限度地减少样品损失。
3. 细胞核分选
- 收集管准备
- 将 500 μL PBS-N 加入新的 1.5 mL 管中，倒置几次以用缓冲液润湿所有内表面。
- 短暂旋转试管以降低所有液体，然后将它们放在冰上冷却直至分类。
- FACS （图2）
- 使用 FSC-A/FSC-H 门控清除单线，使用 FSC-A/SSC-A 清除小碎片或大碎片。
- mCherry/GFP 阳性脂肪细胞核群的门。
- 在步骤3.1制备的每个收集管中收集10，000个细胞核。
- 后分选细胞核制备
- 向每个收集管中加入 500 μL PBS-N，并倒置几次以混合。
- 在4°C下在4°C下旋转收集管200×g旋转10分钟。完全除去上清液。
注意：首先使用真空去除气泡，倒出上清液，然后使用纸巾完全去除剩余的液体。此时颗粒是不可见的。在离心步骤中制备Tn5主混合物，如下所述。
4. Tn5标记（表1）
- 要制备 25 μL Tn5 主混合物，请混合 12.5 μL 2x 标记 DNA 缓冲液（TD 缓冲液）、1.25 μL Tn5 转座酶（TDE I 酶）和 11.25 μL 无核酸酶水。
- 向每个细胞核沉淀中加入 25 μL Tn5 主混合物，并通过轻轻移液重悬。使用热混合器在37°C下以600rpm孵育30分钟。
5. 脱氧核糖核酸纯化
注意：以下程序使用 材料表中提到的PCR纯化试剂盒。可以使用任何其他类似的DNA纯化方法。
- 将 25 μL 无核酸酶水加入步骤 4.2 之后获得的 25 μL Tn5 核重悬混合物中。每个样品的最终体积为 50 μL。
- 加入 250 μL 缓冲液 PB。
- 加入 5 μL 3 M 乙酸钠 （NaOAc） （pH 5.2）。
- 将混合物转移到色谱柱（随参考试剂盒一起提供）中，并在室温（RT）下以17，900 × g 离心1分钟。
- 丢弃流通管，并将离心柱放回同一收集管中。加入 750 μL 含有无水乙醇 （EtOH） 的缓冲液 PE，并在室温下以 17，900 × g 离心 1 分钟。
- 丢弃流通液，并将离心柱放回同一收集管中。在室温下以17，900× g 离心1分钟，并丢弃带有流通物的收集管。
- 要洗脱 DNA 片段，请为色谱柱配备新的 1.5 mL 管，加入 10 μL 缓冲液 EB，并在室温下放置 3 分钟。在室温下以 17，900 × g 离心 1 分钟。
注意：样品可以在4°C下储存数天或在-20°C下储存数周。
6. PCR扩增（表2）
注意：本研究中使用的引物列于 表3中。
- 要扩增转置的DNA片段，请制备PCR主混合物，而无需添加独特的Ad2.n条形码引物（引物#2）。每个样品使用 38 μL PCR 预混液：11 μL 无核酸酶水、2 μL 25 μM Ad1_noMX引物（引物 #1）和 25 μL 2x PCR 预混液。
- 将 38 μL PCR 主混合物加入 0.2 mL PCR 管中。
- 加入步骤 5.7 中 10 μL 洗脱的 DNA 片段。
- 加入 2 μL 25 μM 引物 #2，该引物需要针对每个样品。
- 根据 表2所示的循环条件运行PCR。
7. 实时定量PCR（qPCR）测试（表4）
注意：此步骤旨在确定扩增DNA所需的额外循环。它是可选的，但强烈建议使用，尤其是对于新实验。
- 在不添加引物#2的情况下制备qPCR主混合物。每个样品使用 9.975 μL qPCR 主混合物：4.41 μL 无核酸酶水、0.25 μL 25 μM 引物 #1、5 μL 2x PCR 预混液和 0.09 μL 100x SYBR Green I。
注意：要制备 100x SYBR Green I，请用无核酸酶水稀释 10，000x 原液。由于用于qPCR主混合物的100x SYBR Green I的体积可以忽略不计，因此更容易制作稀释的100x SYBR Green I的额外主混合物（例如，用于8-10个样品）。 - 将 9.975 μL qPCR 主混合物添加到 qPCR 板的每个孔中。
- 向每个孔中加入 0.25 μL 25 μM 引物 #2。
注意：请务必添加相同的引物#2，以匹配步骤6.4中添加到每个特定样品的内容。 - 加入步骤6.5中PCR扩增后获得的PCR反应5 μL，并通过移液混合。
注意：剩余的 45 μL PCR 反应将用于第二次 PCR 扩增。 - 根据 表5中所示的循环条件运行qPCR。
- 检查扩增曲线，并通过估计达到最大值~35%的循环次数来确定所需的额外PCR循环次数（图3A）。
