Ein geeignetes Tiermodell ist erforderlich, um die pathologischen Mechanismen, die der Aortenklappenstenose (AVS) zugrunde liegen, zu verstehen und die Wirksamkeit therapeutischer Interventionen zu bewerten. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein neues Verfahren zur Entwicklung des AVS-Kaninchenmodells über eine direkte Ballonverletzung in vivo.
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Methodenartikel
Ein Modell der Aortenklappenstenose eines Kaninchens, das durch eine direkte Ballonverletzung induziert wird
* These authors contributed equally
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Tiermodelle entwickeln sich zu einem wichtigen Instrument, um die pathologischen Mechanismen zu verstehen, die der Aortenklappenstenose (AVS) zugrunde liegen, da es keinen Zugang zu zuverlässigen Quellen für erkrankte menschliche Aortenklappen gibt. Unter den verschiedenen Tiermodellen sind AVS-Kaninchenmodelle eines der am häufigsten verwendeten in Großtierstudien. Herkömmliche AVS-Kaninchenmodelle erfordern jedoch eine langfristige Zeit der Nahrungsergänzung und genetischen Manipulation, um eine signifikante Stenose in der Aortenklappe zu induzieren, was ihre Verwendung in experimentellen Studien einschränkt. Um diesen Einschränkungen zu begegnen, wird ein neues AVS-Kaninchenmodell vorgeschlagen, bei dem die Stenose durch eine direkte Ballonverletzung der Aortenklappe induziert wird. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine erfolgreiche Technik zur Induktion von AVS bei neuseeländischen weißen Kaninchen (NZW) mit Schritt-für-Schritt-Verfahren für die Vorbereitung, den chirurgischen Eingriff und die postoperative Versorgung. Dieses einfache und reproduzierbare Modell bietet einen vielversprechenden Ansatz für die Untersuchung der Initiierung und des Fortschreitens von AVS und stellt ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der zugrunde liegenden pathologischen Mechanismen der Krankheit dar.
Einleitung
Es wird zunehmend erkannt, dass die Verwendung geeigneter Tiermodelle zu einem besseren Verständnis der pathologischen Mechanismen beitragen kann, die der Aortenklappenstenose (AVS) zugrunde liegen, da der Zugang zu zuverlässigen Quellen für erkrankte menschliche Aortenklappen, die mit dem Fortschreiten der Aortenklappenstenose (AS) verbunden sind, fehlt. Unter den verschiedenen Tiermodellen zur Untersuchung von AVS sind Kaninchen eines der am häufigsten verwendeten AVS-Modelle für Großtiere, und das AVS-Kaninchenmodell wird entweder durch eine Cholesterin-/Vitamin-D2-Supplementierung oder eine genetische Manipulation induziert 1,2,3,4.
Obwohl Kaninchen-AVS-Modelle einen signifikanten Einblick in die Entwicklung und den Verlauf von AVS gegeben haben, bleibt es immer noch eine Herausforderung, AVS konsistent und reproduzierbar zu induzieren, wie in unseren vorläufigen Experimenten zu sehen war.
Zusätzlich zu diätinduzierten und genetisch anfälligen Tiermodellen wurde ein neues Modell des AVS durch direkte mechanische Verletzung bei Mäusen etabliert 5,6. Das mechanische Verletzungsmodell induziert erfolgreich eine Aortenklappenstenose und stellt ein einfaches und reproduzierbares AVS-Modell in Wildtyp-Mäusen dar. Nach unserem Kenntnisstand gibt es bisher keine Studien, die die Auswirkungen einer mechanischen Verletzung auf die Aortenklappe in Kaninchenmodellen untersucht haben. Somit bietet diese Studie ein neues Verfahren zur Induktion von AVS bei männlichen neuseeländischen weißen Kaninchen durch eine direkte Ballonverletzung der Aortenklappe, die den Zustand einer Aortenklappenklappenstenose genau nachahmen kann. Dieses Protokoll enthält Schritt-für-Schritt-Beschreibungen der Vorbereitung, des chirurgischen Eingriffs und der postoperativen Versorgung, die für die Induktion reproduzierbarer AVS-Kaninchenmodelle nützlich sind.
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Protokoll
Alle Tierversuchsverfahren wurden in Übereinstimmung mit dem Laboratory Animals Welfare Act, dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren und den Richtlinien und Richtlinien für Tierversuche genehmigt und durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am College of Medicine der Katholischen Universität von Korea bereitgestellt wurden (Zulassungsnummer: CUMC-2021-0176-05). In der vorliegenden Studie wurden 3 Monate alte männliche neuseeländische weiße (NZW) Kaninchen mit einem Gewicht von 3,5-4,0 kg verwendet, die unter Standardbedingungen in Einzelkäfigen gehalten wurden. Die Kaninchen erhielten entweder eine normale Diät oder eine mit 0,5 % Cholesterin angereicherte Diät, die mit 50.000 E Vitamin D2 ergänzt wurde (siehe Materialtabelle). Das experimentelle Design und die Analysemethoden für die Induktion des AVS-Kaninchenmodells sind in Abbildung 1 dargestellt.
