Methodenartikel

Quantifizierung und Charakterisierung des gesamten Genoms von SARS-CoV-2-RNA in Abwasser- und Luftproben

DOI:

10.3791/65053

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30. Juni 2023

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1Institute of Sustainable Processes, University of Valladolid, 2Department of Chemical Engineering and Environmental Technology, University of Valladolid, 3Department of Public Health Microbiology, National Laboratory of Health, Environment and Food, 4ICBAS - School of Medicine and Biomedical Sciences, Porto University, 5Epidemiology Research Unit (EPIUnit), Instituto de Saúde Pública da Universidade do Porto, 6Laboratório para a Investigação Integrativa e Translacional em Saúde Populacional (ITR)

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Dieses Protokoll zielt darauf ab, SARS-CoV-2-RNA in Abwasser- und Luftproben zu quantifizieren, um sie für abwasserbasierte epidemiologische Studien zu verwenden und das Expositionsrisiko gegenüber SARS-CoV-2 in Aerosolen in Innen- und Außenbereichen zu bewerten. Dieses Protokoll beschreibt auch einen gekachelten Amplikon-Long-Template-Sequenzierungsansatz für die Charakterisierung des gesamten SARS-CoV-2-Genoms.

Zusammenfassung

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Die abwasserbasierte Epidemiologie hat sich in vielen Ländern zu einem vielversprechenden und wirksamen Überwachungssystem für SARS-CoV-2 und andere Infektionskrankheiten entwickelt. Der Prozess umfasst in der Regel die Abwasserkonzentration, die Nukleinsäureextraktion, die Amplifikation ausgewählter Genomsegmente sowie den Nachweis und die Quantifizierung des amplifizierten Genomsegments. Diese Methodik kann in ähnlicher Weise genutzt werden, um Infektionserreger wie SARS-CoV-2 in Luftproben nachzuweisen und zu quantifizieren. Ursprünglich ging man davon aus, dass sich SARS-CoV-2 vor allem durch engen persönlichen Kontakt mit Tröpfchen verbreitet, die von einer infizierten Person beim Sprechen, Niesen, Husten, Singen oder Atmen erzeugt werden. Eine wachsende Zahl von Studien berichtet jedoch über das Vorhandensein von SARS-CoV-2-RNA in der Luft von Gesundheitseinrichtungen, was die Übertragung über die Luft als gangbaren Weg für das Virus etabliert. Diese Studie stellt eine Kombination etablierter Protokolle vor, um die Erkennung, Quantifizierung und Sequenzierung von Viren aus Abwasser- und Luftproben in der Umgebung zu erleichtern.

Einleitung

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Im Dezember 2019 trat eine neuartige Krankheit namens COVID-19 auf, die durch ein bisher unbekanntes Coronavirus, SARS-CoV-21, verursacht wurde. Die daraus resultierende globale Pandemie stellt eine große Herausforderung für klinische und öffentliche Gesundheitslabore weltweit dar, da eine große Anzahl von Personen Tests benötigt, um die Virusübertragung und -prävalenz in der Gemeinschaft genau zu bewerten. In vielen Regionen ist es jedoch wirtschaftlich nicht machbar, das erforderliche Testniveau zeitnah und räumlich umfassend zu erreichen 2,3. Derzeitige Surveillance-Systeme, die auf ....

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Protokoll

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Alle hier beschriebenen Methoden wurden an anderer Stelle veröffentlicht und enthalten kleine Modifikationen gegenüber den ursprünglichen Methoden.

1. Abwassersammlung und Probenvorbehandlung

HINWEIS: Aufgrund der geringen Konzentrationen von SARS-CoV-2-RNA in Umweltproben ist die Durchführung eines Konzentrationsschrittes entscheidend für einen erfolgreichen Nachweis33,34,35. Hier wird die erste beschriebene Methode zum Nachweis von SARS-CoV-2 im Abwasserbeschrieben 36.

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    Ergebnisse

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    Die in Tabelle 3 zusammengefassten Ergebnisse zeigen Beispiele für den Nachweis und die Quantifizierung von SARS-CoV-2-RNA in Abwasser- und Luftproben mit der in diesem Artikel beschriebenen Methode. Abwasserproben wurden aus Kläranlagen in Spanien und Slowenien entnommen und wurden als positiv angesehen, wenn der Ct-Wert in mindestens zwei der drei Wiederholungen weniger als 40 betrug, wobei die Quantifizierung als gültig angesehen wurde, wenn der Ct-Wert eine Abweichung von weniger als 5 % aufwies. In .......

