Etablierung, Erhaltung, Differenzierung, genetische Manipulation und Transplantation von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen

Summary

Dieses Protokoll beschreibt, wie Tränendrüsenorganoide, die aus primärem Maus- und menschlichem Gewebe gewonnen werden, hergestellt, erhalten, genetisch verändert, differenziert, funktionell charakterisiert und transplantiert werden.

Abstract

Die Tränendrüse ist ein wesentliches Organ für die Homöostase der Augenoberfläche. Durch die Herstellung des wässrigen Teils des Tränenfilms schützt es das Auge vor Austrocknungsstress und äußeren Verletzungen. Über die Tränendrüsen-(Patho-)Physiologie ist wenig bekannt, da es an adäquaten in vitro Modellen mangelt. Die Organoid-Technologie hat sich als nützliche experimentelle Plattform für mehrere Organe erwiesen. Hier stellen wir ein Protokoll zur Etablierung und Aufrechterhaltung von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen vor, beginnend mit Tränendrüsenbiopsien. Durch die Modifikation der Kulturbedingungen verbessern wir die Funktionalität der Tränendrüsenorganoide. Die Organoidfunktionalität kann durch einen "weinenden" Assay untersucht werden, bei dem die Tränendrüsenorganoide ausgewählten Neurotransmittern ausgesetzt werden, um die Tränenfreisetzung in ihrem Lumen auszulösen. Wir erklären, wie man dieses Phänomen abbilden und quantifizieren kann. Um die Rolle von Genen zu untersuchen, die für die Tränendrüsenhomöostase von Interesse sind, können diese genetisch verändert werden. Wir beschreiben ausführlich, wie man Tränendrüsenorganoide mit Hilfe von Baseneditoren genetisch modifizieren kann - vom Guide-RNA-Design bis zur Genotypisierung von Organoidklonen. Schließlich zeigen wir, wie das regenerative Potenzial menschlicher Tränendrüsenorganoide durch orthotope Implantation in der Maus untersucht werden kann. Zusammen bietet dieses umfassende Toolset Ressourcen für die Verwendung von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen zur Untersuchung der Tränendrüsenphysiologie.

Introduction

Die Tränendrüse ist das Drüsenepithel, das für die Produktion des größten Teils der wässrigen Schicht des Tränenfilms^{verantwortlich ist 1}. Die wässrige Schicht des Tränenfilms enthält nicht nur Wasser zur Schmierung der Augenoberfläche, sondern auch ein großes Repertoire an antimikrobiellen Komponenten, die die Augenoberfläche vor Infektionen schützen². Wenn die Tränendrüse geschädigt oder entzündet ist, tritt eine Erkrankung des trockenen Auges auf, die zu Beschwerden für die Patienten führt und schließlich zum Verlust des Sehvermögens führen kann³. Im Laufe der Jahre wurden Modellsysteme zur Untersuchung der Tränendrüse, insbesondere der menschlichen Drüse, begrenzt ^4,5,6. Dies hat zu einer Wissenslücke über die Tränendrüsenfunktion unter physiologischen und pathologischen Bedingungen beigetragen.

In jüngster Zeit wurden In-vitro-Modelle entwickelt, um die Tränendrüse in einer Schale zu untersuchen ^7,8,9. Diese Tränendrüsen-Organoide werden aus adulten Stammzellen gewonnen, die als dreidimensionale Strukturen in einer extrazellulären Matrix gezüchtet werden, ergänzt mit einem Cocktail von Wachstumsfaktoren, die ihre Regenerationsfähigkeit in vitro aufrechterhalten ⁷. Der Vorteil von Organoiden, die aus adulten Stammzellen (ASC) gewonnen werden, besteht darin, dass sie sehr lange erhalten bleiben können, während gesunde Gewebemerkmale rekapituliert werden. Diese Art von Organoiden besteht ausschließlich aus Epithelzellen, im Gegensatz zu aus induzierten pluripotenten Stammzellen (iPSC) gewonnenen Organoiden, die beispielsweise auch Stromazellen enthalten können. Im Gegensatz zu Organoiden, die aus pluripotenten Stammzellen (PSC) gewonnen werden, werden ASC-Organoide direkt aus adultem Gewebe gebildet und erfordern keine genetischen Modifikationen, um erweitert zu werden. ASC-Organoide weisen adulte Merkmale^{auf 10}.

Dieses Protokoll enthält einen Werkzeugkasten zur Gewinnung von Tränendrüsenorganoiden aus Maus- und menschlichem Primärgewebe. Das Protokoll beschreibt, wie die Funktionalität der Organoide durch einfaches Entziehen von Wachstumsfaktoren weiter verbessert werden kann und wie die Organoide durch die Durchführung eines Quelltests zur Sekretion von Tränenflüssigkeit angeregt werden können. Dieses Protokoll beinhaltet zusätzlich eine auf Elektroporation basierende Transfektionsmethode, um Mausorganoide unter Verwendung von CRISPR-abgeleiteten Baseneditoren genetisch zu verändern. Im Gegensatz zu herkömmlichem Cas9 erlaubt die Verwendung von Baseneditoren die Modifikation einzelner Basen im Genom, ohne einen doppelsträngigen Bruch zu erzeugen^11,12. Abschließend wird die orthotope Transplantation von humanen Tränendrüsenorganoiden in immundefiziente Mäuse und die anschließende histologische Beurteilung des Transplantats beschrieben. Dieses Organoid-Toolkit für Tränendrüsen kann in der Forschung zur Regeneration und Funktion der Tränendrüsen sowie zur Modellierung genetischer und entzündlicher Erkrankungen verwendet werden.

Protocol

Die Mausversuche wurden von der Tierethikkommission der Königlich Niederländischen Akademie der Wissenschaften (KNAW) unter der Projektlizenz AVD8010020151 genehmigt. Die Organoide wurden aus überschüssigem Material der Maus gewonnen. Die Biopsien der menschlichen Tränendrüsen wurden aus dem Abfallmaterial von Patienten entnommen, die am Universitätsklinikum Utrecht (UMCU) nach Genehmigung durch die medizinische Ethikkommission unter der Protokollnummer 18-740 operiert wurden. Das Protokoll enthält mehrere Abschnitte, die in Abbildung 1 dargestellt sind.

Abbildung 1: Überblick über das Protokoll. Diese Abbildung verdeutlicht die verschiedenen Schritte des Protokolls. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

HINWEIS: Alle Medium- und Pufferzusammensetzungen sind in der ergänzenden Tabelle 1 beschrieben.