注意：通常，10，000个细胞核需要五到八个额外的PCR循环。
8. 额外的 PCR 扩增
- 根据步骤7.6（表6）中的计算，使用剩余的45 μLPCR反应的所有PCR运行PCR。
注意：每个样品可能需要不同数量的扩增周期。
9. 使用PCR纯化试剂盒进行第二次DNA纯化
- 使用与第 5 节相同的程序，但用 20 μL 缓冲液 EB 洗脱扩增的 DNA 片段。
10. DNA片段大小选择
注意：使用固相可逆固定珠，如下所述。任何其他类似的DNA纯化微球都可以根据制造商的说明使用。SPRI珠悬浮液在使用前应完全重悬并在室温下旋转平衡。
- 将洗脱的DNA转移到新的PCR管中，并加入80 μL缓冲液EB，使最终体积为100 μL。
- 加入 55 μL SPRI 磁珠（0.55 倍样品体积），并通过移液混合。在室温下孵育5分钟，然后在用于PCR 8管条的迷你磁性支架上分离5分钟。
- 将 150 μL 上清液转移到新的 PCR 管中。加入 95 μL SPRI 磁珠，并通过移液混合。
注意：上清液含有大约500 bp或更小的DNA。 - 在室温下孵育5分钟，然后在迷你磁性支架上分离5分钟。小心丢弃上清液。
- 用 200 μL 70% EtOH 洗涤珠子 1 分钟。重复两次，总共洗涤三次。
注意：在洗涤过程中，请勿将PCR管从磁性支架上移开。 - 最后一次洗涤后，以 1，000 × g 离心管 1 分钟，然后移出剩余的 EtOH。在PCR仪上将盖子在37°C下打开2分钟，干燥沉淀。
注意：珠子颗粒干燥后应仅显示一些轻微的裂缝。避免过度干燥。 - 通过移液将沉淀与 20 μL 缓冲液 EB 重悬，并在室温下孵育 5 分钟。 在迷你磁性支架上分离 5 分钟，然后将含有最终文库的 18 μL 上清液转移到新的 1.5 mL 管中。
注意 在执行质量检查时，库可以存储在-20°C。
11. 使用荧光计进行DNA定量
- 要制备主混合物，请将 200x dsDNA 高灵敏度 （HS） 试剂与 dsDNA HS 缓冲液稀释至终浓度为 1x。
- 对于标准品，向荧光计管中加入 190 μL 1x 主混合物和 10 μL 标准品 1 或标准品 2。
注意：在开始定量之前，在黑暗中在室温下平衡标准品。 - 对于文库样品，将 198 μL 的 1x 主混合物和 2 μL 的每个样品添加到单独的荧光计管中。
注意：如果样品量有限，样品体积可以减少到 1 μL，1x 主混合物体积可以增加到 199 μL。 - 涡旋或摇动荧光计管，让它们在黑暗中在室温下静置5分钟。使用荧光计的dsDNA HS测定法测量DNA浓度。
12. 通过高灵敏度电泳系统进行文库质量检查
- 取ATAC-seq文库，用无核酸酶水稀释至终浓度为1-5ng/μL。
- 按照制造商的实验方案，使用高灵敏度的自动电泳系统分析 ATAC-seq 文库的大小分布。
13. 使用靶向qPCR对ATAC-seq文库进行质量检查
- 取 5-10 ng 的 ATAC-seq 文库，并用 50 μL 无核酸酶水稀释。
- 根据 表7所示的循环条件，使用靶向已知在脂肪细胞中具有活性的启动子和增强子的引物运行qPCR。
- 使用靶向封闭/沉默基因组区域的阴性对照引物（表7）。
- 计算启动子/增强子对阴性对照的富集（表8）。
注意：预计成功样品的富集量将增加≥10-20倍。
14. 排序
- 提交 ATAC-seq 文库进行测序。使用配对末端测序（2 x 34 bp、2 x 50 bp 或更长），每个样本的平均读取数为 10-3000 万次读取。
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Representative Results
为了使用这种ATAC-seq协议分析脂肪组织，我们生成了喂食食物饮食的Adipoq-NuTRAP小鼠;然后，我们使用流式细胞术从附睾白色脂肪组织（eWAT），腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和棕色脂肪组织（BAT）中分离脂肪细胞核。如上所述，分离的细胞核用于标记，然后进行DNA纯化，PCR扩增，质量检查步骤，测序和数据分析。这个代表性实验的目的是分析从不同脂肪库分离的纯脂肪细胞群的染色质可及性。
