Automatisierte multimodale Stimulation und simultane neuronale Ableitung von mehreren kleinen Organismen

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode zur flexiblen chemischen und multimodalen Stimulation und Aufzeichnung simultaner neuronaler Aktivität von vielen Caenorhabditis elegans-Würmern vor. Diese Methode nutzt Mikrofluidik, Open-Source-Hard- und Software sowie überwachte automatisierte Datenanalyse, um die Messung neuronaler Phänomene wie Anpassung, zeitliche Hemmung und Reizübersprechen zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Fluoreszierende genetisch kodierte Kalziumindikatoren haben wesentlich zu unserem Verständnis der neuronalen Dynamik von der Ebene einzelner Neuronen bis hin zu ganzen Gehirnschaltkreisen beigetragen. Neuronale Reaktionen können jedoch aufgrund früherer Erfahrungen, interner Zustände oder stochastischer Faktoren variieren, so dass Methoden erforderlich sind, die die neuronale Funktion bei vielen Individuen gleichzeitig bewerten können. Während die meisten Aufzeichnungstechniken jeweils ein einzelnes Tier untersuchen, beschreiben wir die Verwendung der Weitfeldmikroskopie, um neuronale Aufzeichnungen auf Dutzende von Caenorhabditis elegans oder anderen Organismen im Submillimeterbereich gleichzeitig zu skalieren. Open-Source-Hardware und -Software ermöglichen eine große Flexibilität bei der Programmierung vollautomatischer Experimente, die die Intensität und das Timing verschiedener Stimulustypen steuern, einschließlich chemischer, optischer, mechanischer, thermischer und elektromagnetischer Reize. Insbesondere mikrofluidische Durchflussgeräte ermöglichen eine präzise, wiederholbare und quantitative Steuerung chemosensorischer Reize mit einer Zeitauflösung von weniger als einer Sekunde. Die halbautomatische Datenanalyse-Pipeline von NeuroTracker extrahiert dann individuelle und populationsweite neuronale Reaktionen, um funktionelle Veränderungen in der neuronalen Erregbarkeit und Dynamik aufzudecken. In diesem Artikel werden Beispiele für die Messung der neuronalen Adaptation, der zeitlichen Hemmung und des Stimulus-Crosstalks vorgestellt. Diese Techniken erhöhen die Präzision und Wiederholbarkeit der Stimulation, ermöglichen die Erforschung der Populationsvariabilität und sind auf andere dynamische Fluoreszenzsignale in kleinen Biosystemen von Zellen und Organoiden bis hin zu ganzen Organismen und Pflanzen verallgemeinerbar.

Einleitung

Calcium-Bildgebungsverfahren haben die nicht-invasive Aufzeichnung der neuronalen Dynamik in vivo in Echtzeit mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie und genetisch kodierten Calciumindikatoren, die in Zielzellen exprimiert werden, ermöglicht ^1,2,3. Diese Sensoren verwenden in der Regel ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), wie z. B. die GFP-Calmodulin-M13-Peptidfamilie (GCaMP), um die Fluoreszenzintensität bei neuronaler Aktivierung und erhöhten intrazellulären Kalziumspiegeln zu erhöhen. Die Kalzium-Bildgebung hat sich beim Fadenwurm C. elegans als besonders leistungsfähig erwiesen, um zu untersuchen, wie Neuronen und neuronale Schaltkreise in lebenden, sich verhaltenden Tieren funktionieren 4,5,6,7,8,9,10, da ihre transparente Natur bedeutet^, dass kein chirurgischer Prozess für den optischen Zugang erforderlich ist und zellspezifische Genpromotoren die Expression auf die interessierenden Zellen abzielen. Bei diesen Techniken kommen häufig mikrofluidische Geräte zum Einsatz, die präzise kontrollierte Umgebungen bieten, um biologische, chemische und physikalische Phänomene auf kleinem physikalischen Maßstab zu untersuchen^11,12. Mikrofluidische Geräte zur Messung der neuronalen Aktivität gibt es in Hülle und Fülle, wobei ständig neue Designs entwickelt werden, und sie werden leicht im Forschungslabor hergestellt. Bei vielen Konstruktionen wird jedoch jeweils ein einzelnes Tier gefangen, was den experimentellen Durchsatz begrenzt ^7,9,13. Neuronale Reaktionen variieren oft erheblich zwischen den Tieren, was auf Unterschiede in früheren Erfahrungen, inneren Zuständen wie Stress oder Hunger oder stochastischen Faktoren wie der Genexpression zurückzuführen ist. Diese Unterschiede begründen den Bedarf an Methoden, die gleichzeitig viele Tiere stimulieren und beobachten und Informationen von Individuen extrahieren können⁴.