1. Etablierung von Organoiden aus Tränendrüsen von Mäusen und Menschen

1. Die Tränendrüse der Maus präparieren
   1. Bereiten Sie die Sezierwerkzeuge vor, einschließlich Schere, Pinzette und Sezierpads. Euthanasieren einer Maus durch O2/_{CO2-Inhalation} ¹³.
   2. Legen Sie die eingeschläferte Maus auf ihren Bauch auf das Sezierkissen und stecken Sie ihre Gliedmaßen fest. Befeuchten Sie die Haare zwischen den Mäuseohren und auf der Stirn mit 70% Ethanol.
   3. Machen Sie mit einer Sezierschere eine Öffnung hinter dem Schädel zwischen den Ohren. Verlängern Sie diese Öffnung über die Stirn bis zur Nase. Schneiden Sie immer noch mit einer Schere die Haut hinter den Ohren ab, um zwei Lappen zu erzeugen.
   4. Ziehen Sie die Klappen fest in Richtung Nase, bis die Tränendrüsen freiliegen, wie in Abbildung 2A gezeigt. Stecken Sie die Laschen an das Sezierpad. Machen Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt in die Membran über der Tränendrüse, um die Tränendrüse vollständig freizulegen.
   5. Ziehen Sie mit der Pinzette an der Tränendrüse. Es sollte ein gewisser Widerstand vorhanden sein, bis der Haupttränengang gerissen ist. Falls gewünscht, schneiden Sie den Haupttränengang direkt mit einer Schere durch.
   6. Legen Sie die Tränendrüse der Maus bis zur weiteren Verarbeitung in PBS in Gewebekulturqualität ein. Fahren Sie mit der Bearbeitung der Tränendrüse innerhalb von 2-4 Stunden fort, um den Zelltod zu begrenzen. Wenn dies länger dauert, wird die Tränendrüse der Maus in das Biopsiesammelmedium eingeführt (Ergänzungstabelle 1).
      HINWEIS: Mehrere Tränendrüsen können gepoolt werden, wenn sofort eine große Anzahl von Organoiden benötigt wird.
2. Entnahme menschlicher Tränendrüsenbiopsien
   1. Bereiten Sie vor der Operation 20 ml Aliquots des Biopsiesammelmediums (Ergänzungstabelle 1) in einem 50-ml-Röhrchen vor und geben Sie dieses dem Chirurgen vor der Operation. Dieses Medium kann mehrere Monate bei 4 °C aufbewahrt werden.
   2. Lassen Sie den Chirurgen am Tag der Operation ein Stück der Tränendrüse (in der Regel <1 mm³) entnehmen und lagern Sie es im Biopsiesammelmedium (Ergänzungstabelle 1) bei 4 °C.
   3. Entnehmen Sie die Biopsie, um sie so schnell wie möglich zu verarbeiten. Idealerweise sollte dies noch am selben Tag innerhalb von 2 Stunden nach der Biopsieentnahme geschehen.
3. Organoid-Ableitung
   1. Bereiten Sie im Voraus Folgendes vor: aufgetaute extrazelluläre Matrix (EZM), Expansionsmedium der Maus oder des Menschen bei Raumtemperatur (RT) (Ergänzungstabelle 1), aufgetaute Kollagenase, Basismedium (Ergänzungstabelle 1), zwei Skalpelle, eine 10-cm-Petrischale, ein 70-μm-Sieb auf einem 15-ml-Röhrchen und 12-Well-Aufhängungsplatten, die 30 Minuten lang bei 37 °C vorgewärmt wurden.
   2. Bereiten Sie das Aufschlussmedium vor, indem Sie alle in der ergänzenden Tabelle 1 aufgeführten Komponenten kombinieren. Befeuchten Sie die Skalpelle mit diesem Medium, um zu vermeiden, dass Gewebestücke daran kleben bleiben.
   3. Entnehmen Sie das Tränendrüsengewebe der Maus oder des Menschen aus dem Medium und legen Sie es in die Petrischale.
   4. Mit den vorbenetzten Skalpellen das Gewebe zerkleinern. Sobald die Gewebestücke sehr klein sind (z. B. <0,5 mm³), legen Sie sie in das Verdauungsmedium, indem Sie sie mit dem Skalpell von der Petrischale abkratzen. Wenn die Humanbiopsie bereits sehr klein ist, legen Sie sie direkt in das Verdauungsmedium, ohne sie zu zerkleinern, um Gewebeverlust zu vermeiden.
   5. Inkubieren Sie die Gewebestücke bis zu 15 min im 37 °C warmen Wasserbad. Drehen Sie das 15-ml-Röhrchen regelmäßig um, um die Stücke wieder zu suspendieren. Überwachen Sie die Zelldissoziation unter einem Tischmikroskop, um das Gewebe nicht zu stark zu verdauen.
   6. Verengen Sie in der Zwischenzeit eine Pasteurpipette, indem Sie ihre Spitze beim Wenden in eine Flamme legen, und befeuchten Sie sie im Basismedium. Um das Gewebe effizient zu dissoziieren, stellen Sie sicher, dass das Loch etwas kleiner ist als die größten verbleibenden Gewebestücke. Um den Dissoziationsprozess zu erleichtern, pipettieren Sie die Mischung alle 5 Minuten mit der vorbenetzten, verengten Pasteurpipette auf und ab.
   7. Wenn unter dem Mikroskop viele Einzelzellen und kleine Klumpen sichtbar sind, stoppen Sie die Dissoziation durch Zugabe von 10 ml des Basismediums. Bei 400 x g für 5 Minuten nach unten schleudern, um die Zellen zu pelletieren.
   8. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 10 ml des Basismediums, um den Waschvorgang zu wiederholen. Filtern Sie es durch ein 70-μm-Sieb, um die großen unverdauten Gewebestücke und verbleibenden Kollagenfasern zu entfernen, was eine ausreichende Polymerisation der EZM verhindern würde. Schleudern Sie das Eluat bei 400 x g für 5 min.
      HINWEIS: Ein Erythrozytenpellet zeigt das Vorhandensein von roten Blutkörperchen an, was die Ableitung von Organoiden normalerweise nicht behindert. Für einige Anwendungen, wie z. B. die Durchflusszytometrie, sollten die roten Blutkörperchen jedoch lysiert werden. Inkubieren Sie dazu die Zellen in 5 ml frischem Lysepuffer der roten Blutkörperchen bei RT für 5 min und pelletieren Sie die Zellen bei 400 x g für 5 min.
   9. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 μl kalter EZM für eine einzelne Tränendrüse der Maus und in 50 μl kalter EZM für eine Humanbiopsie. Achten Sie beim Resuspendieren darauf, keine Blasen zu bilden, da diese auch die ECM-Polymerisation und -Stabilität beeinträchtigen würden.
   10. Säen Sie bis zu 100 μl Zellen pro Well einer 12-Well-Suspensionsplatte. Verwenden Sie einen P200, um ~20 μl Tröpfchen in der Vertiefung zu erzeugen. Je kleiner die Tröpfchen, desto besser die Diffusion der Wachstumsfaktoren und Nährstoffe durch die Matrix.
   11. Legen Sie die Platte kopfüber für 20-30 Minuten in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C, damit sich das ECM verfestigen kann.
   12. Sobald die ECM erstarrt ist, fügen Sie ~1 ml RT-Maus oder humanes Expansionsmedium pro Vertiefung einer 12-Well-Platte hinzu. Frischen Sie das Medium alle 2-3 Tage auf, bis die Organoide eine Größe von 300 μm erreicht haben. Saugen Sie dazu das Medium in der Vertiefung an und fügen Sie vorsichtig Expansionsmedium an der Seite der Vertiefung hinzu, ohne die ECM-Tröpfchen zu berühren, um sie nicht zu stören.
       HINWEIS: Primocin (100 mg/ml; 1:1.000 aus handelsüblichem Lager) kann bei der Isolierung hinzugefügt werden, wenn eine bakterielle Kontamination auftritt. Da es jedoch auch das Wachstum von Organoiden verlangsamt, ist es vorzuziehen, es nach ein oder zwei Durchgängen nicht hinzuzufügen oder zu entfernen.

2. Erweiterung der Tränendrüsenorganoide der Maus und des Menschen

1. Entfernen Sie nach ~7 Tagen für Maus-Organoide und ~10 Tagen für menschliche Organoide, wenn die Organoide eine Größe von ~300 μm erreichen, das Nährmedium.
2. Resuspendieren Sie die ECM-Tröpfchen, die die Organoide enthalten, in 1 ml Trypsinlösung, indem Sie kräftig mit einem P1.000 auf und ab pipettieren, bis die Tröpfchen auseinanderfallen. Diese Mischung wird in ein 15-ml-Röhrchen umgefüllt und kurz in einem 37 °C warmen Wasserbad inkubiert.
3. Nach 2-3 Minuten pipettieren Sie die Organoid-Suspension mit einer verengten und vorgefeuchteten Pasteurpipette 10x-15x auf und ab. Überprüfen Sie den Dissoziationsstatus der Organoide unter einem Tischmikroskop. Es sollten kleine Klumpen von ~20 Zellen erhalten werden. Im 37 °C warmen Wasserbad länger inkubieren und den Pipettierschritt wiederholen, bis die Dissoziation zufriedenstellend ist.
   HINWEIS: Dieser Schritt kann bei menschlichen Organoiden länger dauern, da sie mehrschichtig sind. Es werden einzelne Zellen erzeugt; Dies hat keinen Einfluss auf das Organoid-Auswachsen, solange der größte Teil der Organoid-Suspension aus kleinen Klumpen besteht.
4. Stoppen Sie die Dissoziation durch Zugabe von 10 ml des Basismediums. Dann pelletieren Sie die Zellen bei 400 x g für 5 Minuten.
5. Nach dem Entfernen des Überstands und der EZM, die auf den Organoiden liegen kann (transparente, geleeartige Schicht ohne Organoide), werden die Zellen in einem geeigneten Volumen kalter ECM resuspendiert, bevor sie in eine Suspensionsplatte eingebracht werden, wie in Schritt 1.3.10 angegeben.
   HINWEIS: Im Allgemeinen werden Tränenorganoide von Mäusen im Verhältnis 1:5 und menschliche Organoide im Verhältnis 1:3 gespalten. Das bedeutet, dass Organoide, die in 100 μl EZM enthalten sind, nach der Spaltung in 500 μl bzw. 300 μl resuspendiert werden müssen.
6. Inkubieren Sie die Platte kopfüber in einem 37 °C-Inkubator bis zur Erstarrung der EZM für 30 min und bedecken Sie die Organoide mit der Maus oder dem menschlichen Expansionsmedium bei RT.

3. Kryokonservierung der Tränendrüsenorganoide der Maus und des Menschen

1. Um die Organoide kryozukonservieren, werden die Organoide zunächst gemäß den Anweisungen in Abschnitt 2 im Expansionsmedium gespalten.
2. Etwa 3-4 Tage später, wenn sich die Organoide in einer Wachstumsphase befinden, entfernen Sie das Medium und resuspendieren Sie 100 μl der EZM, die Organoide enthält, in 10 ml kaltem Basismedium. 10 Minuten auf Eis inkubieren, um die ECM zu dissoziieren. Drehen Sie das Röhrchen regelmäßig um, um diesen Vorgang zu erleichtern.
3. Die Organoide bei 500 x g für 5 min pelletieren. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Organoid-Pellet in 1 ml Kryokonservierungsmedium (übrig gebliebene ECM beeinträchtigt die Kryokonservierung nicht). Die organoide Suspension wird in ein Kryoöl und sofort in einen −80 °C heißen Gefrierschrank überführt.
   HINWEIS: Bei Verwendung des in der Materialtabelle beschriebenen Kryokonservierungsmediums können die Kryoflaschen unbegrenzt in einem Gefrierschrank mit einer Temperatur von −80 °C aufbewahrt werden. Wenn ein anderes Kryokonservierungsmedium verwendet wird, überführen Sie das Kryomaterial nach 24 h in einen Flüssigstickstofftank, um eine optimale Konservierung zu gewährleisten.
4. Um die Organoide aufzutauen, holen Sie das Kryoial aus dem Gefrierschrank und transportieren Sie es auf Trockeneis in ein 37 °C warmes Wasserbad. Halten Sie das Kryomaterial in das Wasser, bis der größte Teil seines Inhalts aufgetaut ist. Übertragen Sie den Inhalt in ein 15-ml-Röhrchen mit 10 ml Basismedium und schleudern Sie die Zellen 5 Minuten lang bei 400 x g herunter.
5. Die Organoide werden in 100 μl ECM mit dem Expansionsmedium beschichtet, wie in Schritt 2.5 und Schritt 2.6 beschrieben.

