Automatisierte multimodale Stimulation und simultane neuronale Ableitung von mehreren kleinen Organismen

Hamilton White; Vanessa Kamara; Veronika Gorski; Molly Busby; Dirk R. Albrecht

doi:10.3791/65042

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Methodenartikel

Automatisierte multimodale Stimulation und simultane neuronale Ableitung von mehreren kleinen Organismen

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DOI:

10.3791/65042

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3. März 2023

Hamilton White¹^,² , Vanessa Kamara¹ , Veronika Gorski¹ , Molly Busby¹ , Dirk R. Albrecht¹^,³

¹Department of Biomedical Engineering, Worcester Polytechnic Institute, ²Graduate School of Biomedical Sciences, UMass Chan Medical School, ³Department of Biology and Biotechnology, Worcester Polytechnic Institute

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir stellen eine Methode zur flexiblen chemischen und multimodalen Stimulation und Aufzeichnung simultaner neuronaler Aktivität von vielen Caenorhabditis elegans-Würmern vor. Diese Methode nutzt Mikrofluidik, Open-Source-Hard- und Software sowie überwachte automatisierte Datenanalyse, um die Messung neuronaler Phänomene wie Anpassung, zeitliche Hemmung und Reizübersprechen zu ermöglichen.

Zusammenfassung

Fluoreszierende genetisch kodierte Kalziumindikatoren haben wesentlich zu unserem Verständnis der neuronalen Dynamik von der Ebene einzelner Neuronen bis hin zu ganzen Gehirnschaltkreisen beigetragen. Neuronale Reaktionen können jedoch aufgrund früherer Erfahrungen, interner Zustände oder stochastischer Faktoren variieren, so dass Methoden erforderlich sind, die die neuronale Funktion bei vielen Individuen gleichzeitig bewerten können. Während die meisten Aufzeichnungstechniken jeweils ein einzelnes Tier untersuchen, beschreiben wir die Verwendung der Weitfeldmikroskopie, um neuronale Aufzeichnungen auf Dutzende von Caenorhabditis elegans oder anderen Organismen im Submillimeterbereich gleichzeitig zu skalieren. Open-Source-Hardware und -Software ermöglichen eine große Flexibilität bei der Programmierung vollautomatischer Experimente, die die Intensität und das Timing verschiedener Stimulustypen steuern, einschließlich chemischer, optischer, mechanischer, thermischer und elektromagnetischer Reize. Insbesondere mikrofluidische Durchflussgeräte ermöglichen eine präzise, wiederholbare und quantitative Steuerung chemosensorischer Reize mit einer Zeitauflösung von weniger als einer Sekunde. Die halbautomatische Datenanalyse-Pipeline von NeuroTracker extrahiert dann individuelle und populationsweite neuronale Reaktionen, um funktionelle Veränderungen in der neuronalen Erregbarkeit und Dynamik aufzudecken. In diesem Artikel werden Beispiele für die Messung der neuronalen Adaptation, der zeitlichen Hemmung und des Stimulus-Crosstalks vorgestellt. Diese Techniken erhöhen die Präzision und Wiederholbarkeit der Stimulation, ermöglichen die Erforschung der Populationsvariabilität und sind auf andere dynamische Fluoreszenzsignale in kleinen Biosystemen von Zellen und Organoiden bis hin zu ganzen Organismen und Pflanzen verallgemeinerbar.

Einleitung

Calcium-Bildgebungsverfahren haben die nicht-invasive Aufzeichnung der neuronalen Dynamik in vivo in Echtzeit mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie und genetisch kodierten Calciumindikatoren, die in Zielzellen exprimiert werden, ermöglicht ^1,2,3. Diese Sensoren verwenden in der Regel ein grün fluoreszierendes Protein (GFP), wie z. B. die GFP-Calmodulin-M13-Peptidfamilie (GCaMP), um die Fluoreszenzintensität bei neuronaler Aktivierung und erhöhten intrazellulären Kalziumspiegeln zu erhöhen. Die Kalzium-Bildgebung hat sich beim Fadenwurm C. elegans als besonder....