Darüber hinaus zeigen sich bestimmte neuromodulatorische Phänomene erst unter bestimmten Stimulationsbedingungen, wie z. B. die zeitliche Hemmung¹⁴, die sich auf die kurzzeitige Unterdrückung von Reaktionen bezieht, wenn die Stimulation in schneller Folge erfolgt. Elektrophysiologische Systeme können zu diesem Zweck die neuronale Aktivität über einen breiten Reizraum steuern, indem sie beispielsweise den elektrischen Impulsstrom, die Spannung, die Frequenz, die Wellenform, das Tastverhältnis und das Timing periodischer Reizzüge modulieren. Die indirekte Stimulation durch natürlich detektierte Reize oder optogenetische Systeme würde von einer ähnlichen Bandbreite an Kontrollmechanismen profitieren. Gegenwärtig werden viele natürliche Reize auf einfache "On-Off"-Weise präsentiert, wie z. B. die Geruchspräsentation und -entfernung, wobei kommerzielle Systeme verwendet werden, die nur langsam Flexibilität bieten. Kostengünstige Mikrocontroller können nun jedoch die Abgabe verschiedener Arten von Stimuli auf eine Weise automatisieren, die an die Bedürfnisse der Forscher angepasst werden kann. In Kombination mit der Mikrofluidik haben diese Systeme das Ziel erreicht, den experimentellen Durchsatz und die Flexibilität zu erhöhen, so dass neuronale Reaktionen auf eine Vielzahl präziser Reize bei vielen Tieren gleichzeitig gemessen werden können ^4,6. Die multimodale Stimulation kann verwendet werden, um die neuronalen Schaltkreise weiter abzufragen, z. B. durch die Überwachung von Veränderungen der neuronalen Erregbarkeit bei konsistenter Stimulation vor, während und nach einer orthogonalen Störung, wie z. B. einer Arzneimittelexposition⁴. Die Vorteile kostengünstiger, offener Mikroskopiesysteme liegen auf der Hand, um die wissenschaftliche Forschung voranzutreiben, doch in der Praxis kann die Notwendigkeit der Beschaffung, Konstruktion und Leistungsvalidierung von Teilen die Einführung dieser Techniken behindern.

Dieses Protokoll zielt darauf ab, einige dieser technischen Herausforderungen zu entschärfen. Während sich frühere Protokolle auf die Verwendung mikrofluidischer Vorrichtungen und die grundlegende Stimulation ^9,15,17 konzentriert haben, beschreiben wir hier die Konstruktion und Verwendung eines flexiblen, automatisierten, multimodalen Stimulusabgabesystems für die neuronale Bildgebung in C. elegans oder anderen kleinen Organismen unter Verwendung zuvor beschriebener mikrofluidischer Vorrichtungen⁴. Das Open-Source-System wird über einfache Textdateien programmiert, um die Experimente zu definieren, und das NeuroTracker-Datenanalyseprogramm extrahiert halbautomatisch die neuronalen Aktivitätsdaten aus den Mikroskopvideos. Wir demonstrieren dieses System anhand von Beispielen zur Beurteilung der zeitlichen Hemmung, Enthemmung und des Reizübersprechens mit Hilfe des chemosensorischen Neurons AWA, das als Reaktion auf verschiedene Lebensmittelgerüche oder als Reaktion auf Licht depolarisiert, wenn optogenetische lichtempfindliche Ionenkanäle exprimiert^{werden 5,6}.

Protokoll

1. Neuronale Bildgebungsgeräte

HINWEIS: In Lawler und Albrecht¹⁵ finden Sie detaillierte Anweisungen zum Aufbau des Bildgebungs- und Stimulationssystems, das den Zeitpunkt der Mikroskopbeleuchtung, die Bildaufnahme und die Stimulusabgabe steuert (Abbildung 1). Ein preiswerter Arduino Nano Stimulusregler steuert die fluidischen Ventile durch digitale Signale an einen Ventilregler und steuert die optogenetische Beleuchtung durch analoge Spannungssignale an einen LED-Controller. Andere Reize, wie z. B. Vibrationsmotoren und thermische Heizer, können über digitale oder analoge Signale gesteuert werden. Der Stimulusregler synchronisiert die Stimulation und die Bildaufzeichnung über Kamerasignale, wie sie von der Open-Source-Mikroskopsteuerungssoftware Micro-Manager (μManager) spezifiziert ^werden16. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Reagenzien, Geräten und Organismen, die in diesem Protokoll verwendet werden.

