Methodenartikel

Entwicklung eines 68Gallium-markierten D-Peptid-PET-Tracers für die Bildgebung der programmierten Expression des Todesliganden 1

DOI:

10.3791/65047

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3. Februar 2023

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1Department of Nuclear Medicine, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 2State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Department of Advanced Nuclear Medicine Sciences, Institute for Quantum Medical Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 4Department of Pharmacy, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Studie wurde eine nicht-invasive Echtzeitmethode entwickelt, um die Verteilung des programmierten Todesliganden 1 im gesamten Körper zu bewerten, basierend auf der positronenemissionstomographischen Bildgebung des [68Ga] D-Dodecapeptid-Antagonisten. Diese Technik hat Vorteile gegenüber der herkömmlichen Immunhistochemie und verbessert die Effizienz bei der Identifizierung geeigneter Patienten, die von einer Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie profitieren.

Zusammenfassung

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Die Entwicklung der Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie auf Basis des programmierten Zelltodproteins 1 (PD-1)/des programmierten Todesliganden 1 (PD-L1) hat in den letzten Jahren die Krebstherapie revolutioniert. Aufgrund der heterogenen Expression von PD-L1 in Tumorzellen spricht jedoch nur ein Bruchteil der Patienten auf PD-1/PD-L1-Inhibitoren an. Diese Heterogenität stellt eine Herausforderung bei der präzisen Detektion von Tumorzellen durch den häufig verwendeten immunhistochemischen Ansatz (IHC) dar. Diese Situation erfordert bessere Methoden zur Stratifizierung von Patienten, die von einer Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie profitieren, um die Wirksamkeit der Behandlung zu verbessern. Die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der PD-L1-Expression des gesamten Körpers auf nicht-invasive Weise. Daher besteht ein Bedarf an der Entwicklung radioaktiv markierter Tracer, um die PD-L1-Verteilung in Tumoren durch PET-Bildgebung nachzuweisen.

Im Vergleich zu ihren L-Gegenstücken haben dextrorotierende (D)-Peptide Eigenschaften wie proteolytische Resistenz und bemerkenswert verlängerte metabolische Halbwertszeiten. In dieser Studie wurde eine neue Methode zum Nachweis der PD-L1-Expression entwickelt, die auf der PET-Bildgebung von 68Ga-markierten PD-L1-gerichteten D-Peptiden, einem D-Dodecapeptid-Antagonisten (DPA), in tumortragenden Mäusen basiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die [68Ga]DPA spezifisch an PD-L1-überexprimierende Tumore in vivo binden kann und zeigte eine günstige Stabilität sowie eine ausgezeichnete Bildgebungsfähigkeit, was darauf hindeutet, dass [68Ga]DPA-PET ein vielversprechender Ansatz für die Beurteilung des PD-L1-Status in Tumoren ist.

Einleitung

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Die Entdeckung von Immun-Checkpoint-Proteinen war ein Durchbruch in der Tumortherapie und hat zu großen Fortschritten in der Entwicklung der Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie geführt1. Das programmierte Zelltodprotein 1 (PD-1) und der programmierte Todesligand 1 (PD-L1) sind potenzielle Angriffspunkte für Medikamente mit mehreren Antikörpern, die von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassen sind. PD-1 wird von tumorinfiltrierenden Immunzellen wie CD4+, CD8+ T-Zellen und regulatorischen T-Zellen exprimiert. PD-L1 ist einer der PD-1-Liganden, der in einer Vielzahl von Tumorzellen überexprimiert wird 2,3. Die Interaktion zwischen PD-1 und PD-L1 inaktiviert PD-1 und unterdrückt so die Antitumor-Immunantwort4. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Hemmung von PD-L1 die abtötende Wirkung von Immunzellen verbessern und Tumorzellen eliminieren kann5. Derzeit ist die chromogene Immunhistochemie (IHC) der am häufigsten verwendete Ansatz, um Patienten zu identifizieren, die am ehesten auf eine Immun-Checkpoint-Therapie ansprechen 6,7. Aufgrund der heterogenen Expression von PD-L1 in Tumorzellen können IHC-Ergebnisse aus Biopsien jedoch keine genauen Informationen über die PD-L1-Expression bei Patienten liefern8. Frühere Studien haben berichtet, dass nur 20%-40% der Patienten einen langfristigen Nutzen aus der Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie ziehen 1,9,10. Es besteht daher ein dringender Bedarf, eine neue Methode zu entwickeln, um die falsch-negativen Ergebnisse zu umgehen, die durch die heterogene Expression dieser Immun-Checkpoint-Proteine verursacht werden.