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    Diskussion

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    Der mikrobielle und virale Nachweis und die Quantifizierung mit (RT-)qPCR-Methoden haben aufgrund ihrer bemerkenswerten Sensitivität eine breite Akzeptanz gefunden. Diese Techniken stehen jedoch vor zahlreichen Herausforderungen bei der Analyse von Umweltproben. Abwasserproben enthalten eine Fülle von hemmenden Substanzen, die Messungen verzerren und irreführende Ergebnisse liefern können. Um diese Einschränkungen zu überwinden und die Präzision zu erhöhen, wurde ein komplexes Protokoll konzipiert, entworfen und implemen.......

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    Offenlegungen

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    Die Autoren haben keine konkurrierenden wirtschaftlichen Interessen oder sonstige Interessenkonflikte.

    Danksagungen

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    Diese Arbeit wurde mit finanzieller Unterstützung der Regionalregierung von Kastilien und León und des ELDER-Programms (Projekte CLU 2017-09, UIC315 und VA266P20) durchgeführt.

    ....

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    Materialien

    Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
    NameUnternehmenKatalognummerKommentare
    Adapter+A25+A2:D19+A2:D20+A2+D19Oxford NanoporeEXP-AMII001Sequenzierung
    AllPrep PowerViral DNA/RNA KitQiagen28000-50RNA-Extraktionskit
    AMPure XPBeckman CoulterA63880PCR-Aufreinigung, NGS-Aufreinigung, PCR-Aufreinigung
    ARTIC SARS-CoV-2 Amplicon PanelIDT10011442SARS-CoV-2 Genomamplifikation
    Blunt/TA Ligase Master MixNEBM0367SVorbereitung der Bibliothek
    CENTRICON PLUS­ 70 10KDA.Fisher Scientific10296062Konzentrationsfilter
    CORIOLIS COMPACT LUFTKEIMSAMMLERBertin Technologies083-DU001Luftkeimsammler
    Duran  LaborflaschenMerckZ305200-10EAProbenahmeflaschen
    Durchflusszelle (R9.4.1)Oxford NanoporeFLO-MIN106DSequenzierung
    Allgemeine Labor-Verbrauchsmaterialien (Röhrchen, qPCR-Platten usw.)
    Ligations-SequenzierungskitOxford NanoporeSQK-LSK109Sequenzierung
    LunaScript  RT SuperMix BausatzNEBE3010  cDNA-Synthese
    Mengovirus-Extraktionskontroll-KitBiomé rieuxKMGKonzentrationskontrolle
    Nalgene Allgemeine Langzeitlagerung Kryo-RöhrchenThermofisher5011-0012Probenlagerung
    Native Barcoding Expansion 1-12 (PCR-freiOxford NanoporeEXP-NBD104Barcoding
    NEBNext Ultra II End Repair/dA-Tailing ModuleNEBE7595DNA-Reparatur
    NEBNext VarSkip Short SARS-CoV-2 Primer MixesNEBE7658SARS-CoV-2 Genomamplifikation
    NEBNächst  SchnellligationsreaktionspufferNEBB6058SSequenzierung 
    Phosphatgepufferte KochsalzlösungMerckP4474Sammelpuffer
    Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS, 1X), sterilfiltriertThermofisherJ61196. APElution von Luftproben
    Q5  Hot Start High-Fidelity 2X Master MixNEBM0494SHot Start DNA-Polymerase
    Qubit RNA HS Assay KitThermofisherQ32852RNA-Quantifizierung
    SARS-CoV-2 RUO qPCR Primer & SondenkitIDT10006713Primer-Sonden-Mix und qPCR-Positivkontrolle
    TaqPath 1-Step RT-qPCR Master MixThermofisherA15299RT-qPCR Kit

    Referenzen

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    1. Naming the Coronavirus Disease (COVID-19) and the Virus that Causes it. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/technical-guidance/naming-the-coronavirus-disease-(cover-2019)-and-the-virus-that-causes-it (2020).
    2. Lab Workplace Safety. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: http....

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    Nachdrucke und Genehmigungen

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    Schlagwörter

    AbwasserepidemiologieLuftprobennahmevirale RNA QuantifizierungGanzgenomsequenzierungRT qPCRAbwasserkonzentrierungNukleins ureextraktionmagnetische SeparationUmwelt berwachung

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