1. Richten Sie die neuronale Bildgebungsausrüstung ein, einschließlich eines Epifluoreszenzmikroskops mit GFP-Optik, einer sCMOS-Kamera mit einem digitalen Belichtungsausgangssignal und eines Stimulusreglers¹⁵.
2. Verbinden Sie den Stimulusregler über digitale oder analoge Signale mit den gewünschten Systemen. Für die unten vorgestellten Beispiele werden die folgenden Systeme verwendet:
   1. Verwenden Sie einen Ventilregler für die chemische Stimulation. Schließen Sie die Ventilsteuerung an fluidische Magnet- oder Quetschventile an (Abbildung 1)¹⁵.
   2. Verwenden Sie eine rote 615-nm-LED und einen Controller für die optogenetische Stimulation, die über dem Mikroskoptisch montiert sind.
3. Richten Sie den Computer mit der Mikroskopsteuerungssoftware ein, erstellen Sie eine Konfigurationsvoreinstellung mit Geräteeinstellungen und stellen Sie sicher, dass die Stimulussteuerung¹⁵ ordnungsgemäß funktioniert.

2. Herstellung mikrofluidischer Geräte

HINWEIS: Siehe Lagoy et ^al.17 für detaillierte Informationen über die Beschaffung oder Herstellung der Urformen und die Herstellung, Verwendung und Reinigung der mikrofluidischen Geräte. Diese Schritte sind im Folgenden zusammengefasst.

1. Besorgen oder fertigen Sie eine Urform unter Verwendung der bereitgestellten mikrofluidischen Konstruktionsdatei (albrechtlab.github.io/microfluidics)¹⁷. Bei jungen erwachsenen C. elegans ist darauf zu achten, dass die Kanalhöhe 55-70 μm beträgt.
2. Kombinieren Sie die PDMS-Basis und den Härter im Gewichtsverhältnis 10:1 und mischen Sie sie gründlich mit Transferpipetten.
3. 30-60 min in einem Vakuumexsikkator entgasen, bis die Blasen verschwinden.
4. Stellen Sie die Urform in eine große Petrischale (150 mm Durchmesser) und gießen Sie das entgaste PDMS bis zu einer Tiefe von 4-5 mm (~100 g) ein. Überprüfen und entfernen Sie Staub oder Blasen mit einer Transferpipette.
5. Bei 65 °C auf ebener Schiene 3 h bis über Nacht backen.
6. Verwenden Sie nach dem Aushärten ein Skalpell, um das PDMS aus der Form zu schneiden, und eine Rasierklinge, um die Geräte zu trennen.
7. Stanzen Sie die Einlass- und Auslasslöcher mit einer 1-mm-Hautstanze und reinigen Sie sie mit dH 2 O, Ethanol und erneut mitdH₂O. Trocknen Sie das Gerät in einem Luftstrom (siehe Abbildung 2A).
8. Reinigen Sie beide Seiten des PDMS-Geräts mit Klebeband und entfernen Sie Staub oder Schmutz.
9. Bereiten Sie die Objektträger vor, um die mikrofluidische Vorrichtung wie beschrieben¹⁷ fertigzustellen. Bohren Sie mit einem Diamantbohrer Einlasslöcher in den oberen Schieber und machen Sie den unteren Schieber hydrophob, indem Sie TFOCS-Dämpfen ausgesetzt werden oder eine wasserabweisende Glasbehandlung auftragen (Abbildung 2B).
10. Montieren Sie das Glas-PDMS-Geräte-Sandwich zu einer Klemme (Abbildung 2C).

