Herstellung von 3D-dezellularisierten Matrizen aus fetalen Mausskelettmuskeln für die Zellkultur

Zusammenfassung

In dieser Arbeit wurde ein Dezellularisierungsprotokoll optimiert, um dezellularisierte Matrices des fetalen Mausskelettmuskels zu erhalten. C2C12-Myoblasten können diese Matrices besiedeln, sich vermehren und differenzieren. Mit diesem In-vitro-Modell kann das Zellverhalten im Kontext von Skelettmuskelerkrankungen wie Muskeldystrophien untersucht werden.

Zusammenfassung

Die extrazelluläre Matrix (EZM) spielt eine entscheidende Rolle bei der strukturellen Unterstützung von Zellen und der Übertragung von Signalen, die für verschiedene zelluläre Prozesse wichtig sind. Zweidimensionale (2D) Zellkulturmodelle vereinfachen die komplexen Interaktionen zwischen Zellen und der EZM zu sehr, da das Fehlen eines vollständigen dreidimensionalen (3D) Trägers das Zellverhalten verändern kann, so dass sie für das Verständnis von In-vivo-Prozessen nicht ausreichen. Defizite in der EZM-Zusammensetzung und Zell-EZM-Interaktionen tragen wesentlich zu einer Vielzahl unterschiedlicher Erkrankungen bei.

Ein Beispiel ist die LAMA2-kongenitale Muskeldystrophie (LAMA2-CMD), bei der das Fehlen oder die Verringerung der funktionellen Laminine 211 und 221 zu einer schweren Hypotonie führen kann, die bei oder kurz nach der Geburt nachweisbar ist. Frühere Arbeiten mit einem Mausmodell der Krankheit deuten darauf hin, dass sie während der fetalen Myogenese ausbricht. Ziel der vorliegenden Studie war es, ein 3D-In-vitro-Modell zu entwickeln, das es ermöglicht, die Interaktionen zwischen Muskelzellen und der fetalen Muskel-EZM zu untersuchen und die native Mikroumgebung nachzuahmen. Bei diesem Protokoll werden tiefe Rückenmuskeln verwendet, die von E18.5-Mausföten präpariert und mit einem hypotonen Puffer, einem anionischen Detergens und DNase behandelt wurden. Die resultierenden dezellularisierten Matrices (dECMs) behielten alle getesteten EZM-Proteine (Laminin α2, Gesamtlaminine, Fibronektin, Kollagen I und Kollagen IV) im Vergleich zum nativen Gewebe bei.

Wenn C2C12-Myoblasten auf diese dEZMs gesät wurden, drangen sie in die dEZMs ein und besiedelten sie, was ihre Proliferation und Differenzierung unterstützte. Darüber hinaus produzierten die C2C12-Zellen ECM-Proteine, die zum Umbau ihrer Nische innerhalb der dECMs beitrugen. Die Etablierung dieser In-vitro-Plattform bietet einen neuen vielversprechenden Ansatz zur Entschlüsselung der Prozesse, die an der Entstehung von LAMA2-CMD beteiligt sind, und hat das Potenzial, an andere Skelettmuskelerkrankungen angepasst zu werden, bei denen Defizite in der Kommunikation zwischen der EZM und den Skelettmuskelzellen zum Fortschreiten der Krankheit beitragen.

Einleitung

Die extrazelluläre Matrix (EZM) ist ein Hauptbestandteil von Geweben und stellt deren nicht-zelluläre Komponente dar. Diese dreidimensionale (3D) Struktur bietet nicht nur physikalischen Halt für Zellen, sondern spielt auch eine entscheidende Rolle bei den biochemischen Prozessen, die an der Entwicklung von Organismen beteiligt sind¹. Die Bildung einer gewebespezifischen EZM erfolgt während der Entwicklung durch die komplexen Wechselwirkungen zwischen Zellen und ihren Nischen, die durch verschiedene intra- und extrazelluläre Reize beeinflusst werden. Die EZM ist eine hochdynamische Struktur, die chemisch und mechanisch zeitlich-räumlich umgelag....

Protokoll

Alle beschriebenen Methoden wurden vom Tierschutzausschuss (ORBEA) der Fakultät für Naturwissenschaften der Universität Lissabon und der Direção Geral de Veterinária (DGAV; Ref. 0421/000/000/2022) genehmigt und entsprechen der europäischen Richtlinie 2010/63/EU.

1. Herstellung von Dezellularisierungspuffern und Reagenzien

Anmerkungen: Alle Lösungen, die während des Dezellularisierungsprotokolls verwendet werden, sollten durch Autoklavieren sterilisiert und bis zu 3 Monate gelagert werden, sofern nicht anders angegeben.

