Methodenartikel

Entwicklung eines 68Gallium-markierten D-Peptid-PET-Tracers für die Bildgebung der programmierten Expression des Todesliganden 1

DOI:

10.3791/65047

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3. Februar 2023

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1Department of Nuclear Medicine, Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, 2State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, 3Department of Advanced Nuclear Medicine Sciences, Institute for Quantum Medical Science, National Institutes for Quantum Science and Technology, 4Department of Pharmacy, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Studie wurde eine nicht-invasive Echtzeitmethode entwickelt, um die Verteilung des programmierten Todesliganden 1 im gesamten Körper zu bewerten, basierend auf der positronenemissionstomographischen Bildgebung des [68Ga] D-Dodecapeptid-Antagonisten. Diese Technik hat Vorteile gegenüber der herkömmlichen Immunhistochemie und verbessert die Effizienz bei der Identifizierung geeigneter Patienten, die von einer Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie profitieren.

Zusammenfassung

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Die Entwicklung der Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie auf Basis des programmierten Zelltodproteins 1 (PD-1)/des programmierten Todesliganden 1 (PD-L1) hat in den letzten Jahren die Krebstherapie revolutioniert. Aufgrund der heterogenen Expression von PD-L1 in Tumorzellen spricht jedoch nur ein Bruchteil der Patienten auf PD-1/PD-L1-Inhibitoren an. Diese Heterogenität stellt eine Herausforderung bei der präzisen Detektion von Tumorzellen durch den häufig verwendeten immunhistochemischen Ansatz (IHC) dar. Diese Situation erfordert bessere Methoden zur Stratifizierung von Patienten, die von einer Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie profitieren, um die Wirksamkeit der Behandlung zu verbessern. Die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung der PD-L1-Expression des gesamten Körpers auf nicht-invasive Weise. Daher besteht ein Bedarf an der Entwicklung radioaktiv markierter Tracer, um die PD-L1-Verteilung in Tumoren durch PET-Bildgebung nachzuweisen.

Im Vergleich zu ihren L-Gegenstücken haben dextrorotierende (D)-Peptide Eigenschaften wie proteolytische Resistenz und bemerkenswert verlängerte metabolische Halbwertszeiten. In dieser Studie wurde eine neue Methode zum Nachweis der PD-L1-Expression entwickelt, die auf der PET-Bildgebung von 68Ga-markierten PD-L1-gerichteten D-Peptiden, einem D-Dodecapeptid-Antagonisten (DPA), in tumortragenden Mäusen basiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die [68Ga]DPA spezifisch an PD-L1-überexprimierende Tumore in vivo binden kann und zeigte eine günstige Stabilität sowie eine ausgezeichnete Bildgebungsfähigkeit, was darauf hindeutet, dass [68Ga]DPA-PET ein vielversprechender Ansatz für die Beurteilung des PD-L1-Status in Tumoren ist.

Einleitung

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Die Entdeckung von Immun-Checkpoint-Proteinen war ein Durchbruch in der Tumortherapie und hat zu großen Fortschritten in der Entwicklung der Immun-Checkpoint-Blockade-Therapie geführt1. Das programmierte Zelltodprotein 1 (PD-1) und der programmierte Todesligand 1 (PD-L1) sind potenzielle Angriffspunkte für Medikamente mit mehreren Antikörpern, die von der Food and Drug Administration (FDA) zugelassen sind. PD-1 wird von tumorinfiltrierenden Immunzellen wie CD4+, CD8+ T-Zellen und regulatorischen T-Zellen exprimiert. PD-L1 ist einer der PD-1-Liganden, der in einer Vielzahl von Tumorzellen überexprimiert wird

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Protokoll

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Die tierexperimentellen Verfahren wurden von der Tierethikkommission der Nanjing Medical University oder den National Institutes of Quantum Science and Technology genehmigt. Die Mäuseversuche wurden streng nach den institutionellen Richtlinien des Ausschusses für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt.

1. Peptidsynthese

  1. 100 mg 4-Methylbenzhydrylamin (MBHA)-Harz (Beladungskapazität von 0,37 mmol/g) in 1 ml N-Methyl-2-pyrrolidon (NMP) für 30 Minuten unter mildemN2-Blasenbildung aufquellen lassen.
  2. Bereiten Sie einen frischen Stammpuffer aus Fmoc-geschützten Aminosäuren....

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Ergebnisse

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[68Ga]DPA-Radiomarkierung und Stabilität
Das Modellpeptid DPA ist ein wirksamer PD-L1-Antagonist. DOTA-DPA wurde mit einer Reinheit von >95 % und einer Ausbeute von 68 % erhalten. Die Masse von DOTA-DPA liegt experimentell bei 1.073,3 ([M+2H]2+). 68Gallium gilt als geeignetes Radionuklid zur Markierung von Peptiden für die PET-Bildgebung und wurde daher für diese Studie ausgewählt. Zur radioaktiven Markierung von DPA mit 68

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Diskussion

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Zu den kritischen Schritten, die bei dieser Methode beschrieben werden, gehören die effiziente Markierung von 68Ga zu DPA und die Auswahl eines geeigneten Zeitfensters für die PET-Bildgebung, das perfekt zum pharmakodynamischen Muster der DPA im Tumor passen muss.