3. Vorbereitung der Tiere

1. Erhalten oder erzeugen Sie Tiere mit genetisch kodierten Kalziumindikatoren, die in den interessierenden Neuronen exprimiert werden.
   HINWEIS: Beispiel: Die Zeile NZ1091 (kyIs587 [gpa-6p::GCaMP2.2b; unc-122p::d sRed]; kyIs5662 [odr-7p::Chrimson:SL2:mCherry; elt-2p::mCherry]) exprimiert GCaMP und den rotlichtsensitiven Kationenkanal Chrimson im AWA-sensorischen Neuronenpaar⁶. Beide Transgene werden in das Genom integriert, um eine stabile Expression in jedem Tier zu gewährleisten.
2. Einen Tag vor dem Experiment werden mindestens 20 L4-Larven im Stadium C. elegans pro Experiment auf eine Nematoden-Agarplatte (NGM) gelegt, die mit einem OP50 E. coli-Rasen besiedelt ist. Bei einer Temperatur von 20 °C werden die Wildtyp-Tiere am nächsten Tag im Stadium der jungen Erwachsenen synchronisiert.
   HINWEIS: Wählen Sie bei Array-Transgenen Tiere mit einem Fluoreszenzstereoskop aus, um die Transgenexpression in den ausgewählten Tieren sicherzustellen.

4. Lösungsvorbereitung

1. Aus einer 10-fachen Stammlösung wird 1x S Basalpuffer (100 mM NaCl und 0,05 M_KPO4, pH 6,0) hergestellt.
2. Bereiten Sie 1 mM Tetramisol-Puffer vor, indem Sie 1 M Stamm in 1x S Basal verdünnen. Verwenden Sie diesen lähmenden Puffer, um alle Reize vorzubereiten. Ein Experiment verbraucht in der Regel etwa 150 ml.
3. Geben Sie 0,1-1 μg/ml Fluorescein in die "Kontroll"-Pufferreservoire, um den Fluss zu visualisieren.
4. Erzeugen Sie Stimuluslösungen durch serielle Verdünnung auf die gewünschte Endkonzentration. Erstellen Sie beispielsweise eine 10⁻ 7-Verdünnung des Diacetyllockstoffs, indem Sie zuerst eine 10^−3-Aktie erstellen.
   Anmerkungen: Eine kleine Menge Fluorescein (0,1–1 μg/ml) kann der Stimulus- oder Pufferlösung zugesetzt werden, um das Timing des Stimulus zu überprüfen, aber die Konzentration sollte minimal sein, um Artefakte in der neuronalen Fluoreszenz zu vermeiden.

5. Vorbereitung des mikrofluidischen Geräts

HINWEIS: Siehe Reilly et ^al.9 für ein Videoprotokoll, das die Reservoirerzeugung, die Geräteeinrichtung und das Laden der Tiere zeigt. Siehe auch Lagoy et ^al.17 für ein schriftliches Protokoll mit vielen hilfreichen Tipps.

1. Bereiten Sie drei oder mehr Flüssigkeitsbehälter vor. Befestigen Sie jeweils ein 30-ml- oder 60-ml-Spritzenreservoir, eine 3-ml-Ansaugspritze und einen Nadelstummel an einem Dreiwege-Luer-Ventil (Abbildung 2D). Verbinden Sie die Nadel mit einem Mikrobohrungsschlauch, der am Ende mit einem Metallrohr versehen ist. Beschriften Sie die Reservoirs, montieren Sie sie auf einem Gestell, das an einem Ringständer befestigt ist, und füllen Sie sie mit den entsprechenden Puffer- oder Stimulusflüssigkeiten (Abbildung 2E).
2. Entgasen Sie das zusammengebaute mikrofluidische Gerät in einem Vakuumexsikkator für ~1 h.
3. Füllen und entfernen Sie die Luftblasen mit der Ansaugspritze aus dem Reservoirschlauch. Füllen Sie den Abflussschlauch mit Puffer.
4. Nehmen Sie das mikrofluidische Gerät aus dem Vakuum, führen Sie schnell den Auslassschlauch ein und injizieren Sie die Flüssigkeit durch das Gerät, bis ein Tröpfchen aus einem Einlass austritt.
5. Verwenden Sie an diesem Einlass eine "Tropfen-zu-Tropfen"-Verbindung¹⁷ , um das entsprechende fluidische Einlassrohr einzuführen (2F). Stellen Sie sicher, dass Flüssigkeitstropfen sowohl am Einlassschlauch als auch am Anschlussloch des Geräts vorhanden sind, um das Eindringen einer Blase zu vermeiden.
6. Injizieren Sie mehr Flüssigkeit aus dem Auslass, schließen Sie das nächste Einlassrohr an und wiederholen Sie den Vorgang, bis alle Einlässe gefüllt sind. Setzen Sie einen soliden Sperrstift an allen unbenutzten Einlässen und der Schneckenladeöffnung ein.
7. Initiieren Sie den Durchfluss, indem Sie die Einlass- und Auslass-Luer-Ventile öffnen. Überprüfen Sie das Gerät auf Undichtigkeiten an den Einlässen und am Glasboden. Untersuchen Sie das Gerät mit der Mikroskopbilderfassungssoftware im Live-Modus auf Blasen in den Strömungskanälen oder -einlässen.
   Anmerkungen: Wenn Blasen vorhanden sind, warten Sie, bis sie in das PDMS-Material eingezogen sind.