4. Unterscheidung von Tränendrüsenorganoiden und Beurteilung ihrer Funktionalität

1. Organoid-Differenzierung
   1. Zur Unterscheidung von Tränendrüsenorganoiden werden zunächst die Organoide im Expansionsmedium gemäß den Anweisungen in Abschnitt 2 gespalten.
   2. Ersetzen Sie nach 2 Tagen das Expansionsmedium durch Maus- oder menschliches Differenzierungsmedium, wie in Schritt 1.3.12 beschrieben. Frischen Sie das Medium alle 2-3 Tage auf, um die Maus-Organoide 5 Tage lang in diesem Medium und die menschlichen Organoide 9 Tage lang zu erhalten.
   3. Um die Organoid-Differenzierung nach 5 Tagen oder 9 Tagen im Differenzierungsmedium zu beurteilen, sammeln Sie 100 μl EZM, die Organoide enthält, um die RNA zu extrahieren. Dazu werden die ECM-Tröpfchen in 1 ml des in der Vertiefung enthaltenen Mediums mit einem P1.000 resuspendiert und die organoide Suspension in 3 ml eiskaltes Basismedium überführt. Die Organoide bei 500 x g für 5 min pelletieren.
   4. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet im RNA-Extraktionspuffer. Führen Sie die nachgeschaltete RNA-Extraktion gemäß den Anweisungen des RNA-Extraktionskits durch. Verwenden Sie die gewonnene RNA z.B. für die RT-qPCR-Analyse der Expression von Stammzellen (TP63, KRT5, KRT14) und differenzierten Zellmarkern (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2...) ¹⁴. Der Teufel
      HINWEIS: Um die entsprechende Expressionsanalyse zu erhalten, messen Sie die Expression der ausgewählten Marker in einer oder mehreren Gewebeproben. Organoide, die unter Differenzierungsbedingungen kultiviert werden, enthalten tendenziell weniger RNA.
2. Funktioneller Quellungstest
   HINWEIS: Verwenden Sie für diesen Teil des Protokolls menschliche Tränendrüsenorganoide, die seit mindestens 7 Tagen differenziert sind. Die Mindestzeit beträgt 7 Tage, um eine ausreichende Markerexpression für funktionelles Tearing zu gewährleisten. Jede Vertiefung einer 12-Well-Platte stellt eine Bedingung dar. Die Mindestanzahl von Bedingungen beträgt drei: eine Positivkontrolle, eine Negativkontrolle und eine Testbedingung.
   1. Bereiten Sie 1 ml humanes Differenzierungsmedium frisch zu, das einzelne Komponenten enthält, die die Sekretion durch die Tränendrüsenorganoide induzieren. Fügen Sie z. B. 100 μM Noradrenalin und 1 μM Forskolin hinzu und mischen Sie gründlich.
      HINWEIS: Forskolin dient als Positivkontrolle, die in der Regel eine maximale Schwellung induziert.
   2. Legen Sie an einem automatisierten Hellfeld-Zeitraffermikroskop die abzubildenden Positionen, das Zeitintervall (5 min) und die Dauer (4 h) fest. Stellen Sie sicher, dass an jeder Position ein ganzer ECM-Tröpfchen sichtbar ist.
   3. Unmittelbar vor Beginn der Aufnahme und ohne die Platte vom Mikroskop zu nehmen, ist das Nährmedium aus den abzubildenden Vertiefungen zu entfernen und durch das in Schritt 4.2.1 hergestellte gut resuspendierte Medium zu ersetzen. Schließen Sie als Negativkontrolle eine Vertiefung ein, bei der das Differenzierungsmedium nur durch das Differenzierungsmedium ersetzt wurde, da eine mittlere Auffrischung eine gewisse Organoidschwellung auslösen kann.
   4. Nach bis zu 4 h ist der Quelltest beendet. Analysieren Sie die Ergebnisse.
      HINWEIS: Diese Schritte werden mit einem EVOS M7000-Mikroskop durchgeführt, das eine automatisierte Hellfeld-Zeitrafferaufnahme ermöglicht. Schlagen Sie für dieses Mikroskop im ausführlichen Handbuch des Herstellers nach, um die Zeitrafferaufnahme einzurichten. Bemerkenswert ist, dass jedes andere Mikroskop mit ähnlichen Eigenschaften verwendet werden kann.
   5. Um die Organoidschwellung zu quantifizieren, messen Sie den Durchmesser jedes einzelnen Organoids bei 0 h und 4 h. Öffnen Sie die Bilder eines einzelnen Organoid-Tröpfchens bei 0 h und 4 h in ImageJ.
   6. Klicken Sie auf das Symbol Gerade Linie in der Symbolleiste und zeichnen Sie zuerst den Durchmesser eines Organoids bei 0 h. Verwenden Sie dann das Messwerkzeug in ImageJ (Analysieren > Messen), um die Länge dieser Linie und damit den Organoiddurchmesser vor dem Anschwellen zu messen. Wiederholen Sie den Vorgang am selben Organoid nach 4 Stunden, um den Organoiddurchmesser nach dem Schwellen zu erhalten.
   7. Messen Sie den Organoiddurchmesser von ~20 Organoiden pro Bedingung vor und nach dem Quelltest.

