Methodenartikel

Herstellung von 3D-dezellularisierten Matrizen aus fetalen Mausskelettmuskeln für die Zellkultur

DOI:

10.3791/65069

3. März 2023

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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In dieser Arbeit wurde ein Dezellularisierungsprotokoll optimiert, um dezellularisierte Matrices des fetalen Mausskelettmuskels zu erhalten. C2C12-Myoblasten können diese Matrices besiedeln, sich vermehren und differenzieren. Mit diesem In-vitro-Modell kann das Zellverhalten im Kontext von Skelettmuskelerkrankungen wie Muskeldystrophien untersucht werden.

Zusammenfassung

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Die extrazelluläre Matrix (EZM) spielt eine entscheidende Rolle bei der strukturellen Unterstützung von Zellen und der Übertragung von Signalen, die für verschiedene zelluläre Prozesse wichtig sind. Zweidimensionale (2D) Zellkulturmodelle vereinfachen die komplexen Interaktionen zwischen Zellen und der EZM zu sehr, da das Fehlen eines vollständigen dreidimensionalen (3D) Trägers das Zellverhalten verändern kann, so dass sie für das Verständnis von In-vivo-Prozessen nicht ausreichen. Defizite in der EZM-Zusammensetzung und Zell-EZM-Interaktionen tragen wesentlich zu einer Vielzahl unterschiedlicher Erkrankungen bei.

Ein Beispiel ist die LAMA2-kongenitale Muskeldystrophie (LAMA2-CMD), bei der das Fehlen oder die Verringerung der funktionellen Laminine 211 und 221 zu einer schweren Hypotonie führen kann, die bei oder kurz nach der Geburt nachweisbar ist. Frühere Arbeiten mit einem Mausmodell der Krankheit deuten darauf hin, dass sie während der fetalen Myogenese ausbricht. Ziel der vorliegenden Studie war es, ein 3D-In-vitro-Modell zu entwickeln, das es ermöglicht, die Interaktionen zwischen Muskelzellen und der fetalen Muskel-EZM zu untersuchen und die native Mikroumgebung nachzuahmen. Bei diesem Protokoll werden tiefe Rückenmuskeln verwendet, die von E18.5-Mausföten präpariert und mit einem hypotonen Puffer, einem anionischen Detergens und DNase behandelt wurden. Die resultierenden dezellularisierten Matrices (dECMs) behielten alle getesteten EZM-Proteine (Laminin α2, Gesamtlaminine, Fibronektin, Kollagen I und Kollagen IV) im Vergleich zum nativen Gewebe bei.

Wenn C2C12-Myoblasten auf diese dEZMs gesät wurden, drangen sie in die dEZMs ein und besiedelten sie, was ihre Proliferation und Differenzierung unterstützte. Darüber hinaus produzierten die C2C12-Zellen ECM-Proteine, die zum Umbau ihrer Nische innerhalb der dECMs beitrugen. Die Etablierung dieser In-vitro-Plattform bietet einen neuen vielversprechenden Ansatz zur Entschlüsselung der Prozesse, die an der Entstehung von LAMA2-CMD beteiligt sind, und hat das Potenzial, an andere Skelettmuskelerkrankungen angepasst zu werden, bei denen Defizite in der Kommunikation zwischen der EZM und den Skelettmuskelzellen zum Fortschreiten der Krankheit beitragen.

Einleitung

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Die extrazelluläre Matrix (EZM) ist ein Hauptbestandteil von Geweben und stellt deren nicht-zelluläre Komponente dar. Diese dreidimensionale (3D) Struktur bietet nicht nur physikalischen Halt für Zellen, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle bei den biochemischen Prozessen, die an der Entwicklung von Organismen beteiligt sind1. Die Bildung einer gewebespezifischen EZM erfolgt während der Entwicklung durch die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihren Nischen, die durch verschiedene intra- und extrazelluläre Reize beeinflusst werden. Die EZM ist eine hochdynamische Struktur, die chemisch und mechanisch zeitlich-räumlich umgelag....

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Protokoll

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Alle beschriebenen Methoden wurden vom Tierschutzausschuss (ORBEA) der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Lissabon und der Direção Geral de Veterinária (DGAV; Ref. 0421/000/000/2022) genehmigt und entsprechen der europäischen Richtlinie 2010/63/EU.

1. Herstellung von Dezellularisierungspuffern und Reagenzien

Anmerkungen: Alle Lösungen, die während des Dezellularisierungsprotokolls verwendet werden, sollten durch Autoklavieren sterilisiert und bis zu 3 Monate gelagert werden, sofern nicht anders angegeben.

  1. Bereiten Sie 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x PBS) durch Z....

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Ergebnisse

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Das Ziel des Dezellularisierungsprotokolls ist es, dEZMs herzustellen, die der Zusammensetzung von nativem Gewebe sehr ähnlich sind. Um die Wirksamkeit des Dezellularisierungsprozesses zu bestimmen, wurden verschiedene Methoden eingesetzt, darunter die Untersuchung der Gewebemorphologie, die Messung des DNA-Spiegels, die Färbung auf F-Aktin und die Analyse von Schlüsselkomponenten der EZM mittels Immunhistochemie und Western-Blotting-Techniken. Konkret wurden fünf Hauptkomponenten der EZM des Skelettmuskelgewebes analysi.......