Im Gegensatz zur IHC ermöglicht die PET-Bildgebung die nichtinvasive Detektion der PD-L1-Expression des gesamten Körpers in Echtzeit und ermöglicht die Visualisierung jedes positiven Bereichs in einem heterogenen Tumor

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Offenlegungen

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Es werden keine konkurrierenden Interessen deklariert.

Danksagungen

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Diese Studie wurde vom Non-profit Central Research Institute Fund der Chinesischen Akademie der Medizinischen Wissenschaften (Nr. 2022-RC350-04) und dem CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (Nr. 2021-I2M-1-026, 2022-I2M-1-026-1, 02120101, 02130101 und 2022-I2M-2-002) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-Tetraessigsäure (DOTA)Merck60239-18-168Ga  Chelatbildung
3,3-Diaminobenzidin (DAB) KitSigma-AldrichD7304-1SETImmunhistochemie
monoklonaler Anti-PD-L1-AntikörperWuhan Proteintech17952-1-apImmunhistochemie: Primärantikörper
BMS202Selleck1675203-84-5Kompetitiver Bindungsassay: Inhibitor
BSAMerckV900933Immunfluoreszenz: Blockierung 
DAPIMerckD9542Immunfluoreszenz: Färbung des Zellkerns
Dichlormethan (DCM)Merck34856Lösungsmittel
DIPEAMerck3439Peptidkupplung
EDC & Middot; HClMerckE6383Aktivierung von DOTA
FBSGibco10099Zellkultur: Ergänzung
FITC-konjugierter Anti-Human-IgG Fc-AntikörperBiolegend409310Immunfluoreszenz: Sekundärer Antikörper
FITC-konjugierter Anti-PD-L1-AntikörperBiolegend393606Durchflusszytometrie: direkter Antikörper
HCTUEnergy ChemicalE070004-25gPeptidkupplung
HRP markierter Anti-Kaninchen-Antikörper für ZiegenServicebioGB23303Immunhistochemie: Sekundärantikörper
Hydroxysuccinimid (NHS)Merck130672Aktivierung von DOTA
MeCNMerckPHR1551Lösungsmittel
MorpholinMerck8.06127Fmoc- Entschützung
NMPMerck8.06072Solevent
ParaformaldehydMerck30525-89-4Fixierung von Geweben
PBSGibco10010023Zellkultur: Puffer
Penicillin-StreptomycinGibco10378016Zellkultur: Ergänzung
RIA-RöhrchenPolyLabP10301AAls Gewebeprobenbehälter
RPMI-1640 MediumGibco11875093Zellkultur: Basismedium
NatriumacetatMerck1.06264Salz für Puffer
Trypsin-EDTAGibco25200056Zellkultur: Dissoziationsmittel
U87MG ZelllinieProcell Life Science & Technology CoCL-0238Cell model
Equipment
68Ge/68Gagenerator Isotope Technologies Munich, ITMNicht zutreffendErzeugung von [68Ga]
Autogamma-ZählerPerkin ElmerWizard2Nachweis von Radioaktivität
Konfokale FluoreszenzmikroskopieKeyenceBeobachtung von Immunfluoreszenzergebnissen
DurchflusszytometerBecton Dickinson, BDLSRIIÜberwachung der PD-L1-positiven Zellen
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)SHIMAZULC-20AT Reinigung von DPA-Peptid
PET-ScannerSiemens Medical SolutionsInveon MultiModality SystemPET-Bildgebung
Optische MikroskopieNikon Eclipse E100Beobachtung der immunhistochemischen Ergebnisse
Festphasen-PeptidsynthesizerPromega Vac-Man Laboratory Vacuum ManifoldLOT#11101Synthese von DPA-DOTA Peptid
Software
ASIProSiemens Medical SolutionsNicht zutreffendAnalyse der PET-CT-Ergebnisse
FlowJoBecton Dickinson, BDFlowJo 7.6.1Analyse der Ergebnisse des Durchflusszytometers
Inveon Acquisition Workplace (IAW)Siemens Medical SolutionsNicht zutreffendVerwaltung der PET-Mechine
PrismGraphpadPrism 8.0Analyse der Daten 

Referenzen

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  1. Doroshow, D. B., et al. PD-L1 as a biomarker of response to immune-checkpoint inhibitors. Natire Reviews Clinical Oncology. 18 (6), 345-362 (2021).
  2. Krutzek, F., Kopka, K., Stadlbauer, S. Development of radiotracers for imaging of the PD-1/PD-L1 axis.

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Schlagwörter

Gallium 68 PET TracerBildgebung mit D PeptidenPD L1 ExpressionImmun CheckpointTumorbildgebungradiomarkiertes PeptidPET BildgebungDurchflusszytometrieImmunhistochemieTumor Biodistribution

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