5. Konstruktion eines Plasmids, um Pax6 auszuschalten

1. gRNA-Design bis zum Knockout Pax6 Verwenden von C>T-Basiseditoren
   HINWEIS: Es gibt eine Vielzahl von Softwareprogrammen für das gRNA-Design. Hier wurde Benchling verwendet, da dies ein integriertes gRNA-Design, eine Annotation und das Alignment von Sanger-Spuren ermöglicht. Alle weiteren Schritte können somit auch mit alternativen Softwareprogrammen durchgeführt werden.
   1. Starten Sie den gRNA-Designprozess, indem Sie das Zielgen in Benchling visualisieren, indem Sie auf Neu (+) > DNA-Sequenz klicken > DNA-Sequenzen importieren.
   2. Geben Sie auf der Registerkarte Aus Datenbank importieren das gewünschte Gen Pax6 ein und klicken Sie auf Suchen.
   3. Wählen Sie die neueste Version des Mausreferenzgenoms GRCm38 (mm10, Mus musculus) aus und klicken Sie auf Importieren.
   4. Wählen Sie das Exon aus, in dem die Knock-out-gRNA entworfen werden kann, indem Sie die folgenden Regeln einhalten:
      1. Vermeiden Sie es, eine gRNA in das erste kodierende Exon zu setzen, da alternative Startstellen in nachfolgenden Exons von der Zelle verwendet werden können, um das früh induzierte Stoppcodon zu umgehen.
      2. Entwerfen Sie gRNAs in Exons, die in allen alternativen Transkripten vorhanden sind, die durch Spleißen der Pax6-mRNA auftreten können. Um dies zu gewährleisten, visualisieren Sie Pax6 im Ensembl-Genombrowser und wählen Sie das Exon aus, das in allen Transkripten verwendet wird.
      3. Um das alternative Spleißen weiter zu umgehen, zielen Sie auf ein Exon ab, das ein unvollständiges Codon (eine oder zwei verbleibende Basen eines Tripletts) hat. Dies ist von geringerer Bedeutung, gibt aber mehr Sicherheit über die Auswirkungen von induzierten Indels. Für Pax6 sind Exon 4 bis Exon 11 ein gutes Ziel. Wählen Sie außerdem ein Exon, das Tryptophan (W), Glutamin (Q) oder Arginin (R) enthält.
         HINWEIS: Standard-C>T-Basen-Editoren, die SpCas9 verwenden, haben ein Bearbeitungsfenster, das sich vom Anfang der gRNA bis zum Nukleotid 8 erstreckt (am weitesten von der PAM entfernt). C- > T-Basen-Editoren können Stop-Codons auf allen Tryptophan (W)-Resten (TGG zu TGA, TAG oder TAA) mit einer gRNA auf dem Rückwärtsstrang, auf Glutamin (Q)-Resten (CAG zu TAG oder CAA zu TAA) und schließlich auf Arginin(R)-Resten (CGA zu TGA) auf dem Vorwärtsstrang einführen.
   5. Wählen Sie das Exon + 20 Basen stromaufwärts und stromabwärts aus. Klicken Sie auf der rechten Seite des Bildschirms auf das Zielzeichen CRISPR und klicken Sie auf Hilfslinien entwerfen und analysieren.
   6. Setzen Sie im neu geöffneten Menü unter dem Reiter Design Type ein Häkchen bei Guides für "Base Editing" (Komor et al., 2016). Halten Sie die Führungslänge bei 20 Nukleotiden, und wählen Sie unter Genom für Maus die Option GRCm38 (mm10, Mus musculus) aus.
   7. Nachdem Sie auf das grüne + -Zeichen geklickt haben, erkennt das Softwareprogramm automatisch alle Sequenzen des Protospacer-benachbarten Motivs (PAM) und erstellt auf der rechten Seite des Bildschirms eine Liste aller potenziellen gRNAs im Bereich des interessierenden Exons.
   8. Scrollen Sie durch die Liste bis zum Stopp-Codon-Zeichen (*) in einem roten Kästchen, das auf eine gRNA hinweist, die möglicherweise eine Aminosäure in ein Stop-Codon verwandeln und somit zu einem Knock-out führen kann.
   9. In der ersten Spalte rechts neben der gRNA-Sequenz werden für jedes Ziel-"C" um das Editierfenster herum die in silico prognostizierten Editiereffizienzen berechnet. Stellen Sie sicher, dass die C>T-Bearbeitung, die zum Stopcodon führt, eine Bearbeitungseffizienz von mindestens ~10 hat.
   10. Klicken Sie auf den Wert in der Spalte Off-Target, um zu prüfen, an welche Off-Target-Loci die gRNA binden könnte. Vermeiden Sie es, eine gRNA zu wählen, die an zusätzliche Gene bindet, um die Spezifität zu erhöhen. Zum Beispiel zielt eine gute gRNA, um Pax6 mit einem C- > T-Baseneditor zu editieren, auf Exon 7 ab und ist 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'.
   11. Erstellen Sie eine Anmerkung in der Benchling-Datei, indem Sie oben rechts auf dem Bildschirm auf das Symbol Anmerkungen und dann auf Neue Anmerkung klicken. Benennen Sie die Annotation und stellen Sie sicher, dass die richtige gRNA-Ausrichtung im Dropdown-Menü Strang ausgewählt ist.
2. gRNA-Plasmid-Generierung
   HINWEIS: Es stehen verschiedene Vektoren für die gRNA-Abgabe in Organoide zur Verfügung. Das folgende Plasmid wurde als Basis für die gRNA-Konstruktion verwendet: pFYF1320 (Addgene #47511, ein freundliches Geschenk von Keith Joung).
   1. Um die gRNAs in pFYF1320 zu klonieren, implementieren Sie eine inverse PCR-Strategie unter Verwendung des Standard-Forward-Primers: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Um den Reverse-Primer zu entwerfen, kleben Sie das Reverse-Komplement der gRNA-Spacer-Sequenz (überprüfen Sie die gRNA-Orientierung [+ oder -Strang]) vor das folgende universelle Reverse-Primer-Teil: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Um das Exon 7 der Maus Pax6 mit dem C>T-Baseneditor anzusprechen, lautet der umgekehrte Primer wie folgt: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Bestellen Sie beide Grundierungen.
   2. Führen Sie eine inverse PCR-Reaktion mit 1 ng pFYF1320 als Matrize unter Verwendung einer High-Fidelity-DNA-Polymerase für 35 Zyklen bei einer Annealing-Temperatur von 61 °C durch.
   3. Führen Sie die PCR-Reaktion an einem 1%igen Agarosegel in TAE-Puffer bei 100 V für ~45 min durch, um das erwartete Fragment von 2.281 Basenpaaren (bp) zu visualisieren. Führen Sie eine Gelreinigung mit dem Kit Ihrer Wahl durch.
   4. Richten Sie die folgende Ligationsreaktion ein: 100 ng gereinigtes PCR-Produkt, Dpn1-Enzym zur Entfernung der ursprünglichen pFYF1320-Templat-DNA und T4-Ligase. Die Mischung wird 15 Minuten bei 20 °C, 30 Minuten bei 37 °C und 20 Minuten bei 80 °C inkubiert.
   5. Wandeln Sie das Reaktionsgemisch in chemisch kompetente DH5α-Bakterien um und verteilen Sie die Bakterien auf Agarplatten, die Ampicillin¹⁵ enthalten.
   6. Am nächsten Tag werden drei einzelne Kolonien in 3 ml Lysogenbrühe (LB) gepflückt und expandiert, das mit 50 μg/ml Ampicillin angereichert ist.
   7. Führen Sie am nächsten Tag mit einem Miniprep-Kit eine Minivorbereitung mit 1 ml jeder der drei Minikulturen durch und lagern Sie den Rest bei 4 °C. Das erhaltene Plasmid wird einer Sanger-Sequenzierung mit dem U6_Forward Primer unterzogen, um sicherzustellen, dass die gRNA korrekt in den Vektor¹⁶ eingefügt wird.
   8. Nachdem Sie eine einzelne Bakterienkolonie mit dem richtigen Plasmid identifiziert haben, inokulieren Sie 500 μl der entsprechenden Minikultur in 50 ml LB, ergänzt mit Ampicillin, um die Plasmid-DNA über Nacht zu vervielfältigen. Führen Sie am Tag nach der Verwendung eines Midiprep-Kits eine Midi-Vorbereitung durch. Dieses Plasmid wird für die Elektroporation in Abschnitt 6 verwendet.