6. Verladung der Tiere

HINWEIS: Siehe Lagoy et ^al.17.

1. Übertragen Sie junge erwachsene Tiere mit einem "Pick" mit Drahtspitze auf eine unbesäte NGM-Agarplatte.
2. Fluten Sie die Platte mit ca. 5 ml 1x S Basalpuffer, so dass die Tiere schwimmen.
3. Ziehen Sie die Würmer in eine Ladespritze (1 mL oder 3 mL Spritze mit aufgesetztem Schlauch, der mit 1x S Basal vorgefüllt wurde).
   1. Bewegen Sie mit einem Stereoskop das Schlauchende mit einer Hand unter die Flüssigkeitsoberfläche zu jedem gewünschten Tier und ziehen Sie es mit der in der anderen Hand gehaltenen Spritze in den Schlauch.
   2. Ziehen Sie die Würmer nur in den Schlauch, nicht in die Spritze.
      HINWEIS: Der Schlauch fasst in der Regel nur etwa 100 μl. Die Tiere können in einen lokalen Bereich ausgestoßen und dann mit einem kleinen Volumen wieder in den Schlauch gezogen werden.
4. Schließen Sie die Auslassleitung, entfernen Sie den Schneckenladestift und verbinden Sie die Schneckenladespritze über eine Drop-to-Drop-Verbindung mit dem Gerät.
5. Lassen Sie die Tiere vorsichtig in die Arena fließen, stellen Sie einen Pufferfluss her und lassen Sie bis zu 1 Stunde für die Ruhigstellung durch Tetramisol ein.
   Anmerkungen: Stellen Sie während der Immobilisierungsphase sicher, dass nur Pufferflüssigkeit in die Arena gelangt. Die Stimulus- und Kontrollreservoirs können während dieser Zeit ausgeschaltet werden, aber öffnen Sie sie und überprüfen Sie den korrekten Fluss, bevor Sie die Stimulationsversuche durchführen.

7. Automatisierte Stimulation und neuronale Aufzeichnung

1. Erstellen Sie mit einem Texteditor (z. B. Notepad) eine Textdatei mit dem Namen "User Defined Acquisition Settings.txt", die die Stimulationseinstellungen für die automatische Bildaufnahme enthält (siehe Beispiele in Abbildung 3). Die Einstellungen sind in zwei Abschnitte unterteilt:
   1. Einstellungen für die Mikroskopaufnahme: Definieren Sie den Experimenttyp (Single-Stimulus oder Multi-Pattern), den Expositions- und Anregungszeitpunkt, die Versuchsdauer und -intervalle sowie das Speicherverzeichnis.
   2. Stimulations-Einstellungen: Definieren Sie die Parameter für die Stimulussteuerung. Ein "Stimulationsbefehl" gibt die Aktionen an, die bei bestimmten Videobildern mit der Syntax ausgeführt werden, wobei die Buchstabencodes A = Ventil1, B = Ventil2, C = Ventil3, L = LED-Licht sind; Zusätzlich gilt: Großbuchstaben = ein und Kleinbuchstaben = aus. Die LED-Intensität wird mit dem Buchstabencode "i" und einem Wert von 0 (aus) bis 255 (maximale Helligkeit) eingestellt.
      Anmerkungen: Der LED-Intensitätswert von 0 bis 255 stellt die analoge Ausgangsspannung von 0 V bis 5 V ein. Der hier verwendete Stromregler verfügt über eine lineare Intensitätsskalierung, andere sollten mit einem Lichtleistungsmesser kalibriert werden.
      1. Verwenden Sie für ein Single-Stimulus-Experiment mit nur einem wiederholten Stimulationsbefehl das Format in Abbildung 3A.
      2. Verwenden Sie für ein Multi-Pattern-Experiment mit mehreren Stimulationsbefehlen das Format in Abbildung 3B. Fügen Sie eine "Mustersequenz" von Ziffern hinzu, die die Reihenfolge der Reizmuster darstellt. Geben Sie für jedes Muster einen Stimulationsbefehl in einer separaten Zeile ein.
         HINWEIS: Eine pseudozufällige Sequenz oder m-Sequenz kann nützlich sein, um die Abhängigkeit von der Stimulushistorie zu untersuchen.
2. Führen Sie die Mikroskopsteuerungssoftware aus. Stellen Sie sicher, dass alle fluidischen Einlässe geöffnet sind, die Strömung innerhalb der Arena wie gewünscht ist (siehe Abbildung 2H) und die interessierenden Neuronen innerhalb des Live-Fensters fokussiert sind.
3. Schließen Sie das Live-Fenster und führen Sie das Skript "MultiPattern_RunScript.bsh" in der Software aus.
   HINWEIS: Es ist sinnvoll, ein Testexperiment ohne Tiere durchzuführen, um den richtigen Fluss und die richtige Stimulation zu überprüfen. Das Ersetzen einer anderen Fluoresceinkonzentration für jede Reizflüssigkeit kann helfen, neue Reizmuster sichtbar zu machen und zu dokumentieren.
4. Zerlegen Sie nach dem Experimentieren das mikrofluidische Gerät und spülen Sie alle Oberflächen, Schläuche und Behälter mit Wasser ab.
   Anmerkungen: Alle Komponenten können Dutzende Male wiederverwendet werden, wenn sie sauber gehalten werden. Stellen Sie sicher, dass Reservoirs, Schläuche und mikrofluidische Geräte feucht gehalten oder vollständig in einem Luftstrom getrocknet werden, um eine Salzkristallisation zu vermeiden, die verstopfen kann und schwer zu entfernen ist. Die Produkte können zur Sterilisation in Ethanol aufbewahrt werden, sollten aber vor der Wiederverwendung vollständig getrocknet werden (>1 h bei 65 °C)¹⁷.