我们观察到mCherry标记和GFP标记的脂肪细胞核与使用流式细胞术从Adipoq-NuTRAP小鼠的脂肪组织中分离的其他细胞类型的细胞核明显区分开来（图2A-C）。根据脂肪库的类型，脂肪细胞分数存在差异：eWAT为~50%，iWAT为~30%，BAT为~65%（图2D）7。我们在每个样品的2-10分钟内收集了10，000个细胞核，并将其用于ATAC-seq程序。我们总共运行了10-13个PCR循环（第一个PCR的5个循环和第二个PCR的5到8个循环，图3A）。如果样品总共需要15个以上的PCR循环，这可能表明样品质量低下（图3B）。ATAC-seq文库的大小分布分析显示，对应于无核小体区（NFR）以及单核、二核和多核小体的多个峰（图4A-C），平均大小为~500-800 bp。劣质样品通常主要显示NFR，没有或很少的核小体峰（图4D）。qRT-PCR分析的质量检查测试显示，脂肪细胞标记基因（如Adipoq，Fabp4，Plin1和Pnpla2）附近的阳性基因组元件富集了10-20倍，而阴性对照组未显示富集（图5）。我们还观察到产热基因Ucp1在BAT中特别富集，但在eWAT或iWAT中没有（图5）。
测序和分析后，我们鉴定了来自三个不同脂肪库（eWAT、iWAT和BAT）的~55，000个峰。线粒体读数为<2%，峰下的分数为~18%-44%（图6A，B）。低质量样品的线粒体读数可能明显较高，和/或峰区域的线粒体读数比例较低。对ATAC-seq文库轨迹的目视检查显示，来自所有脂肪库的脂肪细胞标记基因（如Adipoq，Plin1和Fabp4）附近有多个具有高信噪比的强峰（图7A-C）。我们还在BAT样品中的棕色脂肪细胞制造商Ucp1位点观察到强烈的ATAC-seq峰，但在eWAT或iWAT样品中未观察到这些峰（图7D）。所有这些数据都表明从脂肪细胞核生成了成功的ATAC-seq数据。
图 1：使用 NuTRAP 小鼠的脂肪细胞特异性 ATAC-seq 的示意图流程图。 此协议特有的步骤在红色阴影框中突出显示。请点击此处查看此图的大图。
图 2：代表性的 FACS 门控，说明从 Adipoq-NuTRAP 小鼠的脂肪组织中分离 mCherry/GFP 标记的脂肪细胞核。 （A-C）流式细胞术分析来自Adipoq-NuTRAP小鼠eWAT，iWAT和BAT的分离细胞核。（D）Adipoq-NuTRAP小鼠eWAT，iWAT和BAT中脂肪细胞和非脂肪细胞的细胞核的定量分析。数据是 SEM ±平均值 （n = 3）。这些细胞核计数数据来自Roh等人7。缩写：FACS = 荧光激活细胞分选;GFP = 绿色荧光蛋白;eWAT = 附睾白色脂肪组织;iWAT = 腹股沟白色脂肪组织;BAT = 棕色脂肪组织;NuTRAP = 核标记和翻译核糖体亲和纯化;Adipoq-NuTRAP = NuTRAP小鼠与脂肪细胞特异性脂联素-Cre系杂交;FSC-A = 前向散射峰面积;FSC-H = 前向散射峰高度;SSC-A = 侧散射峰面积;FITC-A = 异硫氰酸荧光素峰面积。请点击此处查看此图的大图。
图 3：qRT-PCR 的代表性 扩增曲线。 （A） 需要七个额外扩增周期的高质量样品。（B）需要额外≥15个循环的劣质样品。缩写：qRT-PCR = 定量逆转录 PCR。 请点击此处查看此图的大图。
图 4：ATAC-seq 库的大小分布曲线。 （A-C） 高质量和 （D） 劣质库显示为代表性结果。缩写：ATAC-seq = 转座酶可及染色质的高通量测序测定;FU = 荧光单位;bp = 碱基对;NFR = 无核小体区域;eWAT = 附睾白色脂肪组织;iWAT = 腹股沟白色脂肪组织;BAT = 棕色脂肪组织。请点击此处查看此图的大图。
图 5：ATAC-seq 文库的质量控制 qPCR 分析。 在一般脂肪细胞标志物 Adipoq， Fabp4， Plin1和 Pnpla2 或棕色脂肪细胞标志物 Ucp1附近富集启动子和增强子。缩写：ATAC-seq = 转座酶可及染色质的高通量测序测定;NC = 阴性对照;eWAT = 附睾白色脂肪组织;iWAT = 腹股沟白色脂肪组织;BAT = 棕色脂肪组织。数据是 SEM ±平均值 （n = 2）。 请点击此处查看此图的大图。
图 6：ATAC-seq 文库峰下的 线粒体读数和分数。 （A）线粒体从eWAT，iWAT和BAT的峰（%）下读取（%）和（B）分数。缩写：ATAC-seq = 转座酶可及染色质的高通量测序测定;eWAT = 附睾白色脂肪组织;iWAT = 腹股沟白色脂肪组织;BAT = 棕色脂肪组织。 请点击此处查看此图的大图。