Molekulare Bildgebungstechnologien, wie z. B. die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), ermöglichen die Echtzeit-Visualisierung des gesamten Körpers auf nicht-invasive Weise und können damit die herkömmliche IHC-Methode übertreffen 11,12,13. Radioaktiv markierte Antikörper, Peptide und kleine Moleküle sind vielversprechende Tracer für die Überwachung der PD-L1-Expression bei Krebspatienten 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25. Die FDA hat drei therapeutische monoklonale PD-L1-Antikörper zugelassen: Avelumab, Atezolizumab und Durvalumab26. Immuno-PET-Tracer, die auf diesen Antikörpern basieren, sind gut dokumentiert 27,28,29,30,31,32. Klinische Studien in der Frühphase haben gezeigt, dass sie aufgrund der ungünstigen Pharmakokinetik nur einen begrenzten Wert für die klinische Anwendung haben30. Im Vergleich zu Antikörpern weisen Peptide eine schnellere Blut- und Organausscheidung aus gesunden Organen auf und können leicht chemisch modifiziert werden33. Es wurde über mehrere Peptide mit hoher Affinität zu PD-1/PD-L1 berichtet2; WL12 ist ein berichtetes Peptid, das eine spezifische Bindung an PD-L134 zeigt. Es wurde berichtet, dass radioaktiv markierte Tracer, [64Cu]WL12, [68Ga]WL12 und [18F]FPyWL12, eine hohe In-vivo-spezifische Tumor-Targeting-Fähigkeit aufweisen, was die Gewinnung qualitativ hochwertiger Bilder der PD-L1-Expression in Tumorenermöglicht 26,35,36,37. Darüber hinaus hat die erste Evaluierung von radioaktiv markiertem WL12 am Menschen gezeigt, dass [68Ga]WL12 (chelatisiert durch NOTA) ein sicheres und effizientes Potenzial für die klinische Tumorbildgebung hat38. Aufgrund seiner hohen Hydrophobizität und hohen Aufnahme in die gesunde Leber hat WL12 nur einen begrenzten klinischen Nutzen. Andere radioaktiv markierende Peptide wie TPP1 und SETSKSF, die spezifisch an PD-L1 binden, haben ebenfalls potenzielle Stabilität und Spezifität gezeigt, um die PD-L1-Expression des gesamten Körpers sichtbar zu machen39,40. Unmodifizierte Peptide werden jedoch leicht von Proteasen abgebaut und schnell von der Niere verstoffwechselt. Dextrorotary(D)-Peptide werden aufgrund der schlechten Stabilität von linkshändigen (L)-Peptiden häufig als wirksame Mediatoren eingesetzt 41,42,43. D-Peptide sind hyperresistent gegen proteolytischen Abbau und haben bemerkenswert verlängerte metabolische Halbwertszeiten. Im Vergleich zu ihren L-Pendants zeigen D-Peptide meist spezifische Bindungsfähigkeiten 44,45,46.

In dieser Studie wurde eine neue Methode zum Nachweis der PD-L1-Expression entwickelt, die auf der PET-Bildgebung eines 68Ga-markierten PD-L1-gerichteten D-Peptids, des D-Dodecapeptid-Antagonisten (DPA), in einem tumortragenden Mausmodellbasiert 47. Die Stabilität von [68Ga]DPA wurde zunächst in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) und Mausserum untersucht, danach wurde die Bindungsaffinität von [68Ga]DPA in PD-L1-überexprimierenden Tumoren getestet. Danach wurde eine PET-Bildgebung in Glioblastom-Xenograft-Modellen durchgeführt, um zu bestätigen, ob [68Ga]DPA ein idealer PET-Tracer zur Überwachung der PD-L1-Expression in Tumoren ist. Die Kombination von PET-Bildgebung und DPA bietet nicht nur einen neuen Ansatz zur Bewältigung der Herausforderungen, die mit der heterogenen Expression von PD-L1 verbunden sind, sondern legt auch die Grundlage für die Entwicklung von D-Peptid-basierten Radiotracern.

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Protokoll

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Die tierexperimentellen Verfahren wurden von der Tierethikkommission der Nanjing Medical University oder den National Institutes of Quantum Science and Technology genehmigt. Die Mäuseversuche wurden streng nach den institutionellen Richtlinien des Ausschusses für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.