8. Datenanalyse mit NeuroTracker

HINWEIS: NeuroTracker 4,18,19 ist ein ImageJ/FIJI²⁰ Software-Plugin zur Verfolgung der Fluoreszenzintensität mehrerer Neuronen und Tiere^, auch wenn sie sich während der Versuche bewegen. Dieses Plugin speichert Daten als Textdateien mit der Position jedes Neurons und der hintergrundkorrigierten Fluoreszenzintensität (F). Die Fluoreszenzdaten werden auf die Basisfluoreszenz (F 0) normalisiert, z. B. den Mittelwert von mehreren Sekunden vor der Stimulation, als Δ F/F 0 = (F -F 0)/F ₀, die über Populationen gemittelt werden kann.

1. Installieren Sie NeuroTracker-Skripte wie angewiesen (github.com/albrechtLab/Neurotracker).
2. Starten Sie NeuroTracker, indem Sie auf Plugins | Sendungsverfolgung | NeuroTracker.
3. Wählen Sie den Ordner aus, der die . TIF-Videodateien, die verfolgt werden sollen, und wählen Sie die gewünschten Einstellungen aus.
   HINWEIS: Wenn nur eine Teilmenge der Videodateien verfolgt werden soll, wählen Sie an der Eingabeaufforderung den numerischen Bereich der zu analysierenden Dateien aus. Die Standard-Tracking-Einstellungen sind für unbewegliche Tiere mit einer Auflösung von 250 Pixeln/mm geeignet. Passen Sie die Parameter proportional für andere Auflösungen an. Weitere Informationen zu den Einstellungen finden Sie im Benutzerhandbuch¹⁹ .
4. Stellen Sie den Intensitätsschwellenwert so ein, dass die Neuronen für die Auswahl sichtbar sind (Abbildung 4).
5. Öffnen Sie die Steuerungsfenster Helligkeit/Kontrast (B/C) und Schwellenwert über die Schaltfläche Bild | Menü anpassen .
6. Passen Sie im B /C-Fenster die Schieberegler Minimum und Maximum an, bis die Neuronen deutlich zu unterscheiden sind (Abbildung 4A).
7. Aktivieren Sie im Fenster " Schwellenwert " die Option " Dunkler Hintergrund " und "Bereich nicht zurücksetzen".
8. Schieben Sie den Schieberegler des Rahmens, um die Bewegungen und Intensitätsänderungen der Neuronen zu beobachten, und notieren Sie alle Tiere, die von der Verfolgung ausgeschlossen werden sollen, z. B. aufgrund von Überschneidungen mit anderen Tieren.
9. Identifizieren Sie die Neuronen, die verfolgt werden sollen.
10. Passen Sie für jedes Tier den Schwellenwert so an, dass der rote Schwellenbereich über dem Neuron in jedem Bild vor, während und nach der Stimulation sichtbar ist.
11. Klicken Sie auf das Neuron, um seine Position und seinen Schwellenwert aufzuzeichnen.
12. Wiederholen Sie die Anpassung und Auswahl des Schwellenwerts für jedes Tier und Neuron, das verfolgt werden soll. In Abbildung 4C finden Sie ein gutes Beispiel für einen Schwellenwert und in Abbildung 4D,E finden Sie Beispiele für Über- und Unterschwellenwerte. Zuvor ausgewählte Neuronen werden durch ein kleines Kästchen angezeigt.
13. Wenn alle Neuronen ausgewählt sind, drücken Sie die Leertaste , um mit der Verfolgung zu beginnen.
    HINWEIS: Weitere Beispiele für NeuroTracker finden Sie in^den vorherigen Referenzen ^4,19.
14. Überwachen Sie den Tracking-Prozess für jedes Tier und nehmen Sie alle erforderlichen Korrekturen vor.
15. Wenn der NeuroTracker pausiert, hat er das Neuron verloren. Klicken Sie erneut auf das Neuron und passen Sie den Schwellenwert nach Bedarf an.
16. Wenn das Integrationsfeld zu einem anderen Tier oder einer anderen nicht-neuronalen Struktur in der Nähe springt, drücken Sie die Leertaste , um anzuhalten, bewegen Sie den Schieberegler zurück zum ersten fehlerhaften Frame und klicken Sie erneut auf die richtige Neuronenposition.