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Diskussion

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Die EZM ist ein komplexes Netzwerk von Makromolekülen, das in allen Geweben vorhanden ist und eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Zellverhaltens und der Zellfunktion spielt2. Die EZM fungiert als physikalisches Gerüst für Zellen, an das sie sich anheften können, und liefert Hinweise, die zelluläre Prozesse wie Proliferation, Motilität, Differenzierung und Apoptose aktiv modulieren. Daher ist die ordnungsgemäße Bildung und Aufrechterhaltung der EZM sowohl für die Entwicklung als auch f.......

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Offenlegungen

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde von der Association Française contre les Myopathies (AFM-Téléthon; Vertrags-Nr. 23049), dem MATRIHEALTH-Projekt und der cE3c-Unit-Finanzierung UIDB/00329/2020 finanziert. Wir möchten uns bei unserem Spender Henrique Meirelles bedanken, der sich entschieden hat, das MATRIHEALTH-Projekt zu unterstützen. Diese Arbeit profitierte von den Infrastrukturen der Mikroskopie-Einrichtung der Fakultät für Naturwissenschaften, einem Knotenpunkt der portugiesischen Plattform für BioBildgebung (Referenz PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122), und wir danken Luís Marques für seine Unterstützung bei der Bildaufnahme und -verarbeitung. Abschließend dan....

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
12-Well-Zellkulturplatte, flach, TC, sterilAbdos LabwareP21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochloridMerckD8417
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Precast GelBio-Rad4561093
48 Well Zellkulturplatte, flach, TC, sterilAbdos LabwareP21023
96 Well Zellkulturplatte, flach, TC, sterilAbdos LaborbedarfP21024
Rinderserumalbumin, Fraktion VNZYtechMB04601
BX60 FluoreszenzmikroskopOlympus
Kryostat CM1860 UVLeica
DithiothreitolThermoFisherR0862
DMEM hoher Glukosegehalt mit stabilem Glutamin mit NatriumpyruvatBiowestL0103-500
DNase IPanReac AppliChemA3778
DNeasy Blut & Tissue Kit Qiagen69506
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)Merck108418
Fötales RinderserumBiowestS1560-500
Transferpipette mit feiner SpitzeThermoFisher15387823
ZiegenserumBiowestS2000-100
Hera Guard Flow CabinetHeraeus
Heracell 150 CO2 InkubatorThermo Scientific
HiMark Vorgefärbtes Protein StandardInvitrogen
Pferdeserum, neuseeländischen UrsprungsGibco16050122
HRP-α- Kaninchen IgGabcamab205718
HRP-α- Ratte IgGabcamab205720
HRP-α- Maus IgGabcamab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl GreenSigma-Aldrich67060
MM400 Tissue LyserRetsch
NanoDrop ND-1000 Spektralphotometer ThermoFisher
Paraformaldehyd, 16% w/v aq. soln., methanolfreiAlfa Aesar043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x) GRiSPGTC05.0100
Phalloidin Alexa 488 Thermo Fisher Sci.A12379
Polystyrol Petrischale 60x15mm mit Belüftungsöffnungen (steril)Greiner Bio-One628161
Qubit dsDNA HS KitThermo ScientificQ32851
Qubit&trade 3 FluorometerInvitrogen15387293
S6E Zoom StereomikroskopLeica
NatriumdodecylsulfatMerck11667289001
SuperFrost® Plus AdhäsionsobjektträgerThermo Scientific631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemilumineszenz-SubstratThermo Scientific15626144
TCS SPE KonfokalmikroskopLeica
Tris-(Hidroximetil) Aminometano (Tris-Basis) ≥ 99%VWR Chemicals28811.295
Triton X-100Sigma-AldrichX100-100ML
Trypanblau-Lösung, 0,4%Gibco15250061
Trypsin-EDTA (0,05%) in DPBS (1X)GRiSPGTC02.0100
TWEEN 20 (50%ige Lösung)ThermoFisher3005
WesternBright PVDF-CL Membranrolle (0,22&Mikro; m)AdvanstaL-08024-001
α-Kollagen Iabcamab21286
α-Kollagen IVMilliporeAB756P
α-Kollagen IVSanta Cruz Biotechnologiesc-398655
α-FibronektinSigmaF-3648
α-Laminin α 2 SigmaL-0663
α-MHCD.S.H.B.MF20
α-Maus Alexa 488Molekulare SondenA11017
α-Maus Alexa 568Molekulare SondenA11019
α-pan-LamininSigmaL- 9393
α-Phospho-Histon 3Merk Millipore06-570
α-Kaninchen Alexa 568Molekulare SondenA21069
α-Kaninchen Alexa 488Molekulare SondenA11070
α-Ratte Alexa 488Molekulare SondenA11006

Referenzen

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  1. Mecham, R. P. Overview of extracellular matrix. Current Protocols in Cell Biology. 10, 1-16 (2012).
  2. Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
  3. Lamandé, S. R., Bateman, J. F.

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Schlagwörter

F tales Mausmuskelgewebeextrazellul re MatrixSkelettmuskel ECMMuskelzelldifferenzierungC2C12 MyoblastenLaminin Alpha 2Kollagen IDNase Behandlung

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