1. Peptidsynthese

  1. 100 mg 4-Methylbenzhydrylamin (MBHA)-Harz (Beladungskapazität von 0,37 mmol/g) in 1 ml N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) für 30 Minuten unter mildemN2-Blasenbildung aufquellen lassen.
  2. Bereiten Sie einen frischen Stammpuffer aus Fmoc-geschützten Aminosäuren (5,0 Äquiv), HCTU (4,9 Äquiv) und DIPEA (10,0 Äquiv) in 1 ml NMP vor und fügen Sie ihn dem Harz (100 mg) hinzu. Lassen Sie die Kupplungsreaktion 1,5-2 Stunden lang andauern.
  3. Bereiten Sie einen Entschützungspuffer vor, der zu 50 % (vol/vol) aus Morpholin in NMP besteht. Waschen Sie das Harz (100 mg) 2 x 30 min mit 1 ml des Entschützungspuffers in jeder Wäsche, um die Fmoc-Gruppe auf der Amingruppe zu entfernen. Waschen Sie das Harz 1 Minute lang mit Dichlormethan (DCM; 1 ml), entfernen Sie das DCM und waschen Sie das Harz erneut mit NMP (1 ml) für weitere 1 Minute. Entfernen Sie als Nächstes das NMP und waschen Sie das Harz 1 Minute lang mit DCM.
    HINWEIS: Alle Waschvorgänge werden unter mildemN2-Blasenbildung durchgeführt. Die oben genannten Vorgänge werden bis zur letzten Aminosäure wiederholt.
  4. Um dem Peptid 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäure (DOTA) zuzusetzen, wird das DOTA mit N-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimidhydrochlorid (EDC· HCl) und N-Hydroxysuccinimid (NHS). Inkubieren Sie den Vorratspuffer von DOTA/EDC· HCl/NHS in einem molaren Verhältnis von 1:1:1 in Dimethylsulfoxid (DMSO) für 3 h, mit einer DOTA-Endkonzentration von 1 M. Als nächstes wird der Stammpuffer (1 ml) zum Harz (100 mg) gegeben und die Reaktion 2 h lang mit sanftemN2-Blasenbildung fortgesetzt.
    HINWEIS: 1,4,7-Triazacyclononan-1,4,7-triessigsäure (NOTA) kann auch als Chelator für die 68-Ga-Komplexierungverwendet werden. Die gleichen Verfahren können für die NOTA-Kopplung verwendet werden.
  5. Spülen Sie das Harz gründlich von oben mit DCM ab und wenden Sie gleichzeitig ein Vakuum an, um die Reste der Reaktionslösung zu entfernen. Spülen Sie das Harz 3x mit DCM (1,5 ml) und spülen Sie es dann mit MeOH (1,5 ml) ab, um das Harz zu schrumpfen. Stellen Sie das Harz über Nacht oder mindestens 4 h lang unter Hochvakuum, bis das Harz trocken ist.
  6. Geben Sie das getrocknete DPA-peptidhaltige Harz in einen 2-ml-Polypropylenbehälter mit Schraubverschluss. Geben Sie den entsprechenden Spaltcocktail hinzu (95/2,5/2,5 TFA/TIS/H2 Oim Volumen; 1 ml/100 mg Harz) und verschließen Sie den Behälter mit einem Schraubverschluss fest. Die Reaktion wird auf einem Orbitalschüttler in einem Abzug bei 20-25 °C für 2 h vorsichtig gerührt.
    VORSICHT: Bereiten Sie Trifluoressigsäure (TFA) in einem Abzug mit Schutzkleidung zu, da sie stark ätzend ist.
  7. Entfernen Sie den größten Teil der TFA durch Verdampfung unter Stickstoff im Abzug. Fällt die Peptide durch Zugabe von Diethylether (~1,5 ml/100 mg Harz) aus.
  8. Die Mischung wird vorgewirbelt, um die Peptide zu trituieren und bei Raumtemperatur (10.000 × g, 5 min) zu zentrifugieren. Gießen Sie das Lösungsmittel vorsichtig aus dem Behälter. Wiederholen Sie die Schritte 1.7 bis 1.8.
  9. Trocknen Sie die Rückstände 10 Minuten lang im offenen Behälter an der Luft. Fügen Sie 50% (vol/vol) wässriges Acetonitril hinzu und wirbeln Sie 1-2 s lang vor, um die Produkte aufzulösen (1 ml/100 mg Harz).
  10. Entfernen Sie das Harz, indem Sie die Mischung filtrieren, und waschen Sie das Harz dann 2x mit 0,2 ml 50% (vol/vol) wässrigem Acetonitril. Mischen Sie die Filtrate für die Aufreinigung mit Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC). Verwenden Sie die folgenden HPLC-Bedingungen. Säule: YMC-Triat-C18 (4,6 mm Innendurchmesser, 150 mm, 5 mm); Lösungsmittelgradient: Lösungsmittel-A-deionisiertes Wasser; Lösungsmittel B-Acetonitril (0,1 % TFA); Fließzeit: 20 min, mit Acetonitril von 10% bis 90%; Durchflussrate: 1 ml/min.
  11. Die gesammelten HPLC-Eluenten werden über Nacht bei -80 °C eingefroren und lyophilisiert (-50 °C und <1 pa). Für die radioaktive Markierung wird das feste Peptid in Natriumacetatpuffer (100 mM, pH 5,0) in einer Endkonzentration von 1 mg/ml als Stammpuffer gelöst.