1. Vorbereitung auf die Operation
- Stellen Sie sicher, dass alle medizinischen und chirurgischen Instrumente (siehe Materialtabelle) zu Beginn der Operation sterilisiert sind.
- Bereiten Sie das Dilatationsballonkatheter-Set vor, indem Sie die folgenden Schritte ausführen.
- Schließen Sie das mit einer Mischung aus Kochsalzlösung und handelsüblichem Kontrastmittel (1:1) gefüllte In-Deflation-Gerät an den Luer-Lock-Teil des Ballonkatheters an (siehe Materialtabelle).
- Füllen Sie den Ballon mit Aufblaslösung und entfernen Sie die Luft aus dem Ballonkatheter.
HINWEIS: Für die vorliegende Studie bestand die Inflationslösung aus 30 % Iodixanol mit 0,9 % Kochsalzlösung (siehe Materialtabelle). - Überprüfen Sie das richtige Aufblasen des Ballons, indem Sie das Ballonlumen mit der Aufblaslösung spülen.
2. Chirurgischer Eingriff bei der Aortenklappenverletzung
- Verabreichen Sie eine intramuskuläre Injektion von Tiletamin und Zolazepam (15 mg/kg) und Xylazin (5 mg/kg) (siehe Materialtabelle), um das Tier zu betäuben.
HINWEIS: Vor der Verabreichung der Anästhesie wurden die Kaninchen mit einer subkutanen Glycopyrrolat-Injektion (0,05 mg/kg) als Anticholinergikum vor der Anästhesie vorbehandelt. Die angemessene Anästhesiestufe wurde durch eine Kombination von Kriterien bestimmt, darunter eine mangelnde Reaktion auf ein Einklemmen der Zehen und eine gleichmäßige Atemfrequenz. - Führen Sie einen 24 G intravenösen (IV) Katheter in die marginale Ohrvene ein und verbinden Sie ein Infusionsset mit heparinisierter Kochsalzlösung (100 E/kg Heparin).
- Verbinden Sie das Kaninchen mit einem Multiparameter-Veterinärmonitor (siehe Materialtabelle), um die Vitalparameter wie das Sauerstoffsättigungssignal (SpO2), die Temperatur und den Blutdruck kontinuierlich zu überwachen.
HINWEIS: Bringen Sie für die SpO 2-Überwachung den SpO2-Sensor an der Zunge des Kaninchens an. Für die Temperaturüberwachung führen Sie die Sonde in das Rektum des Kaninchens ein. Für die Blutdrucküberwachung legen Sie die Manschette auf die Vordergliedmaße. - Legen Sie das Kaninchen in Rückenlage auf einen Operationstisch, der mit einer C-Bogen-Durchleuchtung ausgestattet ist (siehe Materialtabelle), und entfernen Sie die Haare aus dem ventralen Halsbereich mit einer Tierhaarschneidemaschine (Abbildung 2A).
- Sterilisieren Sie den Einschnittbereich mit Jod und decken Sie das Kaninchen mit chirurgischen Handtüchern ab.
- Positionieren Sie das Herz des Hasen in der Mitte des C-Bogen-Bildes.
HINWEIS: Alle Forscher müssen Schutzkleidung mit angebrachten Thermolumineszenzdosimetern (TLDs) tragen, um die Strahlenbelastung während der Durchführung der C-Bogen-geführten Operation zu reduzieren.- Schalten Sie den C-Bogen ein und wählen Sie den Durchleuchtungsmodus für die kardiale Bildgebung.
- Passen Sie die Position des Kaninchens an, um sicherzustellen, dass sich das Herz in der Mitte des Bildfeldes befindet.
- Machen Sie einen Längsschnitt von ca. 3 cm in der Haut des Halses und schneiden Sie mit einer chirurgischen Schere das Faszien- und Fettgewebe ab.
- Legen Sie die linke Arteria carotis communis (LCCA) frei, indem Sie die Muskeln vorsichtig trennen, bis etwa 3-3,5 cm der LCCA freigelegt sind (Abbildung 2B).
- Ligatieren Sie die LCCA mit einer 3-0-Seidennaht (siehe Materialtabelle) oben und am Ende der freiliegenden LCCA, um den Blutfluss zu stoppen.
- Führen Sie einen 22-G-IV-Katheter in den LCCA ein und führen Sie einen Führungsdraht (0,016 Zoll, siehe Materialtabelle) durch den IV-Katheter in die linke Herzkammer (LV) ein, wobei sicherzustellen ist, dass die Spitze des Katheters richtig im Bildgebungsfeld des C-Bogens positioniert ist.