6. Generierung von Pax6 KO-Klonen

1. Organoide Elektroporation
   1. Beginnen Sie mit Maus-Organoiden, die höchstens 5 Tage zuvor gespalten wurden, so dass sie sich in einem proliferativen Zustand befinden. Verwenden Sie ~300-400 μL organoide Tröpfchen pro Knock-out. Fügen Sie eine zusätzliche Bedingung für die Auswahl einer Negativkontrolle hinzu, die ohne Plasmid elektroporiert wird.
   2. Führen Sie die Schritte 2.1-2.4 aus, um die Organoide zu dissoziieren, aber dissoziieren Sie die Organoide länger, so dass es sich um einzelne Zellen handelt. Verwerfen Sie den Überstand.
   3. Resuspendieren Sie die Zellen in 80 μl des Elektroporationspuffers.
   4. In einem 1,5-ml-Röhrchen werden die folgenden Plasmide für maximal 20 μl hergestellt: 2,5 μg pFYF1320-gRNA-Plasmid, 2,8 μg transposasehaltiges Plasmid, 7,2 μg hygromycinresistentes transposonhaltiges Plasmid und 7,5 μg pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
      HINWEIS: Das pFYF1320-gRNA-Plasmid kodiert für die zuvor entworfene gRNA, die den Baseneditor zum Ziellocus führt. Das pCMV_ABEmax_P2A_GFP Plasmid kodiert für den Baseneditor sowie einen GFP-Reporter, mit dem die Zellen überwacht werden können, die den Baseneditor nach der Elektroporation exprimieren. Das Transposase-haltige Plasmid kodiert für die Transposase, die die Hygromycin-Resistenzkassette, die durch das Hygromycin-Resistenz-Transposon-haltige Plasmid bereitgestellt wird, zufällig irgendwo in das Genom einfügt. Zellen, die diese Kassette in ihr Genom eingebaut haben, werden resistent gegen Hygromycin und können durch die Zugabe von Hygromycin positiv selektiert werden. Da der gleichzeitige Einbau mehrerer Plasmide sehr wahrscheinlich ist, stellt die Hygromycin-Resistenz eine funktionelle Selektion zur Anreicherung für Zellen dar, die für Pax6 editiert wurden.
   5. Geben Sie die Plasmide zu den Zellen und mischen Sie sie gut, indem Sie auf und ab pipettieren.
   6. Stellen Sie den Elektroporator mit folgenden Parametern für den Porenpuls (Spannung: 175 V; Pulslänge: 5 ms; Pulsintervall: 50 ms; Anzahl der Impulse: 2; Abklingrate: 10%; Polarität: +) und für den Übertragungsimpuls (Spannung: 20 V; Pulslänge: 50 ms; Pulsintervall: 50 ms; Anzahl der Impulse: 5; Abklingrate: 40%; Polarität: +/-) ein.
   7. Legen Sie die Zellen mit den Plasmiden in eine Elektroporationsküvette. Messen Sie sofort den Widerstand (Ω), der zwischen 0,30 A und 0,55 A liegen sollte, und elektroporieren Sie sofort. Eine schnelle Durchführung dieses Schritts ist erforderlich, um zu vermeiden, dass sich die Zellen am Boden der Küvette absetzen und die Effizienz der Elektroporation verringern.
   8. Übertragen Sie die Zellen in ein 1,5-ml-Röhrchen und fügen Sie 400 μl Elektroporationspuffer hinzu, der mit einem Rho-Kinase-Inhibitor ergänzt wird. Lassen Sie die Zellen 30 Minuten lang bei RT erholen.
   9. Die Zellen werden 5 Minuten lang bei 500 x g pelletiert, der Überstand verworfen und die Zellen mit 200 μl ECM beschichtet. Fügen Sie nach dem Erstarren das Maus-Expansionsmedium hinzu.
   10. Zystische Organoide wachsen nach 2-3 Tagen heraus. Überwachen Sie täglich das GFP-Signal, das das Vorhandensein von C > T-Baseneditor anzeigt.
2. Selektion von Organoiden
   1. Nach ~3 Tagen, wenn sich die Organoide erholt haben, fügen Sie 100 μg/ml Hygromycin zum Mausexpansionsmedium hinzu, um Organoide auszuwählen, die die Hygromycin-Widerstandskassette integriert haben. Es besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass Zellen, die ein Plasmid aufnehmen, mehrere Plasmide aufnehmen. Durch die Selektion nach Hygromycin-resistenten Organoiden werden editierte Organoide am Pax6-Locus angereichert.
   2. Wenn alle Zellen in der Negativkontrolle tot sind und die überlebenden Organoide ~300 μm groß sind, wählen Sie die Hygromycin-resistenten Organoide.
3. Organoid-Picking und Genotypisierung
   1. Bereiten Sie sterile P20-Spitzen neben dem Mikroskop und 1,5-ml-Röhrchen mit jeweils 100 μl Trypsinlösung auf Eis vor.
   2. Biegen Sie eine P20-Spitze mit einer Pinzette. Beobachten Sie die Platte mit den überlebenden Organoiden auf einem Tischmikroskop. Wenn ein überlebendes Organoid scharf ist, entfernen Sie den Deckel der Platte. Saugen Sie mit der gebogenen P20-Spitze und noch unter dem Mikroskop jedes überlebende Organoid einzeln ab und legen Sie jedes dieser Organoide in ein separates Röhrchen mit Trypsinlösung.
   3. Sammle bis zu 20 Klone ein. Die Anzahl der zu pickenden Klone hängt von der Anzahl der Klone ab, die für jedes Versuchsdesign benötigt werden, und von der Editiereffizienz, die je nach gRNA und Locus variiert.
   4. Wenn alle Klone gepflückt wurden, legen Sie die 1,5-ml-Röhrchen bis zu 5 Minuten lang in ein 37 °C warmes Wasserbad. Wirbeln Sie jedes Röhrchen regelmäßig, um die Dissoziationsgeschwindigkeit zu erhöhen, und überprüfen Sie die Organoide unter dem Tischmikroskop. Wenn die Organoide in kleine Klumpen und/oder einzelne Zellen dissoziiert sind, stoppen Sie den Aufschluss durch Zugabe von 1 ml Basismedium.
   5. Bewahren Sie für jeden ausgewählten Klon ~400 μL zum Genotyp in einem separaten 1,5-ml-Röhrchen auf. Schleudern Sie die ~600 μL, die bei 500 x g verbleiben, 5 min lang, entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in 20 μL EZM, schichten Sie sie als einzelnes Tröpfchen in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte und fügen Sie Mausexpansionsmedium ohne Hygromycin hinzu.
   6. Um die Klone zu genotypisieren, drehen Sie die Röhrchen mit ~400 μl Zellsuspension bei 500 x g für 5 Minuten herunter, entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 50 μl DNA-Extraktionspuffer, um die DNA zu extrahieren.
   7. Inkubieren Sie die Zellen sofort wie folgt: 6 min bei 60 °C, Vortex, und 4 min bei 95 °C. Diese DNA kann bis zu 7 Tage bei −20 °C aufbewahrt werden, aber die sofortige Durchführung der nachgeschalteten PCR ist am optimalsten.
   8. Um den mit der Nuklease anvisierten Locus zu amplifizieren, wird eine PCR an 2 μl der extrahierten DNA unter Verwendung geeigneter, zuvor bestellter Genotypisierungsprimer und einer Low-Fidelity-Polymerase durchgeführt. Die Genotypisierungsprimer sind AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) und TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). Das Amplikon sollte etwa 100 bp vom erwarteten editierten Locus entfernt beginnen, um sicherzustellen, dass es effizient sequenziert wird.
   9. Führen Sie das PCR-Produkt auf einem Agarosegel durch, um die PCR-Effizienz zu beurteilen, wie in Schritt 5.2.3 beschrieben. Wenn eine Bande der richtigen Größe erkannt wird, schneiden Sie sie aus dem Gel heraus, um eine DNA-Gelextraktion mit einem Kit durchzuführen.
   10. Sequenzieren Sie die extrahierte DNA aus jedem Organoid-Klon, der zuvor mit den Genotypisierungsprimern ausgewählt wurde.
   11. Richten Sie die erhaltenen Sequenzen an das Pax6-Gen in Benchling aus. Öffnen Sie die importierte Gensequenz aus Schritt 4.1. Klicken Sie auf der rechten Seite auf Achsen und dann auf Neue Achse erstellen. Laden Sie die .ab1-Dateien hoch, die Sie vom Sequenzierungsanbieter erhalten haben, wählen Sie DNA als Nukleotidtyp aus, und klicken Sie auf Weiter.
   12. Wählen Sie im folgenden Fenster Multisequenz und das Ausrichtungsprogramm Auto (MAFFT) aus, bevor Sie auf Achse erstellen klicken.
   13. Identifizieren Sie die Genotypen, die ein homozygotes vorzeitiges Stoppcodon (wie mit Baseneditoren erhalten) auf beiden Allelen haben. Bewahren Sie die entsprechenden Organoid-Klone auf, um sie zu expandieren, und kryokonservieren Sie diese für weitere Analysen. Idealerweise sollten drei verschiedene Organoid-Klone nebeneinander analysiert werden, um mögliche Nuklease-Off-Target-Effekte zu umgehen.

7. Orthotope Transplantation von humanen Tränendrüsenorganoiden bei NSG-Mäusen

1. Organoide Präparation
   1. Menschliche Tränendrüsenorganoide müssen ~3 Tage vor dem Transplantationstag gespalten werden, wie in Abschnitt 2 beschrieben. Stellen Sie am Tag der Transplantation sicher, dass sich die Organoide in der proliferativen Phase befinden, um die Chancen auf eine Transplantation zu erhöhen.
   2. Um die Organoide aus der EZM zu extrahieren, wird Dispase in das Nährmedium gegeben, um eine Endkonzentration von 0,125 U/ml zu erreichen. Mit einem P1.000 die ECM-Tröpfchen gründlich resuspendieren, um sie aufzubrechen, und legen Sie die Platte für 30 Minuten wieder in den 37 °C-Inkubator. Ein Volumen von 100 μl EZM reicht aus, um ~10 Tränendrüsen zu injizieren.
   3. Resuspendieren Sie die Organoide in 10 ml Basismedium, um das Enzym auszuwaschen. Pelletieren Sie die Zellen bei 400 x g für 5 Minuten.
   4. Resuspendieren Sie die Zellen (~1.500.000) in 50 μl kaltem humanem Expansionsmedium, ergänzt mit 5% ECM. Legen Sie die Organoid-Suspension auf Eis und fahren Sie sofort mit der Transplantation fort.
2. Orthotope Transplantation bei Mäusen
   1. Lassen Sie in der Tierhaltung die Organoid-Suspension und die Insulinnadeln auf Eis legen. Saugen Sie die Organoid-Suspension in einer kalten Insulinnadel ab.
   2. Sedieren Sie eine NOD scid gamma (NSG) immundefiziente Maus mit 3% Isofluran, um die Anästhesie einzuleiten. Wenn die Maus schläft, legen Sie sie schnell auf die Seite, so dass die Haupttränendrüse (auf halbem Weg zwischen Auge und Ohr) zugänglich ist.
   3. Injizieren Sie 5 μl der organoiden Suspension direkt durch die Haut in die Tränendrüse. Das maximale Volumen, das eine Tränendrüse einer Maus enthalten kann, beträgt 5 μl.
   4. Warten Sie, bis sich die Maus erholt hat, und überwachen Sie die Maus jeden Tag, um das Vorhandensein von Beschwerden im Zusammenhang mit der Transplantation zu beurteilen, insbesondere am Auge.
3. Beurteilen des Transplantats
   1. Opfern Sie die Maus mit_O2/CO_2-Inhalation nach bis zu 90 Tagen, je nachdem, ob eine Kurz- oder Langzeittransplantation beurteilt werden soll¹³.
   2. Die Tränendrüse wird wie in Abschnitt 1 beschrieben präpariert. Fixieren Sie es in 4%igem Formalin für 24 h bei RT.
   3. Legen Sie die Tränendrüse in eine Kassette. Entwässern Sie die Tränendrüse, indem Sie sie wie folgt inkubieren: 2 h in 70% Ethanol, 2 h in 96% Ethanol, 1 h in 100% Ethanol (2x), 2 h in Xylol und über Nacht in flüssigem Paraffin bei 58 °C im Ofen.
   4. Am nächsten Tag die Tränendrüse nach Belieben in einer Metallform ausrichten, mit flüssigem Paraffin auffüllen und den Block auf einer kalten Oberfläche erstarren lassen. Dieser Prozess wird am besten mit einer Einbettmaschine durchgeführt.
   5. Wenn der Paraffinblock fest ist, schneiden Sie den gesamten Block mit einem Mikrotom in 4-5 μm große Abschnitte. Bewahren Sie alle Abschnitte (in Form von Bändern) in einer trockenen, zugfreien Umgebung auf. Die Abschnitte können unbegrenzt bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.
   6. Probieren Sie einen von 10 Abschnitten, die sich über den gesamten Block erstrecken.
      1. Montieren Sie die Abschnitte wie folgt auf einem Objektträger: Geben Sie einen Tropfen Wasser auf den Objektträger, legen Sie den Abschnitt darauf, lassen Sie ihn ~2 Minuten ruhen, damit er sich auf einer 42 °C heißen Platte dehnen kann, und entfernen Sie das Wasser vorsichtig mit Papier.
      2. Legen Sie die Objektträger über Nacht zum Trocknen in einen 58 °C heißen Ofen. Die Folien können über dieses Stadium hinaus auf unbestimmte Zeit bei RT aufbewahrt werden.
   7. Um menschliche Zellen von Mauszellen zu unterscheiden, führen Sie an diesen Abschnitten eine Färbung des menschlichen Kernantigens durch. Rehydrieren Sie die Partien, indem Sie die folgenden Wäschen durchführen: 3 min in Xylol (2x), 1 min in 100% Ethanol (2x), jeweils 1 min in 96% Ethanol, 90% Ethanol, 80% Ethanol, 70% Ethanol, 60% Ethanol und 25% Ethanol und schließlich 1 min in Demi Water (2x).
   8. Die Objektträger werden 15 Minuten lang im PO-Puffer inkubiert (Ergänzende Tabelle 1). Waschen Sie die Objektträger 3x in Reinstwasser.
   9. Führen Sie eine Citrat-basierte Antigenentnahme im Autoklaven durch:
      1. Legen Sie die Objektträger in einen autoklavsicheren Objektträgerhalter in einen mit Citratpuffer gefüllten Korb (Ergänzungstabelle 1). Stellen Sie den Korb in den Autoklaven und führen Sie einen Autoklavenzyklus durch (Druck: 10 PSI; Temperatur: 121 °C; Zeit: 15 min).
      2. Wenn der Autoklav drucklos ist, holen Sie den Korb mit den Objektträgern heraus und legen Sie ihn in ein RT-Wasserbad, um die Objektträger zu RT zu bringen.
         HINWEIS: Die Strategie zur Antigengewinnung hängt vom verwendeten Antikörper ab. Beziehen Sie sich auf das Datenblatt des Anbieters, um die am besten geeignete Antigenentnahme durchzuführen.
   10. Legen Sie die Objektträger horizontal mit der Abschnittsseite nach oben auf eine Inkubationsschale. Fügen Sie 500 μl Blockierungspuffer hinzu, der 1 % Kälberserumalbumin (BSA) in PBS enthält, und inkubieren Sie es 1 Stunde lang. Entfernen Sie den blockierenden Puffer.
   11. Bereiten Sie die Antikörperlösung vor, indem Sie 1 μl humanen nukleolären Antigen-Antikörper zu 500 μl Blockierungspuffer pro zu färbendem Objektträger hinzufügen. Geben Sie die Antikörperlösung in jeden Objektträger. Über Nacht in einer befeuchteten Inkubationsschale bei 4 °C inkubieren.
   12. Waschen Sie die Objektträger am nächsten Tag 3x in PBS. Inkubieren Sie die Objektträger 45 Minuten lang mit unverdünntem HRP-Anti-Maus-Sekundärantikörper. Waschen Sie die Objektträger 3x in PBS.
       VORSICHT. Bereiten Sie in einer Chemikalienhaube den DAB-Puffer vor (Ergänzende Tabelle 1). Inkubieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang mit DAB-Puffer. Entsorgen Sie jegliches Abfallmaterial in Behältern für flüssige organische chemische Abfälle.
   13. Waschen Sie die Objektträger mit Wasser. Inkubieren Sie die Objektträger 2 Minuten lang in Hämatoxylin, um die Kerne gegenzufärben. Waschen Sie die Objektträger 10 Minuten lang unter fließendem Leitungswasser.
   14. Dehydrieren Sie die Objektträger, indem Sie sie jeweils 1 Minute lang in 50 % Ethanol, 60 % Ethanol, 70 % Ethanol, 80 % Ethanol und 90 % Ethanol, 1 Minute in 96 % Ethanol (2x), 1 Minute in 100 % Ethanol (2x) und 1 Minute in Xylol (2x) inkubieren.
   15. Legen Sie die Objektträger mit Montagemedium und Deckglas bei. Nach ca. 20 Minuten Trocknung die Objektträger unter dem Mikroskop betrachten.
   Ich>