2. 68Ga radioaktive Markierung

ANMERKUNG: 68Ga wurde intern im Nanjing First Hospital (Nanjing, China) mit einem 68Ge/68Ga-Generator erzeugt.

  1. Pipettieren Sie 5 μl Stammpuffer in einen 1,5-ml-Polypropylenbehälter mit Schraubverschluss. 200 MBq [68Ga]GaCl3 (400 μl) in den Behälter geben.
  2. Die Mischung 5 s lang vortexen. Messen Sie den pH-Wert mit pH-Teststreifen. Stellen Sie den pH-Wert mit NaOH (0,1 m) auf 4-4,5 ein.
    HINWEIS: Ein geeigneter pH-Wert ist entscheidend für die Komplexierung zwischen 68Ga und DOTA.
  3. Inkubieren Sie die Lösung bei Raumtemperatur für 5-10 Minuten. Das Reaktionsgemisch wird einer Radio-HPLC unterzogen, um die radioaktive Markierungsausbeute unter den folgenden Bedingungen zu analysieren: Säule: YMC-Triat-C18 (4,6 mm Innendurchmesser, 150 mm, 5 mm); Lösungsmittelgradient: Lösungsmittel-A-deionisiertes Wasser; Lösungsmittel B-Acetonitril (0,1 % TFA); Fließzeit: 20 min, mit Acetonitril von 10% bis 90%; Durchflussrate: 1 ml/min.
    HINWEIS: Die Radiodünnschichtchromatographie (DC) kann als alternativer Ansatz zur Untersuchung der radioaktiven Markierungsausbeute verwendet werden. Der vorgeschlagene TLC-Elutionspuffer beträgt 0,1 M Na3C6H5O7, pH4.

3. Prüfung der Tracerstabilität

  1. Tracer-Stabilitätstest bei PBS
    1. [68Ga]DPA (10 μl, 3,7 MBq, in NaOAc) zum PBS (990 μl) geben. Bei 37 °C für 1, 2 und 4 h unter leichtem Rühren inkubieren.
    2. Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt 200 μl der Lösung. Injizieren Sie es zur Analyse in die Radio-HPLC.
  2. Tracerstabilität im Mäuseserum
    1. [68Ga]DPA (10 μl, ~3,7 MBq, in NaOAc) zum Mausserum (90 μl, frisch zubereitet) geben. Bei 37 °C für 1, 2 und 4 h unter leichtem Rühren inkubieren.
    2. Sammeln Sie zu jedem Zeitpunkt 20 μl der Lösung. MeCN und Wasser (100 μl, 1:1, v/v) zugeben.
    3. Die Mischung wird 10 min zentrifugiert (5.000 × g, 25 °C). Analysieren Sie den Überstand mittels Radio-HPLC.

4. Analyse der PD-L1-Expression mittels Durchflusszytometrie

  1. Bereiten Sie das Nährmedium vor, indem Sie das RPMI-1640-Medium mit 10 % (vol/vol) fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin (vol/vol) ergänzen. Resuspendieren Sie die U87MG-Zellen in Kulturmedium und säen Sie sie in 12-Well-Platten mit einer Dichte von 105 Zellen/Well. Die Zellen werden in einen Inkubator (5 % CO2, 37 °C) gegeben und mindestens 24 Stunden lang ohne Störung kultiviert.
  2. Waschen Sie die Zellen mit 0,5 ml PBS und fügen Sie 250 μl Trypsin-EDTA (0,25 %) hinzu. Die Zellen werden für 2 min in den Inkubator (5% CO2, 37 °C) zurückgelegt.
  3. Fügen Sie 1 ml Kulturmedium hinzu, um die Zelldissoziation zu stoppen. Geben Sie Medium zu den Zellen, um sie durch Auf- und Abpipettieren von den Schalen zu lösen, und sammeln Sie sie in 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 min (100 × g).
  4. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml PBS. Die Zellen 5 min zentrifugieren (100 × g). Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
  5. Der Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierte PD-L1-Antikörper wird mit 3 % Rinderserumalbumin (BSA) auf 20 nmol/L verdünnt. Zu den Zellen geben und bei 4 °C für 1 h inkubieren.
  6. Die Zellen werden 5 Minuten lang zentrifugiert (100 × g), gefolgt von zweimaligem Waschen mit kaltem PBS. Analysieren Sie die PD-L1-positiven Zellen mit einem Durchflusszytometer und einer Analysesoftware.