9. Datenexploration und -visualisierung

HINWEIS: Das MATLAB-Analyseskript wird für die Datenverarbeitung und -visualisierung sowie zum Generieren von zusammenfassenden PDFs für jede Analyse verwendet.

1. Führen Sie die Datei "NeuroTrackerSummary_pdf.m" in MATLAB aus und wählen Sie den Ordner aus, der die NeuroTracker-Datentextdateien enthält.
2. Warten Sie, bis eine zusammenfassende PDF-Datei erstellt wurde, die die Überprüfung des Nachverfolgungsprozesses ermöglicht (Abbildung 5). Die Tiere werden durch eine Nummer identifiziert (Abbildung 5A), und die neuronalen Reaktionen jedes Tieres und jedes Versuchs können angezeigt werden, um die Populationsvariabilität zu beurteilen (Abbildung 5B).
3. Verwenden Sie die Funktion "databrowse.m", um die neuronalen Daten zu untersuchen, z. B. nach Versuchsnummer (Abbildung 5C), nach Tiernummer (Abbildung 5D), nach Stimulationsmuster oder nach einer anderen Kategorie.

Ergebnisse

Wir präsentieren mehrere Beispiele für Stimulusmuster, die verschiedene neuronale Phänomene untersuchen, einschließlich zeitlicher Hemmung, Anpassung und Enthemmung. Zeitliche Hemmung ist die kurzzeitige Unterdrückung einer neuronalen Reaktion auf eine zweite Reizpräsentation, die kurz nach der ersten Präsentation auftritt¹⁴. Um dieses Phänomen zu testen, wurden in einem Paarpulsexperiment acht Muster präsentiert, die aus zwei 1 s Geruchsimpulsen bestehen, die durch ein Intervall ...

Diskussion

In diesem Protokoll beschreiben wir ein frei zugängliches Mikroskopiesystem zur Beurteilung neuronaler Aktivitätsphänomene unter Verwendung der zeitlich präzisen Abgabe verschiedener Reizmuster. Die mikrofluidische Plattform liefert wiederholbare Stimuli, während Dutzende von Tieren im Sichtfeld des Mikroskops bleiben. Nur wenige kommerzielle Mikroskopie-Softwarepakete ermöglichen die einfache Programmierung verschiedener Stimulus-Timing-Muster, und diejenigen, die dies tun, erfordern oft die manuelle Eingabe jedes Muste...