Results

Nach der Dissektion der Tränendrüse der Maus (Abbildung 2A) erzeugte die enzymatische und mechanische Verdauung kleine Gewebefragmente, zwischen denen die Acini und Gänge unterschieden werden konnten (Abbildung 2B). Die verbleibenden großen Gewebestücke würden die EZM destabilisieren, was das anfängliche Organoidwachstum verringern würde. Die Ableitung der Tränendrüsenorganoide der Maus war erfolgreich, als zystische Organoide mit einem Durchmesser von ~500 μm nach ~7 Tagen gefunden wurden, dem Stadium, in dem die Organoide bereit waren, gespalten zu werden (Abbildung 2C). Selbst wenn die gesamte Organoid-Ableitung erfolgreich ist, können einige Organoide zu wachsen beginnen, bevor sie schließlich aufhören. Menschliche Tränendrüsenorganoide wuchsen innerhalb von 3-4 Tagen als Zysten heraus und erreichten nach der Gewebeisolierung innerhalb von 10-14 Tagen ihre volle Größe (Abbildung 2D). Sowohl bei Mäusen als auch bei Menschen schlug die Organoid-Ableitung manchmal fehl, da keine oder nur wenige Organoide herauswuchsen. Dies wurde in der Regel durch eine Überverdauung des Gewebes verursacht. Die Tränendrüsenorganoide der Maus konnten mindestens 40-fach und die menschlichen Organoide mindestens 20-fach durchgelassen werden. Die Passage wurde im Durchschnitt alle 7-10 Tage durchgeführt, abhängig vom Organoidwachstum.

Abbildung 2: Etablierung von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen. (A) Fotografien der verschiedenen Stadien der Tränendrüsendissektion der Maus. Der Pfeil zeigt auf die Tränendrüse unter ihrer Schutzmembran. (B) Hellfeldaufnahmen von Tränendrüsenzellen der Maus direkt nach der Gewebeverdauung, mit Einschüben, die einen Acinus und einen Ductus zeigen. (C) Hellfeldbilder einer erfolgreichen und einer erfolglosen Tränendrüsen-Organoid-Ableitung der Maus. (D) Hellfeldbilder des menschlichen Organoid-Auswuchses über einen Zeitraum von 14 Tagen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Die Tränendrüsenorganoide enthalten einen großen Anteil an Stammzellen, wenn sie im Expansionsmedium kultiviert werden. Um ihr Differenzierungsniveau zu erhöhen, haben wir ein Maus- und ein menschliches Differenzierungsmedium mit reduziertem Wachstumsfaktorgehalt eingerichtet. Nach 5 Tagen bzw. 7 Tagen im Differenzierungsmedium wurden die Tränendrüsenorganoide der Maus und des Menschen dichter (Abbildung 3A-B). Diese morphologische Veränderung korrelierte mit erhöhten funktionellen Eigenschaften. Die Applikation des zyklischen AMP-Aktivators Forskolin oder des Neurotransmitters Noradrenalin führte innerhalb von weniger als 3 h zu einer organoiden Schwellung (d. h. apikaler Wassersekretion) (Abbildung 3C). Wenn die Schwellung länger als 3-4 h dauerte, deutete dies darauf hin, dass die Organoide nicht ausreichend differenziert waren und/oder keine funktionellen Marker, wie z.B. Rezeptoren für Neurotransmitter, exprimierten.

Abbildung 3: Differenzierung von Tränendrüsenorganoiden von Maus und Mensch und funktioneller Quellungstest in humanen Organoiden. (A) Hellfeldbilder von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen, die 7 Tage lang in Expansionsmedium und nach 2 Tagen in Expansionsmedium für 5 Tage in Expansionsmedium kultiviert wurden. (B) Hellfeldbilder von menschlichen Tränendrüsenorganoiden, die 11 Tage lang in Expansionsmedium und nach 2 Tagen in Expansionsmedium 9 Tage lang in Expansionsmedium kultiviert wurden. (C) Hellfeldbilder von differenzierten menschlichen Tränendrüsenorganoiden, die über einen Zeitraum von 3 h mit frischem Differenzierungsmedium (Kontrolle) mit 1 μM Forskolin und 100 μM Noradrenalin exponiert wurden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Um Pax6 in Tränendrüsenorganoiden der Maus auszuschalten, wurde mittels PCR und Ligation ein Plasmid erzeugt, das die ausgewählte Pax6-gerichtete gRNA enthielt (Abbildung 4A). Dieses gRNA-haltige Plasmid wurde zusammen mit den Piggy-Bac-Plasmiden (Hygromycin-Resistenz-Transposon-haltige und Transposase-enthaltende Plasmide) und dem C>T-Basen-Editor Cas9 in in in Einzelzellen dissoziierten Tränendrüsenorganoiden der Maus elektroporiert. Nach 3 Tagen, als sich die Organoide erholt hatten, wurden sie Hygromycin ausgesetzt, um Klone auszuwählen, die die Hygromycin-Resistenzkassette enthalten hatten. In erfolgreichen Elektroporationen wuchsen Organoide heraus, die gegen Hygromycin resistent waren (Abbildung 4B). Die wachsenden Organoid-Klone, die größer als ~300 μm waren, wurden ausgewählt, idealerweise bevor sie begannen, sich spontan zu differenzieren (Abbildung 4C). Die DNA wurde aus einem Teil des Organoids extrahiert, während der Rest in Kultur blieb. Die PCR-Amplifikation des Pax6-Locus, auf den die gRNA abzielt, ergab eine 367 bp-Bande für jeden der ausgewählten Klone (Abbildung 4D). Nach der Sequenzierung des amplifizierten Locus wurden Klone behalten, die homozygot C > T editiert wurden (n = 1). Andererseits wurden Klone, die nicht editiert (n = 4), heterozyg editiert oder falsch editiert (n = 1) waren, verworfen (Abbildung 4E). Insgesamt wurde mit dieser gRNA, die auf Pax6 abzielt, ein homozygoter Knock-out-Tränendrüsenklon der Maus aus sechs sequenzierten Sequenzen erhalten. Einige Klone wuchsen gut, aber einige Organoid-Klone gingen nach der Ernte verloren oder begannen sich zu differenzieren (Abbildung 4F). Von den 10 ausgewählten Organoid-Klonen wuchsen 7 gut heraus.