5. Immunzytochemie

  1. Die U87MG-Zellen werden in Zellkulturschalen mit Glasboden (35 mm) mit einer Dichte von 2,5 × 105 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Wenn eine Konfluenz von 60 % erreicht ist, wird das Nährmedium abgesaugt und 1 ml PBS hinzugefügt. Mehrmals vorsichtig schütteln und absaugen. Führen Sie den Waschschritt 3x durch.
  2. Geben Sie 500 μl 4%iges Paraformaldehyd in das Geschirr. Stellen Sie die Zellen auf Raumtemperatur und fixieren Sie sie für 30 Minuten.
  3. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Fügen Sie 1 ml 3 % BSA (Gew./Vol., in PBS) hinzu und blockieren Sie die fixierten Zellen für 2 h bei Raumtemperatur.
  4. Entfernen Sie die 3%ige BSA und inkubieren Sie die Zellen direkt mit einem primären Anti-PD-L1-Antikörper (mAb, 1:100, verdünnt in 3% BSA) über Nacht bei 4 °C.
    HINWEIS: Nachdem Sie die Zellen mit BSA blockiert haben, waschen Sie sie nicht mit PBS.
  5. Waschen Sie die Zellen 3x mit 3% BSA-Puffer. Die Zellen werden 1 h lang mit FITC-konjugiertem anti-humanem IgG-Fc-Sekundärantikörper (1:500, verdünnt in PBS) inkubiert.
  6. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. Geben Sie 0,5 ml DAPI (1 μg/ml) zu den Zellen und inkubieren Sie 1 Stunde lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie die gefärbten Zellen 3x mit PBS und beobachten Sie sie mit einem konfokalen Fluoreszenzmikroskop.

6. Zelluläres Aufnahme- und Hemmungsexperiment

  1. Experiment zur zellulären Aufnahme
    1. Kultivieren Sie die U87MG-Zellen in 12-Well-Platten, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 0,5 ml PBS.
    2. Die [68Ga]DPA wird in frischem Medium auf eine Konzentration von 74 KBq/ml verdünnt. Geben Sie 0,5 ml des verdünnten [68Ga]DPA-Puffers in jede Vertiefung.
    3. Die Zellen werden mit [68Ga]DPA bei 37 °C für unterschiedliche Zeiträume (10, 30, 40 und 120 min) inkubiert. Saugen Sie das Medium mit einer Pipette an. Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS (0,5 ml).
    4. Fügen Sie NaOH-Lösung (0,5 M, 300 μl pro Well) hinzu, um die Zellen zu lysieren. Nach 30 s werden die viskosen Zelllysate in 1,5-ml-Röhrchen gesammelt.
    5. Waschen Sie die Platte zweimal mit 0,4 ml PBS. Sammeln Sie die Waschlösung in dem obigen 1,5-ml-Röhrchen.
    6. Starten Sie den eingebauten Computer des automatischen Gamma-Zählers; Legen Sie die Röhrchen in das eingebaute Regal. Nachdem Sie alle Proben auf das Förderband geladen haben, drücken Sie die START-Taste. Die Ergebnisse werden in der internen Software berechnet. Die Auslesung zeichnet die zerfallskorrelierte Anzahl pro Minute (CPM) jedes Röhrchens auf.
  2. Kompetitiver Bindungsassay
    1. Kultivieren Sie die U87MG-Zellen in 12-Well-Platten, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist. Entfernen Sie das Medium und waschen Sie die Zellen mit 0,5 ml PBS.
    2. [68Ga]DPA wird in frischem Medium auf eine Konzentration von 74 KBq/ml verdünnt. Eine angemessene Menge an BMS202-Verbindungen wird in 10%igem DMSO gelöst, um eine Konzentration von 10 mM (400 μl) zu erhalten.
    3. Verdünnen Sie 4 μl 10 mM BMS202 in 396 μl PBS, um eine Konzentration von 100 μM zu erhalten. Wiederholen Sie diesen Schritt, um verschiedene Konzentrationen von BMS202 (1 μM, 10 nM, 100 pM und 1 pM) zu erhalten.
    4. Geben Sie 0,5 ml des verdünnten [68Ga]DPA-Puffers in jede Vertiefung (0,37 MBq pro Vertiefung). Geben Sie 5 μl der BMS202-Lösungen in jede Vertiefung (drei Vertiefungen für jede Konzentration). Inkubieren Sie die Zellen in einem Zellinkubator bei 37 °C für 120 min.
    5. Saugen Sie das Medium mit einer Pipette an. Waschen Sie die Zellen mit 3 x 0,5 ml PBS.
    6. Fügen Sie die NaOH-Lösung (0,5 M, 300 μl pro Well) hinzu, um die Zellen zu lysieren. Nach 30 s werden die viskosen Zelllysate in 1,5-ml-Röhrchen gesammelt. Waschen Sie die Platte mit 2 x 0,4 ml PBS.
    7. Sammeln Sie die Waschlösung in dem obigen 1,5-ml-Röhrchen. Legen Sie die Röhrchen in die eingebaute Ablage des automatischen Gammazählers.
    8. Gehen Sie wie in Schritt 6.1.6 vor.