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Bakterienstämme
E.  coli (OP50)	Caenorhabditis Genetics Center (CGC)	Kat# OP50
Experimentelle Modelle: Organismen/Stämme
C.  elegans Stämme, die GCaMP (und optional Chrimson) in gewünschten Neuronen exprimieren	Caenorhabditis Genetics Center (CGC) oder korrespondierende Autoren der veröffentlichten Arbeit	NZ1091, z. B
. Chemicals, Treatments, and Worm Preparation Supplies
2,3-Butandione	Sigma-Aldrich	Cat# B85307	Diacetyl, Beispiel Chemikalie Stimulus
Calciumchlorid, CaCl2	Sigma-Aldrich	Cat# C3881
Fluorescein, Natriumsalz	Sigma-Aldrich	Cat# F6377
Wasserabweisungsmittel aus Glas	Rain-X	Cat #800002250	hydrophobe Glasbehandlung (zum Einmalgebrauch)
Magnesiumchlorid, MgCl2	Sigma-Aldrich	Cat# M2393
Nematoden-Wachstumsmedium (NGM) Agar	Genesee	Katze #: 20-273NGM
Petrischalen (60  mm)	Tritech	Cat #T3305
Poly(dimethylsiloxan) (PDMS): Sylgard 184	Dow Chemical	Cat# 1673921
Kaliumphosphat monobasisch	Sigma-Aldrich	Cat# P5655
Kaliumphosphat zweibasisch	Sigma-Aldrich	Cat# P8281
Natriumchlorid, NaCl	Sigma-Aldrich	Cat# S7653
(Tridecafluor-1,1,2,2-tetrahydrooctyl)trichlorsilan (TFOCS)	Gelest	CAS# 78560-45-9	hydrophobe Glasbehandlung (dauerhaft)
Software und Algorithmen
Arduino IDE	Arduino	https://www.arduino.cc/en/software
ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/
MATLAB	MathWorks	https://www.mathworks.com/products/matlab.html
Micro-Manager	Mikromanager	https://micro-manager.org/
Steuerungssoftware für Mikroskope	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/MicroscopeControl
Neurotracker-Datenanalysesoftware	Albrecht Lab	https://github.com/albrechtLab/Neurotracker
Automatisiertes Mikroskop und Stimulationssystem
Axio Observer.A1 inverses Mikroskop für Epifluoreszenz aufgebaut (GFP-Filterwürfel, 5-faches Objektiv o.ä.)	Zeiss	Cat #491237-0012-000
Excelitas X-cite XYLIS LED-Strahler	Excelitas	Cat #XYLIS
Orca Flash 4.0 Digitale sCMOS-Kamera	Hamamatsu	Cat #C11440-22CU
Arduino nano	Arduino	Cat #A000005
3-Wege-Miniatur-Membranabsperrventil (LQX12)	Parker	Cat #LQX12-3W24FF48-000	Ventil 1: Steuerung
2-Wege-Quetschventils mit Öffnerfunktion (NC)	Bio-Chem Valve Inc	Cat #075P2-S432	Ventil 2: Abfluss
3-Wege-Quetschventil	NResearch	Cat #161P091	Ventil 3: Stimulus Auswahl
Optogenetische Stimulation LED und Controller (615 nm)	Mightex	Cat #PLS-0625-030-S und #SLA-1200-2
ValveLink 8.2 digitale/manuelle Ventilsteuerung	AutoMate Scientific	Cat #01-18
Drähte und Anschlüsse	diverse	Siehe Abb. 2 des Cell STARS Protocol (Lawler, 2021)
Microfluidic Device Preparation
Dremel Rotationsschneider mit variabler Geschwindigkeit 4000	Dremel	Cat #F0134000AB	Stellen Sie die Drehzahl auf 5k U/min für das Schneiden von Glas
ein Dremel Bohrmaschine Drehwerkzeug-Arbeitsplatz	Dremel	Cat #220-01
Diamantbohrer	Dremel	Cat #7134
Glasschlitten, 1  mm dick	VWR	Cat #75799-268
Glasritzer (Diamantanreißer)	Ted Pella	Cat #54468
Luer 3-Wege-Absperrhahn	Cole-Parmer	Cat #EW-30600-07
Luer 23 G stumpfe Nadel	VWR	Cat #89134-100
Mikrofluidisches Gerät	Korrespondieren, Autor oder Fabrikat aus CAD-Dateien, die mit diesem Artikel verknüpft sind	N/A
Klemme für mikrofluidische Geräte	Warner Instruments (oder Werkstatt)	P-2
Mikrofluidische Schläuche, 0,02″ ID	Cole-Parmer	Cat #EW-06419-01
Tube 19 g, 0,5& Prime;	New England Kleine Röhre	Katze #NE-1027-12