Abbildung 4: Base Editing-vermittelter Knock-out von Pax6 in Tränendrüsenorganoiden der Maus. (A) Sanger-Sequenzierungsspur von pFYF1320 nach korrekter Integration der gRNA, die auf den Pax6-Locus abzielt. (B) Hellfeldbilder von Tränendrüsenorganoiden der Maus 5 Tage nach Hygromycin-Exposition nach Elektroporation. Die Organoide wurden in Maus-Expansionsmedium kultiviert. Auf der linken Seite ist ein Beispiel für eine fehlgeschlagene Elektroporation zu sehen, bei der kein Klon herauswächst, der gegen Hygromycin resistent ist. Rechts sehen Sie ein Beispiel für eine erfolgreiche Elektroporation, bei der mehrere Hygromycin-resistente Organoid-Klone überlebt haben. (C) Hellfeldbilder von Klonen, die ausgewählt werden sollten, und Klone, die nicht ausgewählt werden sollten. (D) Agarose-Gel, das die Amplifikation des Pax6-Locus zeigt, der mit der gRNA anvisiert wird. In Grün ist das Band mit der erwarteten Größe von 367 bp hervorgehoben. (E) Sanger-Sequenzierungsspur von drei Organoid-Klonen, die gegen Hygromycin resistent waren. Der oberste Klon ist unbearbeitet. Der mittlere Klon ist ein homozygoter C>T-Klon und somit ein homozygoter Knock-out. Der untere Klon weist zwei heterozygote Punktmutationen auf und ist entweder ein heterozygoter Knock-out oder ein gemischter Klon und wurde falsch editiert. (F) Hellfeldbilder der ausgewählten Organoid-Klone mit unterschiedlichem Auswuchs. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Um schließlich eine organoide orthotope Transplantation der menschlichen Tränendrüsen bei Mäusen durchzuführen, wurden Organoide verwendet, die 3 Tage im Voraus gespalten wurden (< 100 μm Durchmesser). Die Organoidtransplantation wurde 1 Monat nach der Injektion der Organoide in die Tränendrüse der Maus durch Färbung auf einen humanspezifischen Marker, das humane nukleoläre Antigen, bestätigt (Abbildung 5). Das Fehlen einer punktförmigen Färbung in allen Abschnitten der Tränendrüse der Maus deutete auf ein Fehlen einer humanen Organoidtransplantation hin.

Abbildung 5: Transplantation von menschlichen Tränendrüsenorganoiden in die Tränendrüse der Maus. Färbung der transplantierten Tränendrüsen der Maus für den humanen Nukleolenmarker zur Überwachung des Transplantats 1 Monat nach der Transplantation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Ergänzende Tabelle 1: Zusammensetzung der Medien und Puffer. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt die Etablierung und Verwendung von Tränendrüsenorganoiden für funktionelle Assays, Mutationsmodellierung und Transplantation. Bei der Etablierung von Tränendrüsenorganoiden von Mäusen und Menschen ist die Gewebedissoziation von entscheidender Bedeutung. Wenn das Gewebe nicht ausreichend verdaut ist, ist die Organoidausbeute gering. Wenn das Gewebe überverdaut wird, sterben die Zellen ab und wachsen nicht als Organoide heraus. Jedes Gewebe sollte für eine bestimmte Zeit mit einem bestimmten Enzym verdaut werden, um ein optimales Organoidwachstum^{zu gewährleisten 14,17,18}. Die Tränendrüse ist ein eher weiches Gewebe, bei dem ein Kollagenaseverdau von 5-10 min in Kombination mit pipettierbasierter mechanischer Dissoziation ausreicht, um kleine Gewebestücke zu isolieren. Wenn Einzelzellen für Anwendungen wie die Einzelzell-RNA-Sequenzierung gewonnen werden müssen, kann die Dissoziation länger durchgeführt werden, bis das Einzelzellstadium erreicht ist, aber die Dissoziation sollte gestoppt werden, sobald Einzelzellen erhalten werden, um eine Abnahme der Lebensfähigkeit zu begrenzen. Da die Dissoziation des Gewebes so wichtig ist, ist eine Überverdauung der wahrscheinlichste Grund für das Versagen der organoiden Etablierung der Tränendrüsen.

Die richtige Pflege von Tränendrüsenorganoiden ist wichtig für ihre Verwendung. Die Langzeiterhaltung ist ein Kennzeichen von Tränendrüsenorganoiden aus adulten Stammzellen im Vergleich zu Organoiden aus induzierten pluripotenten Stammzellen ^7,17. Um eine langfristige Erhaltung zu erreichen, sollten regelmäßige Organoid-Spaltungen und Mediumwechsel durchgeführt werden. Andernfalls beginnen sich Organoide zu differenzieren und entwickeln ein vermindertes Stammzellpotenzial, was ihre langfristige Erhaltung behindert⁷. Auch in diesem Schritt kann eine Überverdauung die Stammzellen abtöten und die Aufrechterhaltung der Organoide beeinträchtigen. Für die regelmäßige Aufrechterhaltung ist eine organoide Dissoziation in einzelne Zellen nicht erforderlich. Um jedoch klonale Knock-out-Organoidlinien zu erzeugen, ist es wichtig, mit einzelnen Zellen zu beginnen. Ist dies nicht der Fall, bestehen die Organoide aus einem Mosaik von Zellen mit unterschiedlichem genetischen Hintergrund, was die Analyse des Effekts einer einzelnen, definierten Mutation unmöglich macht. Hier beschreiben wir die Verwendung eines C>T-Basiseditors zum Erzeugen von Stop-Codons. Dieser Genom-Editor beruht auf dem Vorhandensein von Arginin-, Glutamin- oder Tryptophan-Codons innerhalb von 12-18 Basen von einem NGG-PAM. Wenn diese Bedingungen beim Design einer gRNA nicht erfüllt sind, können konventionelle Cas9- oder C>T-Baseneditoren mit alternativen PAMs verwendet werden ^7,18. Konventionelles Cas9 führt jedoch zu doppelsträngigen Brüchen, die bei der Reparatur¹¹ zu Indels führen. Da beide Allele unterschiedliche Indels beherbergen können, ist bei der Klongenotypisierung zusätzliche Vorsicht geboten. Die Entfaltung der eingeführten Modifikationen sollte durchgeführt werden, um sicherzustellen, dass beide Allele Out-of-Frame-Indels enthalten und somit die Organoid-Klone für das Gen¹⁹ ausgeschaltet werden. Der Vorteil von C>T-Baseneditoren liegt darin, dass sie zur Modellierung von Punktmutationen verwendet werden können, die nicht zwangsläufig zu Stop-Codons führen. Sie können beispielsweise verwendet werden, um spezifische Pax6-Mutationen zu modellieren, die bei Patienten mit Aniridie gefunden wurden, um ihre Auswirkungen auf die Tränendrüsenphysiologie zu untersuchen²⁰.

Die Tränendrüse sondert den wässrigen Teil des Tränenfilms¹ ab. Die Tränensekretion kann in humanen Organoiden nach Differenzierung durch Wachstumsfaktorentzug und NOTCH-Hemmung rekapituliert werden. Unter diesen Bedingungen werden Organoide terminal differenziert und können nicht weiter aufrechterhalten werden. Differenzierte Tränendrüsenorganoide können jedoch die Entwicklung von tränenauslösenden Medikamenten im Zusammenhang mit der Erkrankung des trockenen Auges steuern, möglicherweise in Hochdurchsatz-Screenings. Der in diesem Protokoll vorgestellte Tränen-Assay ist derjenige, der derzeit die größte Änderung der Organoidgröße in kurzer Zeit liefert, was die Quantifizierung im Rahmen eines Arzneimittelscreenings erleichtert ^7,9,17.