7. PET-Bildgebung

HINWEIS: Führen Sie PET-Bildgebung bei kleinen Tieren mit einem Mikro-PET-Scanner durch, der 159 axiale Querschnitte im Abstand von 0,796 mm (von Mitte zu Mitte) mit einem horizontalen Sichtfeld von 10 cm und einem axialen Sichtfeld von 12,7 cm bietet. Alle Daten, die im Listenmodus gesammelt werden, sind in dreidimensionalen Sinogrammen organisiert. Der Fourier wird dann wieder zu zweidimensionalen Sinogrammen zusammengesetzt (Rahmen × min: 4 × 1, 8 × 2, 8 × 5).

  1. Verwenden Sie in dieser Studie männliche, 5-8 Wochen alte BALB/C-Nacktmäuse. Entnehmen Sie die U87MG-Zellen gemäß den Schritten 4.1-4.4 und saugen Sie die Zellen in eine 0,5-ml-Spritze ab. Subkutan injizieren Sie die Zellen in die Mäuse (1 × 106 Zellen pro Tumor, zwei Tumore pro Maus). Überwachen Sie das Tumorwachstum nach der Injektion, bis das Tumorvolumen 100-300 mm beträgt3.
  2. Betäuben Sie die Mäuse mit 1%-2% (v/v) Isofluran (1 ml/min). Schalten Sie das Heizgerät ein und halten Sie das Tierbett aus PET bei 37 °C.
  3. Bringen Sie die betäubten Mäuse in die richtige Position auf das Tierbett der PET-Maschine. Tragen Sie Augensalbe auf beide Augen auf, um Trockenheit zu vermeiden.
    VORSICHT: Halten Sie die Mäuse in Bauchlage, um den Tod während des Scannens zu vermeiden. Während des gesamten Bildgebungsprozesses wird der Isofluran-Fluss (1,0 ml/min) über die Nase mit einem vorinstallierten Röhrchen verabreicht.
  4. Stellen Sie die Position des Tierbettes über das Bedienfeld ein. Die Tracer (10-17 MBq/100-200 μL) werden intravenös durch einen vorinstallierten Schwanzvenenkatheter injiziert.
  5. Erstellen eines Scan-Workflows auf einem Host-Computer mit der referenzierten Software (siehe Materialtabelle) Erstellen Sie einen Studienordner und legen Sie das Erfassungsprotokoll gemäß dem Protokoll des Herstellers fest. Führen Sie dynamische Scans (60 Minuten für jede Maus) auf allen Mäusen im 3D-Listenmodus durch.
  6. Definieren Sie ein Histogrammprotokoll und ein Rekonstruktionsprotokoll gemäß dem Protokoll des Herstellers. Verwenden Sie Hannings Filter mit einem Nyquist-Cutoff von 0,5 Zyklen/Pixel, um dynamische PET-Bilder (25-30 min und 55-60 min) durch gefilterte Rückprojektion zu rekonstruieren. Generieren Sie MIP-Bilder (Maximum Intensity Projection) für alle Mäuse.
  7. Kombinieren Sie die Protokolle in einem Workflow, und führen Sie den Workflow aus. Analysieren Sie die resultierenden dreidimensionalen Bilder mit der Software gemäß dem Protokoll des Herstellers.
    HINWEIS: Verwenden Sie die Simulationssoftware, um die gewünschten Volumina auszuwählen. Die Radioaktivität wird auf den Injektionszeitpunkt korrigiert und als Prozentsatz der gesamten Injektionsdosis/pro Gramm Gewebe (% ID/g) dargestellt.