图7：代表性基因位点的ATAC-seq信号轨迹。 （A-C）一般脂肪细胞标记基因。（B）棕色脂肪细胞特异性标志物。缩写：ATAC-seq = 转座酶可及染色质的高通量测序测定;eWAT = 附睾白色脂肪组织;iWAT = 腹股沟白色脂肪组织;BAT = 棕色脂肪组织。请点击此处查看此图的大图。
表1：Tn5主混合物的组分。请按此下载此表格。
表2：PCR主混合物的组分和初始PCR循环条件。请按此下载此表格。
表3：用于PCR扩增的条形码引物列表。请按此下载此表格。
表 4：qPCR 主混合物的组分。请按此下载此表格。
表5：qPCR循环条件。请按此下载此表格。
表6：用于额外扩增的第二次PCR循环条件。请按此下载此表格。
表7：用于ATAC-seq文库质量检查的引物序列和靶向qPCR循环条件。请按此下载此表格。
表8：用于质量检查的qPCR结果分析。请按此下载此表格。
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Discussion
在本文中，我们提出了一种优化的ATAC-seq协议来评估 体内脂肪细胞特异性染色质的可及性。该ATAC-seq方案使用Adipoq-NuTRAP小鼠成功生成了脂肪细胞特异性染色质可及性图谱。成功和可重复的ATAC-seq实验的最关键因素是细胞核质量。至关重要的是立即将解剖的脂肪组织快速冷冻在液氮中，并将其安全地储存在-80°C下，而无需解冻直至使用。在细胞核分离和分选过程中防止脂肪细胞核损伤也很重要。在整个细胞核分离过程中，必须通过低速离心和最少的移液 轻 柔地处理样品。
在细胞核分选过程中仔细设门对于选择性分离mCherry/GFP标记的脂肪细胞核至关重要（图1）。重要的是要确保明确区分mCherry/GFP阳性和阴性人群。同样，轻柔的处理和快速分选对于保持细胞核中染色质的性质是必要的。如果荧光较弱，分选时间过长，和/或脂肪细胞组分超出预期范围，则表明样品可能存在问题或在细胞核分离过程中出现问题。该协议可以根据实验情况进行修改。首先，ATAC-seq所需的细胞核数量可以减少到1，000或高达100，000。如果细胞核少于 5，000 个，则使用进一步减少体积 （0.6 μL） 的 TDE I 酶可防止过度标记。对于等于或高于50，000的细胞核数，Tn5主混合物的体积可以加倍至50μL，这与原始方案10中使用的体积相同。
其次，可以使用其他细胞核标记系统，例如INTACT（在特定细胞类型中标记的细胞核分离）小鼠代替NuTRAP小鼠16。当INTACT小鼠表达GFP标记的SUN1核膜蛋白时，可以通过分选分离GFP标记的细胞核，并使用本协议中描述的相同方法用于ATAC-seq。也可以采用任何其他核标记方法。最后， 体外培养的脂肪细胞也可用于遵循该协议的ATAC-seq。为此，刮擦在培养皿/盘子上生长的细胞，使用NPB收集，然后进行相同的下游程序 - 除了分类应仅基于大小，复杂性和Hoechst进行，而不是前面描述的mCherry/GFP15。
这种使用NuTRAP技术的脂肪细胞特异性ATAC-seq协议存在局限性，因为它在没有荧光标记的情况下不起作用;因此，分析人体样本不适用于这种技术。然而，仍然可以对通过组织消化和浮选方法分离的脂肪细胞进行ATAC-seq。应该注意的是，使用人漂浮性脂肪细胞有一些局限性，例如使用低速离心时被其他细胞类型污染以及使用高速离心时大脂肪细胞的损失。该协议可以应用于任何具有特定Cre系的细胞类型，即使在有限的细胞输入下，也可以进行有效的细胞类型特异性染色质分析17。总之，除了我们在这里讨论的脂肪细胞 之外，这种改进的ATAC-seq协议将有助于希望评估异质组织中特定细胞类型的染色质可及性的研究人员。
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Disclosures
作者声明，他们与本文中描述的研究没有相关或重大的经济利益。
Acknowledgments
这项工作得到了IUSM Showalter研究信托基金（致H.C.R.），IUSM糖尿病和代谢疾病中心试点和可行性资助（致H.C.R.），国家糖尿病，消化和肾脏疾病研究所（R01DK129289至H.C.R.）和美国糖尿病协会初级教师奖（7-21-JDF-056至H.C.R.）的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Animals | |||
| Adiponectin-Cre mouse | The Jackson Laboratory | 28020 | |