HINWEIS: Lösen Sie beim Einführen des IV-Katheters vorsichtig die Ligaturnaht auf dem Weg nach unten zur Aortenklappe, um das Vorschieben des Katheters zu ermöglichen. - Ziehen Sie den IV-Katheter zurück, lassen Sie den Führungsdraht und legen Sie eine 4-F-Hülle (siehe Materialtabelle) über den Führungsdraht in die LCCA, um den Ballonkatheter einzuführen (Abbildung 2C).
HINWEIS: Nachdem der IV-Katheter durch die Hülle ersetzt wurde, sollte die eingeschlossene Luft aus der Schleusevorrichtung entfernt werden. - Führen Sie den 8-mm-Ballonkatheter vorsichtig über den Führungsdraht in die Aortenklappe unter C-Bogen-Durchleuchtungskontrolle ein (Abbildung 2D).
- Platzieren Sie die Ballonkatheterspitze etwa 1-2 cm distal der Aortenklappe und blasen Sie den Ballon auf, indem Sie die Aufblaslösung mit einem Druckinflator bei 6 atm spülen.
- Schieben Sie den Ballon in den LV-Scheitelpunkt und ziehen Sie ihn zurück in den LV-Auslass. Wiederholen Sie diesen Vorgang fünfmal, und lassen Sie dann die Luft aus dem Ballon ab (Abbildung 2E, F).
- Wiederholen Sie die Schritte 2.8-2.9 dreimal, um eine ausreichende Klappenverletzung sicherzustellen.
- Ziehen Sie den Ballonkatheter und den Führungsdraht zurück. Entfernen Sie langsam die Hülle aus der LCCA und binden Sie die LCCA sofort mit der Naht auf dem Weg nach unten zur Aortenklappe.
- Reinigen Sie den Inzisionsbereich mit Kochsalzlösung, um die Blutgerinnsel zu entfernen, und untersuchen Sie die punktierte Stelle auf arterielle Blutungen.
- Verschließen Sie den Muskel und die Haut mit einer 3-0 nicht resorbierbaren Naht und sterilisieren Sie alle Seiten der Wunde mit Jod.
3. Nachsorge
- Entfernen Sie die Überwachungspflaster und -klammern und halten Sie das Kaninchen in einem Intensiv-Inkubator.
HINWEIS: Nach der Operation wurden die Kaninchen 1 Tag lang in einem Intensiv-Inkubator engmaschig beobachtet und dann in einen Heimkäfig gebracht. - Behandeln Sie postoperative Schmerzen mit 5 mg/kg Tramadol und 3 mg/kg Ketoprofen und verabreichen Sie Antibiotika (4 mg/kg Gentamicin) zweimal täglich über 3 Tage als subkutane Injektion (siehe Materialtabelle).
HINWEIS: Die postoperative Schmerzbehandlung sollte den veterinärmedizinischen und IACUC-Richtlinien entsprechen (z. B. Opioide, NSAID, Lokalanästhetikum oder Kombination). - Füttern Sie 8 Wochen lang eine mit 0,5 % Cholesterin angereicherte Diät mit 50.000 E Vitamin D2 (HC + VitD2).
4. Echokardiographie
- Nach 8 Wochen Ballonverletzung wird das Kaninchen mit dem in Schritt 2.1 beschriebenen Verfahren betäubt.
- Visualisieren Sie die Aortenklappen mit zweidimensionalen transthorakalen Ansichten und zeichnen Sie M-Mode-Bilder in Kurzachsen- und Langachsenansichten auf.
- Legen Sie das Kaninchen in Rückenlage auf einen Echotisch.
- Rasieren Sie den Brustbereich mit einer Haarschneidemaschine und einer Haarentfernungscreme.
- Tragen Sie Ultraschall-Schallkopfgel (siehe Materialtabelle) auf die Brust auf.
- Stellen Sie den Schallkopf ein, um die parasternale Längsachsansicht und die parasternale Kurzachsenansicht der Aortenklappe zu erhalten.
- Verwenden Sie die M-Mode-Bildgebung, um Bilder der Aortenklappe sowohl in der Längs- als auch in der Kurzachsenansicht aufzuzeichnen und die Bilder für eine spätere Analyse zu speichern.
5. Histologische Analyse
- Nach der Echokardiographie wird das Kaninchen durch Verabreichung einer intravenösen Injektion von Kaliumchlorid (KCl, 3 g/20 ml, 1 ml) eingeschläfert.
- Öffnen Sie die Brusthöhle, entnehmen Sie das Herz mit der aufsteigenden Aorta7 und legen Sie es in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auf Eis.