8. Ex-vivo-Bioverteilung

  1. Verabreichung von [68Ga]DPA (1,85 MBq/100 μl) an die U87MG-tragenden BALB/C-Nacktmäuse durch Schwanzveneninjektion. Betäuben Sie die Mäuse mit 1%-2% (v/v) Isofluran (1 ml/min) und opfern Sie dann drei Mäuse durch Zervixluxation nach der Injektion für 5, 30, 60 und 120 Minuten.
    HINWEIS: Die Personen, die dieses Verfahren vorführen, sollten in den technischen Fähigkeiten der zervikalen Luxation geschult werden, um sicherzustellen, dass der Bewusstseinsverlust schnell eingeleitet wird. Dadurch wird sichergestellt, dass die Euthanasieverfahren in diesem Experiment alle human durchgeführt werden.
  2. Nachdem der Tod bestätigt wurde, öffnen Sie die Brustwand der Mäuse. Öffne dann das Herz. Verwenden Sie eine 1-ml-Spritze, um Blut zu entnehmen. Drücken Sie das Blut aus der Spritze in ein Radioimmunoassay-Röhrchen (RIA) (13 mm Durchmesser) für den Gamma-Zähler.
  3. Entfernen Sie die wichtigsten Organe und Tumore und legen Sie sie in RIA-Röhrchen (13 mm Durchmesser) für den Gamma-Zähler. Zu den wichtigsten Organen gehören das gesamte Blut, das Herz, die Thymusdrüse, die Leber, die Milz, der Knochen, der Magen, die Nieren, die Muskeln, der Darmlymphknoten, der Dünndarm, die Bauchspeicheldrüse, die Hoden, das Gehirn und die Lunge. Wiegen Sie alle Organe.
  4. Messen Sie die Radioaktivität in den gesammelten Organen mit einem Autogamma-Zähler und korrigieren Sie die Werte. Berechnen Sie den Prozentsatz der injizierten Dosis pro Gramm Feuchtgewebe (% ID/g).

9. Immunhistochemie

  1. Sammeln Sie das Gliomgewebe und waschen Sie es 3x mit PBS. Das frische Gewebe wird in 4% Paraformaldehyd eingelegt und über Nacht bei 4 °C fixiert.
  2. Betten Sie das fixierte Gewebe in Paraffin ein und schneiden Sie es auf eine Dicke von 10 μm. Die Abschnitte in einen Inkubator (60 °C) geben und 2 h inkubieren. Entwachsen und hydratisieren Sie die Abschnitte, indem Sie jeweils 10 Minuten lang inkubieren: Xylol (zweimal), absoluter Alkohol, 95% Alkohol, 90% Alkohol, 80% Alkohol, 75% Alkohol.
  3. Die Abschnitte werden in 0,01 M Natriumcitrat eingelegt und auf 92-95 °C erhitzt. Halten Sie die Temperatur 40 Minuten lang, um eine Antigengewinnung zu erreichen.
  4. Geben Sie 200 μlH2O2-Lösung(3 %) zu den Abschnitten und inaktivieren Sie die Endoperoxidasen für 10 Minuten bei Raumtemperatur. Blockieren Sie die unspezifischen Stellen durch Behandlung mit 3% BSA für 2 h bei Raumtemperatur.
  5. Die Schnitte werden über Nacht bei 4 °C in einem primären Anti-PD-L1-Antikörper (mAb, 1:100, verdünnt in 3% BSA) inkubiert.
    HINWEIS: Nach dem Blockieren mit BSA nicht mit PBS waschen.
  6. Waschen Sie die Partien 3x mit PBS. Die Schnitte werden mit HRP-markiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (1:500, verdünnt in PBS) bei Raumtemperatur für 1 h inkubiert.
  7. Waschen Sie die Zellen 3x mit PBS. 200 μl 3,3-Diaminobenzidin (DAB)-Arbeitslösung (Lösung A: Lösung B: Lösung C = 1:1:18) zu den Abschnitten geben und 5 min im Dunkeln inkubieren.
  8. Waschen Sie die Partien 3x mit PBS. 500 μl Hämatoxylinlösung (100 %) zugeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie die Partien 30 s lang mit Wasser. Die Abschnitte werden für 30 s in Differenzierungslösung (75%iger Alkohol: HCL = 99:1) gegeben. Waschen Sie die Abschnitte 1 Minute lang mit Wasser.
  9. Dehydrieren Sie die Proben durch sequenzielles Inkubieren mit 75 % Alkohol, 80 % Alkohol, 90 % Alkohol, 95 % Alkohol, absolutem Alkohol und Xylol (zweimal) (jeweils 10 Minuten). Montieren Sie alle Schnitte mit Neutralharz und beobachten Sie sie unter einem Lichtmikroskop.

