Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen

Aneta Babula; Izabela Siemińska; Monika Baj-Krzyworzeka

doi:10.3791/65062

Methodenartikel

Isolierung von extrazellulären Vesikeln mit niedrigem Endotoxingehalt, die aus Krebszelllinien stammen

DOI:

10.3791/65062

⸱

17. Februar 2023

Aneta Babula^*¹^,² , Izabela Siemińska^*¹^,³ , Monika Baj-Krzyworzeka¹

¹Department of Clinical Immunology, Jagiellonian University Medical College, ²Doctoral School of Medical and Health Sciences, Jagiellonian University, ³Institute of Veterinary Sciences, University Center of Veterinary Medicine JU-AU, University of Agriculture in Kraków

^* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Das vorgeschlagene Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxin während der Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Zellkulturüberständen vermieden und richtig bewertet werden kann.

Zusammenfassung

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind eine heterogene Population von Membranvesikeln, die von Zellen in vitro und in vivo freigesetzt werden. Ihre Allgegenwart und ihre bedeutende Rolle als Träger biologischer Informationen machen sie zu faszinierenden Studienobjekten, die zuverlässige und sich wiederholende Protokolle für ihre Isolierung erfordern. Es ist jedoch schwierig, ihr volles Potenzial auszuschöpfen, da es immer noch viele technische Hindernisse im Zusammenhang mit ihrer Forschung gibt (wie z.B. die richtige Beschaffung). Diese Studie stellt ein Protokoll für die Isolierung kleiner EVs (gemäß der MISEV 2018-Nomenklatur) aus dem Kulturüberstand von Tumorzelllinien vor, das auf differentieller Zentrifugation basiert. Das Protokoll enthält Richtlinien, wie eine Kontamination mit Endotoxinen während der Isolierung von Elektrofahrzeugen vermieden und richtig bewertet werden kann. Eine Endotoxin-Kontamination von EVs kann nachfolgende Experimente erheblich behindern oder sogar ihre wahren biologischen Auswirkungen verschleiern. Andererseits kann das übersehene Vorhandensein von Endotoxinen zu falschen Schlussfolgerungen führen. Dies ist von besonderer Bedeutung, wenn es um Zellen des Immunsystems, einschließlich Monozyten, geht, da Monozyten eine Population darstellen, die besonders empfindlich auf Endotoxinrückstände reagiert. Daher wird dringend empfohlen, EVs auf Endotoxinkontamination zu untersuchen, insbesondere wenn mit endotoxinempfindlichen Zellen wie Monozyten, Makrophagen, myeloischen Suppressorzellen oder dendritischen Zellen gearbeitet wird.

Einleitung

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Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind nach der Nomenklatur MISEV 2018 ein Sammelbegriff, der verschiedene Subtypen von zellsezernierten membranösen Vesikeln beschreibt, die bei zahlreichen physiologischen und pathologischen Prozessen eine entscheidende Rolle spielen ^1,2. Darüber hinaus sind Elektrofahrzeuge als neuartige Biomarker für verschiedene Krankheiten sowie als Therapeutika und Vehikel für die Verabreichung von Medikamenten vielversprechend. Es ist jedoch schwierig, ihr volles Potenzial auszuschöpfen, da es immer noch viele technische Hindernisse im Zusammenhang mit ihrer Anschaffung^{gibt ....}

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Protokoll

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1. Vorbereitung von Ultrazentrifugenröhrchen

Verwenden Sie sterile Einwegröhrchen. Wenn dies nicht möglich ist, verwenden Sie die Ultrazentrifugenröhrchen wieder, nachdem Sie sie mit einem Reinigungsmittel mit einer sterilen Pasteurpipette oder anderen Einwegapplikatoren gewaschen haben. Denken Sie daran, dass Ultrazentrifugenröhrchen für eine Art von zentrifugiertem Material (Zellkulturüberstand/Serum/Plasma) und Spezies (Mensch/Maus/etc.) bestimmt sein sollten.
Spülen Sie die Ultrazentrifugenröhrchen nach einer Waschmittelwäsche 3x mit entionisiertem, LPS-freiem Wasser aus.
HINWEIS: Verwenden Sie kein minderwertiges Wasser.

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Ergebnisse

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Voraussetzung oder obligatorischer Schritt für dieses Protokoll ist der Ausschluss einer möglichen Endotoxinkontamination aus Reagenzien. Alle verwendeten Reagenzien wie FBS, DMEM, RPMI, PBS und sogar Ultrazentrifugenröhrchen müssen endotoxinfrei sein (<0,005 EU/ml). Es ist nicht einfach, das Regime ohne Endotoxinkontamination aufrechtzuerhalten, da z. B. das Normal-/Standardserum für die Zellkultur eine reichhaltige Quelle sein kann (0,364 EU/ml; siehe Tabelle 1).