Die Stammzelltherapie ist vielversprechend für die Regeneration der Tränendrüsen bei Erkrankungen des trockenen Auges²¹. Aus adulten Stammzellen gewonnene Tränendrüsenorganoide könnten ein Ausgangsmaterial für solche Anwendungen sein. Das hier vorgestellte Protokoll führt zu einer Organoid-Transplantation der menschlichen Tränendrüse, meist in Form von Zysten. Ein geringes Organoid-Engraftment kann dadurch entstehen, dass Organoide an der falschen Stelle injiziert werden. Das Trainieren des Injektionsvorgangs mit einem Farbstoff ermöglicht die Verfolgung der Injektionsstelle und verbessert letztendlich die Injektionsgenauigkeit. Alternativ kann die Epidermis der Maus so eingeschnitten werden, dass sie direkten Zugang zur Tränendrüse hat, wie es bei Ratten vor^{dem 22. Lebensjahr} der Fall war. Diese Methode dauert länger, kann aber genauer sein. Andererseits integrierten sich die Organoide mit dem vorliegenden Protokoll nicht funktionell in die Tränendrüse der Maus. Ähnliche Ergebnisse wurden für das Tränendrüsentransplantat aus iPS-Zellen beobachtet²². Die Transplantationsmethode könnte weiter verbessert werden, indem die Tränendrüse vorab verletzt wird, ein Mausmodell des trockenen Auges verwendet wird und/oder die Organoide als Einzelzellen oder kleine Klumpen injiziert werden. Nichtsdestotrotz können aus adulten Stammzellen gewonnene Tränendrüsenorganoide und das dazugehörige Toolkit die Grundlage für zukünftige Anwendungen in der Tränendrüsenforschung und der regenerativen Medizin sein.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,5 mL Safe-Lock Zentrifugenröhrchen	Eppendorf	EP0030 120.094
3,3′-Diaminobenzidin tetrahydrochloride hydrate (DAB)	Sigma-Aldrich	D5637	CAS: 868272-85-9 , ACHTUNG, 6 g/L Lösung kann aliquotiert bei -20 &de; C
5x grüner GoTaq Flexi Puffer	Promega	M891A	Bei -20 > lagern; C
A83-01	Tocris	2939	Bei -20 °C lagern; C, Bestand bei 30 mM, 10000x
Advanced DMEM/F12	Invitrogen	12634-010	Lagern bei 4 > C
Agarplatten mit Ampicillin	Hubrecht Institute
Ampicillin Natriumsalz	Sigma-Aldrich	A9518
Autoklav VAPOUR-Line lite	VWR Chemikalien
B27 Ergänzung	Invitrogen	17504-044	Bei -20 &/Grad lagern; C, 50x
BD Micro-Fine Insulinnadel 1 mL	BD Bioscience	324825
Tischmikroskop DMI1	Leica
Rinderserumalbumin (BSA)	MP biomedizinisch	160069	Bei 4 & deg lagern; C
BTXpress	BTX	MDS450805
C57BL/6 Mäuse	Hubrecht Institute
Kassetten	Klinipath	410-02S
CellBanker 1	amsbio	11910	Kryokonservierungsmedium, Anweisungen befolgen
Zentrifuge	Eppendorf
Zitronensäure-Monohydrat	J.T. Baker	0088	CAS: 5949-29-1
Kollagenase I	Sigma Aldrich	C9407	Aliquots bei 20 mg/ml, 20x, lagern bei -20 &de; C
Konische Röhrchen 15 mL	Greiner Bio-One	5618-8271
Konische Röhrchen 50 mL	Corning	CLS430828-500EA
Deckgläser 24 mm x 50 mm	Menzel-Glä zer	BB024050S1
Cultrex Basalmembran-Extrakt (BME), Wachstumsfaktor reduziert, Typ 2 - extrazelluläre Matrix	R& D Systems, Bio-Techne	3533-001-02	Lagern bei -20 ° C, bei 4 Grad halten; C für bis zu 1 Monat
DAPT	Sigma Aldrich	D5942	Lagern bei -20 ° C, Lager bei 10 mM, 1000x
Dinatriumhydrogenphosphat wasserfrei	VWR Chemikalien	28026.292	CAS: 7558-79-4
Di-Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat	Sigma-Aldrich	71643	CAS:10028-24-7
Dispase	ThermoFisher Scientific	17105-041	Aliquote bei 50 U/ml, lagern bei -20 ° C bis zum Gebrauch, 400x
Einweg-Skalpell Steril N° 10	Swann Morton	3033838
DM4000 Mikroskop	Leica
dNTPs 25 mM	Promega	U1420	Alle 4 Nukleotide miteinander mischen, lagern bei -20 > C
Dpn1	New England Biolabs	R0176
Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS)	Gibco	14190144	1x
Easy Siebe 70 &; Mikro; m	Greiner	542170
Elektroporationsküvette	Nepagene	EC002S
EnVision+/HRP Maus	Agilent	K400111-2
Ethanol 100%	BOOM	84045206; 5000	VORSICHT, Zur Herstellung anderer Ethanolverdünnungen verwenden
Ethanol 70%	BOOM	84010059.5000	VORSICHT
Ethanol 96%	BOOM	84050065.5000	VORSICHT
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System	ThermoFisher Scientific		Live-Imaging Hellfeldmikroskop
FGF10	Peprotech	100-26	Lagern bei -20 ° C, Lagerbestand bei 100 mg/mL im Basismedium, 100x
Fiji	NIH, Fidschi Entwickler
Formaldehydlösung 4%	Sigma-Aldrich	1.00496	CAS: 50-00-0, VORSICHT
Forskolin	Tocris	1099	Bei -20 ° C, Lagerbestand bei 10 mM, 10000x
Glutamax	Gibco	35050-061	100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase	Promega	M7805	Lagern bei -20 ° C
Hämatoxylin	VWR Chemikalien	10047105	Bei Raumtemperatur
lagern HEPES	Gibco	15630-080	Bei 4 Grad lagern; C, 100x
Histocore H und C, Gewebeeinbettungsmaschine	Leica
Heizplatte	Meidax
Humanes nukleoläres Antigen Antikörper	Abcam	ab-190710
Salzsäure 5 N	ThermoFisher Scientific	10605882	CAS: 7647-01-0, VORSICHT
Wasserstoffperoxid 30%	Chem-lab	CL00.2308.1000	CAS: 7722-84-1, VORSICHT
Hygromycin B-Gold	InvivoGen	ant-hg	Bestand in 100 mg/µ L, 1000x
Hygromycin-Resistenz kassettenhaltiges Plasmid			Andersson-Rolf et al., Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo 100%	Mecan	5960501
LB medium	Hubrecht Institute
MgCl2 25 mM	Promega	A351H	Lagern bei -20 ° C
Mikrotom RM2235	Leica
Midiprep DNA-Isolationskit	ThermoFisher Scientific	K210005
Miniprep DNA-Isolationskit	ThermoFisher wissenschaftliches	K210003
N-Acetylcystein	Sigma Aldrich	A9165	Lagern bei -20 ° C, Lager bei 500 mM, 400x
NEPA21 Elektroporator	Nepagene
Nicotinamid	Sigma Aldrich	N0636	Lagern bei -20 ° C, Lagerbestand bei 1M, 100x
NOD Scid Gamma (NSG) Mäuse	Hubrecht Institute Kolonie
Noggin konditioniertes Medium	U-Protein Express	Custom Order	Store bei -20 ° C
Noradrenaline	Sigma Aldrich	A7257	Lagern bei -20 °; C, vorrätig bei 100 mM
Ofen	Memmert		Set bei 58 μd; C
P20, P200 und P1000 Pipetten	Gilson
Paraffin	VWR Chemikalien	10048502
Pasteurpipetten, glasverstopft	ThermoFisher Scientific	1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG	IDT
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC	IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFP	Addgene	112101
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-122	Bei -20 > lagern; C
Pertex	Klinipath	AM-08010
pFYF1320	Addgene	47511
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1	1000X, lagern bei -20 ° C
Prostaglandin E2 (PGE2)	Tocris	2296	Bei -20 ° lagern; C, Lagerbestand bei 10 mM, 10000x
Petrischale, 10 cm	Greiner	633102
Q5 Puffer	New England Biolabs	B9027S
Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase	New England Biolabs	M0491S
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28704
QuickExtract DNA-Extraktionslösung	Lucigen	QE09050	Aliquote lagern bei -20 &°; C
R-Spondin 3 konditioniertes Medium	U-Protein Express	Custom Order	Lagern bei -20 & Grad; C
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCAAG	IDT
Folien	StarFrost	MBB-0302-55A	Klebstoff, gemahlen
Natriumazid	Merck	8.22335.1000	CAS: 26628-22-8, VORSICHT
Natriumcytrat-Dihydrat	J.T. Baker	0280	CAS: 6132-04-3
Standard Forward Primer: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG TTAAAATAAGGC	IDT
Subklonierungseffizienz kompetente Zellen DH5alpha	Invitrogen	18265-017
Suspensionszellkulturplatten (24 Well)	Greiner Bio-One	662102	24 Wells
Suspensionszellkulturplatten (12 Well)	Greiner Bio-One	665102	12 Wells
T4 DNA-Ligase	New England Biolabs	M0202
TAE-Puffer	ThermoFisher Scientific	B49	Bestand bei 50x, verdünnt auf 1x mit Reinstwasser
Transposase-haltiges Plasmid			Andersson-Rolf et al., Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express Enzym	Invitrogen	12605-028	bei 4 & deg lagern; C
U6_Forward Grundierung: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT	IDT
UltraPure Agarose 1000	Invitrogen	16550
Wasserbad	Tulabo
Xylol	Klinipath	4055-9005	CAS: 1330-20-7, VORSICHT
Y-27632	Abmole Bioscience	Y-27632 Dihydrochlorid	Bei -20 & deg lagern; C, Lager bei 10 mM, 1000x