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Ergebnisse

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[68Ga]DPA-Radiomarkierung und Stabilität
Das Modellpeptid DPA ist ein wirksamer PD-L1-Antagonist. DOTA-DPA wurde mit einer Reinheit von >95 % und einer Ausbeute von 68 % erhalten. Die Masse von DOTA-DPA liegt experimentell bei 1.073,3 ([M+2H]2+). 68Gallium gilt als geeignetes Radionuklid zur Markierung von Peptiden für die PET-Bildgebung und wurde daher für diese Studie ausgewählt. Zur radioaktiven Markierung von DPA mit 68

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Diskussion

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Zu den kritischen Schritten, die bei dieser Methode beschrieben werden, gehören die effiziente Markierung von 68Ga zu DPA und die Auswahl eines geeigneten Zeitfensters für die PET-Bildgebung, das perfekt zum pharmakodynamischen Muster der DPA im Tumor passen muss.

Im Gegensatz zur IHC ermöglicht die PET-Bildgebung die nichtinvasive Detektion der PD-L1-Expression des gesamten Körpers in Echtzeit und ermöglicht die Visualisierung jedes positiven Bereichs in einem heterogenen Tumor

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Offenlegungen

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Es werden keine konkurrierenden Interessen deklariert.

Danksagungen

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Diese Studie wurde vom Non-profit Central Research Institute Fund der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften (Nr. 2022-RC350-04) und dem CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (Nr. 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 und 2022-I2M-2-002) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-Tetraessigsäure (DOTA)Merck60239-18-168Ga  Chelatbildung
3,3-Diaminobenzidin (DAB) KitSigma-AldrichD7304-1SETImmunhistochemie
monoklonaler Anti-PD-L1-AntikörperWuhan Proteintech17952-1-apImmunhistochemie: Primärantikörper
BMS202Selleck1675203-84-5Kompetitiver Bindungsassay: Inhibitor
BSAMerckV900933Immunfluoreszenz: Blockierung 
DAPIMerckD9542Immunfluoreszenz: Färbung des Zellkerns
Dichlormethan (DCM)Merck34856Lösungsmittel
DIPEAMerck3439Peptidkupplung
EDC & Middot; HClMerckE6383Aktivierung von DOTA
FBSGibco10099Zellkultur: Ergänzung
FITC-konjugierter Anti-Human-IgG Fc-AntikörperBiolegend409310Immunfluoreszenz: Sekundärer Antikörper
FITC-konjugierter Anti-PD-L1-AntikörperBiolegend393606Durchflusszytometrie: direkter Antikörper
HCTUEnergy ChemicalE070004-25gPeptidkupplung
HRP markierter Anti-Kaninchen-Antikörper für ZiegenServicebioGB23303Immunhistochemie: Sekundärantikörper
Hydroxysuccinimid (NHS)Merck130672Aktivierung von DOTA
MeCNMerckPHR1551Lösungsmittel
MorpholinMerck8.06127Fmoc- Entschützung
NMPMerck8.06072Solevent
ParaformaldehydMerck30525-89-4Fixierung von Geweben
PBSGibco10010023Zellkultur: Puffer
Penicillin-StreptomycinGibco10378016Zellkultur: Ergänzung
RIA-RöhrchenPolyLabP10301AAls Gewebeprobenbehälter
RPMI-1640 MediumGibco11875093Zellkultur: Basismedium
NatriumacetatMerck1.06264Salz für Puffer
Trypsin-EDTAGibco25200056Zellkultur: Dissoziationsmittel
U87MG ZelllinieProcell Life Science & Technology CoCL-0238Cell model
Equipment
68Ge/68Gagenerator Isotope Technologies Munich, ITMNicht zutreffendErzeugung von [68Ga]
Autogamma-ZählerPerkin ElmerWizard2Nachweis von Radioaktivität
Konfokale FluoreszenzmikroskopieKeyenceBeobachtung von Immunfluoreszenzergebnissen
DurchflusszytometerBecton Dickinson, BDLSRIIÜberwachung der PD-L1-positiven Zellen
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)SHIMAZULC-20AT Reinigung von DPA-Peptid
PET-ScannerSiemens Medical SolutionsInveon MultiModality SystemPET-Bildgebung
Optische MikroskopieNikon Eclipse E100Beobachtung der immunhistochemischen Ergebnisse
Festphasen-PeptidsynthesizerPromega Vac-Man Laboratory Vacuum ManifoldLOT#11101Synthese von DPA-DOTA Peptid
Software
ASIProSiemens Medical SolutionsNicht zutreffendAnalyse der PET-CT-Ergebnisse
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1Analyse der Ergebnisse des Durchflusszytometers
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical SolutionsNicht zutreffendVerwaltung der PET-Mechine
PrismGraphpadPrism 8.0Analyse der Daten 

Referenzen

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Gallium 68 PET TracerBildgebung mit D PeptidenPD L1 ExpressionImmun CheckpointTumorbildgebungradiomarkiertes PeptidPET BildgebungDurchflusszytometrieImmunhistochemieTumor Biodistribution

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