Obwohl d.......

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Diskussion

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In den letzten Jahren haben Methoden zur ordnungsgemäßen Isolierung von Elektrofahrzeugen zunehmend an Bedeutung gewonnen, um weitere zuverlässige Analysen zu ermöglichen, z. B. im Zusammenhang mit der Gewinnung zuverlässiger Omics- und Funktionsdaten²⁴. Basierend auf früheren Forschungserfahrungen scheint es, dass nicht nur die Art der Isolationsmethode, sondern auch andere Bedingungen während dieses Verfahrens wichtig sein können. Die Verwendung von EV-abgereichertem FBS wird weithin als Notwend.......

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Offenlegungen

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Die Autoren erklären, dass die Forschung in Abwesenheit von kommerziellen oder finanziellen Beziehungen durchgeführt wurde, die als potenzieller Interessenkonflikt konstruiert werden könnten.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde vom Nationalen Wissenschaftszentrum, Polen, unter der Fördernummer 2019/33/B/NZ5/00647 unterstützt. Wir danken Professor Tomasz Gosiewski und Agnieszka Krawczyk von der Abteilung für Molekulare Medizinische Mikrobiologie des Medizinischen Kollegs der Jagiellonen-Universität für ihre unschätzbare Hilfe beim Nachweis von bakterieller DNA in Elektrofahrzeugen.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
Alix (3A9) Maus mAbs;	Cell Signaling Technology	2171
1250ul Filter Universal Pipettenspitzen, klar, Polypropylen, nicht pyrogen	GoogLab Scientific	GBFT1250-R-NS
BD FACSCanto II Durchflusszytometer	BD Biosciences
CBA Human Th1/Th2 Zytokin-Kit II	BD Biosciences	551809
CD9 (D8O1A) Kaninchen mAb	Zellsignaltechnologie	13174
ChemiDoc Bildgebungssystem	Bio-Rad Laboratories, Inc.
DMEM (Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium)	Corning	10-013-CV
ELX800NB, Universal-Mikroplatten-Reader	BIO-TEK INSTRUMENTS, INC
Fötales Kälberserum	Gibco	16000044
Fötales Kälberserum Südamerika mit extrem niedrigem Endotoxingehalt	Biowest	S1860-500
Gentamicin, 50 mg/ml	PAN – Biotech	P06-13100
Ziege Anti-Maus IgG - HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2004
Ziege Anti-Kaninchen IgG - HRP	Santa Cruz Biotechnology	sc-2005
Immun-Blot PVDF Membran	Bio-Rad Laboratories, Inc.
LPS aus Salmonella abortus equi S-Form (TLRGRADE)	Enzo Life Sciences, Inc.	ALX-581-009-L002
Elektrophoretische Mini-Trans-Blot-Transferzelle	Bio-Rad Laboratories, Inc.
Analyse der Verfolgung von Nanopartikeln	Malvern Instruments Ltd
NuPAGE LDS-Probenpuffer (4X)	Invitrogen	NP0007
NuPAGE Probenreduktionsmittel (10x)	Invitrogen	NP0004
Parafilm	Sigma Aldrich	P7793	transparente Folie
Perfect 100-1000 bp DNA Ladder	EURx	E3141-01
PierceTM Chromogenes Endotoxin Quant Kit	Thermo Scientific	A39552
PP Oak Ridge Röhrchen mit Verschlusskappen	Thermo Scientific	3929, 03613
RPMI 1640	RPMI-1640 (Gibco)	11875093
SimpliAmp Thermocycler	Applied Biosystem	A24811
Sorvall wX+ ULTRA SERIES Zentrifuge mit T-1270 Rotor	Thermo Scientific	75000100
Sub-Cell GT Horizontales Elektrophoresesystem	Bio-Rad Laboratories, Inc.
SuperSignal West Pico PLUS Chemilumineszenz-Substrat	Thermo Scientific	34577
SW480 Zelllinie	American Type Culture Collection (ATCC)
SW480 Zelllinie	American Type Culture Collection (ATCC)
Spritzenvorsatzfilter 0,22 um	TPP	99722
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell	Bio-Rad Laboratories, Inc.	1703940	Transfergerät
Transferpipette, 3,5 mL	SARSTEDT	86.1171.001

17001401162017717039301704401

Referenzen

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Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
Yáñez-Mó, M., et al.

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Schlagwörter

Endotoxin Contamination Differential Centrifugation Nanoparticle Tracking Western Blot LAL Test Monocyte Stimulation CD9 Marker Alix Marker

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