- Tauchen Sie das Herz sofort in eine 4%ige Paraformaldehyd-Lösung (PFA) und betten Sie es in einen Paraffinblock ein (siehe Materialtabelle).
- Schneiden Sie den in Paraffin eingebetteten Herzblock mit einem Mikrotom in 4 μm dicke Abschnitte und färben Sie die Abschnitte mit Masson-Trichrom (MT), Alizarinrot und von Kossa (siehe Materialtabelle), um die Kollagenablagerung bzw. die Klappenverkalkung zu beurteilen 8,9.
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Ergebnisse
Kaninchen-AVS-Modell, induziert durch Aortenklappenverletzung
Um das Kaninchen-AVS-Modell zu induzieren, wurden männliche NZW-Kaninchen mit einem Gewicht von 3,5-4,0 kg für diese Studie verwendet. Gemäß den in Schritt 2 beschriebenen chirurgischen Verfahren (Abbildung 2) wurde das AVS-Modell durch eine Aortenklappenverletzung etabliert, die zu einer mechanischen Aortenklappendegeneration und -verkalkung führte. Die Kontrollgruppe umfasste Kaninchen, die mit einer 0,5 % ch...
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Diskussion
Tierische AVS-Modelle werden häufig verwendet, um die pathologischen Aspekte von AVS zu untersuchen, einschließlich der Initiierung und des Fortschreitens von AVS. Dieses Protokoll führt ein neues AVS-Modell für Kaninchen ein, das durch eine direkte Ballonverletzung der Aortenklappe induziert wird. In dieser Studie zeigte das Aortenklappenverletzungsmodell eine signifikante Verdickung und Verkalkung der Segel. Im Vergleich zum milden AVS-Modell, das durch Nahrungsergänzung induziert wurde, wurde die Aortenklappe im Model...
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Offenlegungen
Die Autoren haben mit dieser Arbeit keine Interessenkonflikte zu erklären.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss der National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt, der von der koreanischen Regierung (MSIT) (Nr. 2020R1A4A3079570), dem Bildungsministerium (Nr. 2021R1I1A1A01051425) und dem Industrial Strategic Technology Development Program (Nr. 20014873) des Ministeriums für Handel, Industrie und Energie der Republik Korea finanziert wird.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 3-0 Seidennaht | AILEE | SK312 | |
| 4% Paraformaldehyd (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Alizarin rot Lösung | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLAU | ASAHI | Führungsdraht | |
| Rückentischabdeckung | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Ballon-Entleerungsgerät | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Veterinärmonitor | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| zertifizierte Kaninchendiät | Purina | 5322 | 4,7 % hydriertes Kokosöl, 0,5 % Cholesterin & 1% Melasse |
| Curadle Smart Inkubator | Autoelex | CS-CV206 | IntensivstationErgocalciferol |
| Sigma-aldrich | E5750 | Vitamin D2 | |
| Fechtner Bindehautzange Titan | WORLD PRECISION Instrument | WP1820 | |
| Pinzette | HEBU | HB203 | |
| Gentamicin | Shin Poong | ||
| Glycopyrrolat | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Normale Kochsalzlösung 500 mL | |
| Hämatoxylin-Lösung | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparin | JW pharmazeutisch | 25.000 U | |
| Infusionsset zum Einmalgebrauch | SWOON MEDICAL | ||
| Jodgrün | pharmazeutisch | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Aufblaslösung (Kontrastmittel) |
| IV Katheter 22 G | BD | ||
| IV-Katheter 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofen | SamChunDang | ||
| Luer-Lok Spritze 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Luer-Lok Spritze 3 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Mikroskop | OLYMPUS | SZ61 | |
| Mikrotom | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT Fleckenset | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Nadelhalter | Solco | 009-1304 | |
| Nadelhalter mit Schloss und Naht | JEUNGDO BIO & PLANT | H-1222-18 | |
| Paraffin | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Kaliumchlorid 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Ideal Hydrophile Hülle | MERIT MEDICAL PID4F11018SS | Hülle 4F | |
| PTA Ballondilatationskatheter | Boston Scientific | H749-3903280208-0 | Ballonkatheter 8,0 mm |
| Rompun | Elanco | Xylaxin | |
| sterile Gaze | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| OP-Handschuhe | Ansell | Ansell | |
| OP-Kleid | Yuhan Kimberly | 90002-02 | |
| OP-Schere | Nopa, Deutschland | AC020/16 | |
| OP-Band | 3M micopore | 1530-1 | |
| Spritze 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Spritze 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Gewebekassette | Scilav Korea | Cas3003 | |
| Schallkopfgel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Ultraschallgerät | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa Färbeset | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac Korea | Tiletamine & Zolazepam |
Referenzen
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Nachdrucke und Genehmigungen