1. Bereiten Sie 10x phosphatgepufferte Kochsalzlösung (10x PBS) durch Z....

Ergebnisse

Das Ziel des Dezellularisierungsprotokolls ist es, dEZMs herzustellen, die der Zusammensetzung von nativem Gewebe sehr ähnlich sind. Um die Wirksamkeit des Dezellularisierungsprozesses zu bestimmen, wurden verschiedene Methoden eingesetzt, darunter die Untersuchung der Gewebemorphologie, die Messung des DNA-Spiegels, die Färbung auf F-Aktin und die Analyse von Schlüsselkomponenten der EZM mittels Immunhistochemie und Western-Blotting-Techniken. Konkret wurden fünf Hauptkomponenten der EZM des Skelettmuskelgewebes analysi.......

Diskussion

Die EZM ist ein komplexes Netzwerk von Makromolekülen, das in allen Geweben vorhanden ist und eine entscheidende Rolle bei der Regulierung des Zellverhaltens und der Zellfunktion spielt². Die EZM fungiert als physikalisches Gerüst für Zellen, an das sie sich anheften können, und liefert Hinweise, die zelluläre Prozesse wie Proliferation, Motilität, Differenzierung und Apoptose aktiv modulieren. Daher ist die ordnungsgemäße Bildung und Aufrechterhaltung der EZM sowohl für die Entwicklung als auch f.......

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien

Name	Unternehmen	Katalognummer	Kommentare
12-Well-Zellkulturplatte, flach, TC, steril	Abdos Labware	P21021
4′,6-Diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid	Merck	D8417
4– 20% Mini-PROTEAN TGX Precast Gel	Bio-Rad	4561093
48 Well Zellkulturplatte, flach, TC, steril	Abdos Labware	P21023
96 Well Zellkulturplatte, flach, TC, steril	Abdos Laborbedarf	P21024
Rinderserumalbumin, Fraktion V	NZYtech	MB04601
BX60 Fluoreszenzmikroskop	Olympus
Kryostat CM1860 UV	Leica
Dithiothreitol	ThermoFisher	R0862
DMEM hoher Glukosegehalt mit stabilem Glutamin mit Natriumpyruvat	Biowest	L0103-500
DNase I	PanReac AppliChem	A3778
DNeasy Blut & Tissue Kit	Qiagen	69506
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)	Merck	108418
Fötales Rinderserum	Biowest	S1560-500
Transferpipette mit feiner Spitze	ThermoFisher	15387823
Ziegenserum	Biowest	S2000-100
Hera Guard Flow Cabinet	Heraeus
Heracell 150 CO2 Inkubator	Thermo Scientific
HiMark Vorgefärbtes Protein Standard	Invitrogen
Pferdeserum, neuseeländischen Ursprungs	Gibco	16050122
HRP-α- Kaninchen IgG	abcam	ab205718
HRP-α- Ratte IgG	abcam	ab205720
HRP-α- Maus IgG	abcam	ab205719
ImageJ v. 1.53t
Methyl Green	Sigma-Aldrich	67060
MM400 Tissue Lyser	Retsch
NanoDrop ND-1000 Spektralphotometer	ThermoFisher
Paraformaldehyd, 16% w/v aq. soln., methanolfrei	Alfa Aesar	043368-9M
Penicillin-Streptomycin (100x)	GRiSP	GTC05.0100
Phalloidin Alexa 488	Thermo Fisher Sci.	A12379
Polystyrol Petrischale 60x15mm mit Belüftungsöffnungen (steril)	Greiner Bio-One	628161
Qubit dsDNA HS Kit	Thermo Scientific	Q32851
Qubit&trade 3 Fluorometer	Invitrogen	15387293
S6E Zoom Stereomikroskop	Leica
Natriumdodecylsulfat	Merck	11667289001
SuperFrost® Plus Adhäsionsobjektträger	Thermo Scientific	631-9483
SuperSignal West Pico PLUS Chemilumineszenz-Substrat	Thermo Scientific	15626144
TCS SPE Konfokalmikroskop	Leica
Tris-(Hidroximetil) Aminometano (Tris-Basis) ≥ 99%	VWR Chemicals	28811.295
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100-100ML
Trypanblau-Lösung, 0,4%	Gibco	15250061
Trypsin-EDTA (0,05%) in DPBS (1X)	GRiSP	GTC02.0100
TWEEN 20 (50%ige Lösung)	ThermoFisher	3005
WesternBright PVDF-CL Membranrolle (0,22&Mikro; m)	Advansta	L-08024-001
α-Kollagen I	abcam	ab21286
α-Kollagen IV	Millipore	AB756P
α-Kollagen IV	Santa Cruz Biotechnologie	sc-398655
α-Fibronektin	Sigma	F-3648
α-Laminin α 2	Sigma	L-0663
α-MHC	D.S.H.B.	MF20
α-Maus Alexa 488	Molekulare Sonden	A11017
α-Maus Alexa 568	Molekulare Sonden	A11019
α-pan-Laminin	Sigma	L- 9393
α-Phospho-Histon 3	Merk Millipore	06-570
α-Kaninchen Alexa 568	Molekulare Sonden	A21069
α-Kaninchen Alexa 488	Molekulare Sonden	A11070
α-Ratte Alexa 488	Molekulare Sonden	A11006