| NuTRAP mouse | The Jackson Laboratory | 29899 | |
| Reagents & Materials | |||
| 1.5 mL DNA-LoBind tubes | Eppendorf | 86-923 | |
| 100 µm cell strainer | Falcon | 352-360 | |
| 15 mL tubes | VWR | 525-1071 | |
| 2x TD buffer | Illumina | 15027866 | |
| 384-well PCR plate | Applied biosystem | 4483285 | |
| 40 µm cell strainer | Falcon | 352-340 | |
| 50 mL tubes | VWR | 525-1077 | |
| AMPure XP reagent (SPRI beads) | Beckman Coulter | A63881 | |
| Bioanalyzer High Sensitivity DNA kit | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Clear adhesive film | Applied biosystem | 4306311 | |
| DNase/RNase-free distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
| Dounce tissue grinder | DWK Life Sciences | 357542 | |
| DTT | Sigma | D9779 | |
| DynaMag-96 side skirted magnet | Thermo Fishers | 12027 | |
| FACS tubes | Falcon | 28719128 | |
| HEPES | Boston BioProducts | BBH-75 | |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | 2134015 | |
| KCl (2 M) | Boston BioProducts | MT-252 | |
| Magnetic separation rack for PCR 8-tube strips | EpiCypher | 10-0008 | |
| MgCl2 (1 M) | Boston BioProducts | MT-200 | |
| MinElute PCR purification kit | Qiagen | 28004 | |
| NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix | BioLabs | M0541S | |
| NP40 | Thermo Fishers | 28324 | |
| PCR 8-tube strip | USA scientific | 1402-4708 | |
| Protease inhibitor cocktail (100x) | Thermo Fishers | 78439 | |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| Sucrose | Sigma | S0389-1KG | |
| SYBR Green I (10,000x) | Invitrogen | S7563 | |
| TDE I enzyme | Illumina | 15027865 | |
| Instruments | |||
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACSAria Fusion | |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | Q33226 | |
| Real-Time PCR system | Thermo Fishers | QuantStudio?5 |
References
- Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
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